Test klonogenny: Komórki adherentne

Podsumowanie

Możliwość zastosowania testu klonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest znana od ponad 50 lat. Tutaj pokazujemy ogólną procedurę wykonywania testu klonogennego z komórkami adherentnymi.

Streszczenie

Test klonogenny (lub tworzący kolonie) jest znany od ponad 50 lat; oryginalny artykuł opisujący tę technikę został opublikowany w 1956 roku¹. Oprócz udokumentowania metody, wstępne, przełomowe badanie pozwoliło na opracowanie pierwszej krzywej odpowiedzi na dawkę promieniowania dla komórek ssaków napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim (HeLa) w hodowli¹. Zasadniczo, test klonogenny umożliwia ocenę różnic w żywotności reprodukcyjnej (zdolność komórek do wytwarzania potomstwa; tj. pojedyncza komórka tworzy kolonię 50 lub więcej komórek) między komórkami kontrolnymi nieleczonymi a komórkami, które zostały poddane różnym zabiegom, takim jak narażenie na promieniowanie jonizujące, różne związki chemiczne (np. czynniki cytotoksyczne) lub w innych przypadkach manipulacje genetyczne. Test stał się najszerzej akceptowaną techniką w biologii radiacyjnej i jest szeroko stosowany do oceny wrażliwości na promieniowanie różnych linii komórkowych. Ponadto test klonogenny jest powszechnie stosowany do monitorowania skuteczności związków modyfikujących promieniowanie oraz do określania wpływu czynników cytotoksycznych i innych terapii przeciwnowotworowych na zdolność tworzenia kolonii w różnych liniach komórkowych. Typowy eksperyment klonogennego przeżycia z wykorzystaniem przylegających linii komórkowych obejmuje trzy odrębne elementy: 1) traktowanie monowarstwy komórki w kolbach do hodowli tkankowych, 2) przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek i posiew odpowiedniej liczby komórek na szalkach Petriego oraz 3) utrwalanie i barwienie kolonii po odpowiednim okresie inkubacji, który może wynosić od 1 do 3 tygodni, w zależności od linii komórkowej. W tym miejscu przedstawiono ogólną procedurę wykonywania testu klonogennego z adherentnymi liniami komórkowymi z użyciem unieśmiertelnionej ludzkiej linii komórkowej keratynocytów (FEP-1811)². Naszym celem jest również opisanie wspólnych cech testów klonogennych, w tym obliczenie wydajności posiewu i frakcji przeżycia po ekspozycji komórek na promieniowanie, a także zilustrowanie modyfikacji odpowiedzi na promieniowanie z wykorzystaniem naturalnego preparatu przeciwutleniającego.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i konfiguracja eksperymentalna

1. Ludzkie keratynocyty są utrzymywane w postaci monowarstw w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75^cm2 zawierających 15 ml pożywki keratynocyt-SFM (K-SFM) (GIBCO, pożywka wolna od surowicy) uzupełnionej L-glutaminą (2 mM), naskórkowym czynnikiem wzrostu (5 ng / ml), ekstraktem z przysadki bydlęcej (40 μg / ml) i 20 mg / ml gentamycyny. Komórki hoduje się w wilgotnym środowisku o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37°C.
2. Komórki wysiewa się do kolb do hodowli tkankowych o wymiarach 12 x 25^cm2 zawierających 5 ml pożywki K-SFM.

Zawiesiny jednokomórkowe są przygotowywane przez trypsynizację. Komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i inkubuje w 0,05% roztworze trypsyny / EDTA przez 5-10 minut. Kiedy komórki zaczynają się zaokrąglać i ~ 30% są odłączone, dodaje się 3 objętości zmodyfikowanej pożywki orła Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w celu zneutralizowania trypsyny. Komórki są odłączane przez pipetowanie w górę i w dół (20 razy). Komórki są liczone za pomocą hemocytometru.

Odpowiednie numery komórek są umieszczane zgodnie z czasem podwojenia linii komórkowej (około 20 godzin dla ludzkich keratynocytów FEP-1811). Celem jest osiągnięcie ~90% konfluencji (~10⁶ komórek na kolbę) w dniu eksperymentu.

Eksperyment składający się z 12 kolb jest optymalny dla pojedynczego testu klonogennego (sześć nienapromieniowanych kontrolnych i sześć napromieniowanych kolb), który może być zakończony w ciągu około czterech godzin.

2. Leczenie i napromienianie

1. Przez odpowiedni czas należy traktować komórki odpowiednim związkiem modyfikującym promieniowanie i wystawiać je na działanie promieniowania jonizującego, zarówno γ, jak i promieniowania rentgenowskiego.

Zazwyczaj sześć kolb służy jako kontrola skuteczności posiewu (nieleczona) i kontroli tylko leków. Pozostałe sześć kolb jest napromieniowanych.

W tym przykładzie ludzkie keratynocyty są traktowane różnymi stężeniami Cinnulin PF (CPF; Integrity Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, Stany Zjednoczone; reprezentatywne dane dla 20 μg/ml przedstawiono poniżej), rozpuszczalny w wodzie naturalny preparat przeciwutleniający, przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Ogniwa są naświetlane 4 Gy przy użyciu źródła ¹³⁷Cs (promiennik Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Kanada; 1,6 gy/min).

