Test klonogenny: komórki adherentne

Podsumowanie

Zastosowanie testu kolonogennego do oceny żywotności reprodukcyjnej jest uznane od ponad 50 lat. W niniejszym materiale przedstawiamy ogólną procedurę przeprowadzania testu kolonogennego z wykorzystaniem komórek adherentnych.

Streszczenie

Test klonogenny (lub test tworzenia kolonii) został opracowany ponad 50 lat temu; oryginalna publikacja opisująca tę technikę ukazała się w 1956 roku¹. Poza udokumentowaniem metody, to przełomowe badanie pozwoliło na wyznaczenie pierwszej krzywej odpowiedzi na dawkę promieniowania dla komórek ssaczych (HeLa) w kulturze, naświetlanych promieniami rentgenowskimi¹. W zasadzie test klonogenny umożliwia ocenę różnic w żywotności reprodukcyjnej (zdolności komórek do wytwarzania potomstwa; tzn. zdolności pojedynczej komórki do