3. Poszycie

1. Po poddaniu działaniu substancji uzyskuje się zawiesiny pojedynczych komórek, jak opisano wcześniej.
2. Liczba komórek w każdej próbce jest dokładnie liczona za pomocą hemocytometru i rozcieńczana w taki sposób, aby odpowiednia liczba komórek została rozsiana na płytki Petriego (pięć powtórzeń każdej na szalkach 15 mm).
   Wydajność posiewu i / lub frakcję przeżywającą należy przewidzieć przy podejmowaniu decyzji o liczbie komórek do wysiewu na płytkę. Celem jest osiągnięcie zasięgu od 20 do 150 kolonii.

Szalki Petriego są umieszczane w nawilżonym plastikowym pudełku do klonowania i inkubowane w środowisku 5% CO₂ w temperaturze 37°C w celu utworzenia kolonii.

Czas inkubacji dla powstania kolonii waha się od 1 do 3 tygodni dla różnych linii komórkowych; przyjmuje się, że czas ten musi być równy co najmniej sześciu podziałom komórkowym. W tym przykładzie szalki kontrolne dla ludzkich keratynocytów potrzebują ośmiu dni, aby uformować wystarczająco duże klony składające się z 50 lub więcej komórek.

4. Naprawianie i barwienie kolonii

Wykonaj następujące kroki w dygestorium.

1. Delikatnie usuń pożywkę z każdej z płytek przez aspirację.
2. Umyj każdą płytkę 5 ml 0,9% soli fizjologicznej.
3. Utrwal kolonie 5 ml 10% neutralnego buforowanego roztworu formaliny przez 15-30 minut.
4. Zabarwić 5 ml 0,01% (w/v) fioletu krystalicznego w dH₂O przez 30-60 minut.
5. Nadmiar fioletu krystalicznego zmyć dH₂O i pozostawić naczynia do wyschnięcia.

5. Liczenie kolonii

Mikroskop stereoskopowy

1. Kolonie zawierające więcej niż 50 pojedynczych komórek są liczone za pomocą stereomikroskopu.

Cyfrowe obrazowanie i liczenie za pomocą oprogramowania do obrazowania

1. Cyfrowe obrazy kolonii uzyskuje się za pomocą aparatu fotograficznego lub urządzenia skanującego
2. Kolonie są liczone przy użyciu pakietów oprogramowania do analizy obrazowania, jak opisano poniżej.

Zliczanie komórek za pomocą ImageJ (Fiji Version 1.44a)

1. Otwórz plik obrazu na Fidżi, przejdź do Plik -> Otwórz.
2. W razie potrzeby przekonwertuj obraz do formatu 8-bitowego, przejdź do Obraz -> Dostosuj...-> Próg.
3. Dostosuj próg, aby zmniejszyć poziomy niespecyficznego tła, tak aby wykrywane były tylko kolonie.
4. Policz kolonie za pomocą następujących elementów: przejdź do Process -> Binary -> Find maxima.

Dla tego formatu obrazu, tolerancja szumów może być ustawiona na 0. Upewnij się, że opcja jasnego tła jest zaznaczona i wyświetl podgląd wykrytych maksimów, aby sprawdzić, czy wszystkie kolonie komórek zostały poprawnie zarejestrowane.

Dyskusja

W tym przykładzie ludzkie keratynocyty FEP-1811 traktowano różnymi stężeniami do 100 μg/ml CPF; dane przedstawiono dla 20 μg/ml CPF przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po zabiegu komórki napromieniano 4 Gy przy użyciu źródła ¹³⁷Cs (promiennik Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Kanada; 1,6 gy/min). W przypadku grupy kontrolnej nieleczonej i leczonej wyłącznie lekami 100 komórek zostało posianych na każdej szalce Petriego, a 1000 komórek na szalkę zostało posianych dla napromieniowanych próbek....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka wolna od keratynocytów w surowicy	Pożywka wzrostowa	Invitrogen	17005042	Uzupełniona 2mM L-glutaminą, 20μ g/ml gentamycyny, naskórkowego czynnika wzrostu, ekstraktu z przysadki bydlęcej.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0,05% trypsyna / EDTA do oddzielania przylegających komórek; 10 x zapas rozcieńczony w PBS bez Ca2+/Mg2+.
Dulbecco' s zmodyfikowane niezbędne podłoże	Pożywka wzrostowa	Invitrogen	11885-084	Uzupełnione 10% FBS i 20μ g/ml gentamycyny; stosowany do neutralizacji trypsyny/EDTA.
0,09%	roztwór			fizjologicznej Służy do mycia kolonii.
10% neutralny buforowany roztwór formaliny	Roztwór	Sigma-Aldrich	HT501128	~ 4% formaldehydu; stosowany do utrwalania kolonii.
Fiolet krystaliczny	w proszku	SPI Supplies	02577-MB	0,01% roztwór fioletu krystalicznego, przygotowany w dH2O, używany do barwienia kolonii.
Naświetlacz Gammacell 1000 elite	Nordion International Inc.
szalki Petriego	60 x 15 mm	, Falcon BD	353002
Hemocytometr		Hawksley; Sprzęt medyczny i laboratoryjny	AC1000
Pudełko				Plastikowe pudełko z otworami wybitymi po przeciwnych stronach pokrywy; do przechowywania szalek Petriego podczas długotrwałej inkubacji w celu utworzenia kolonii.
Mikroskop stereoskopowy	Typ 102	Instrumenty		Służy do liczenia kolonii składających się z > 50 komórek.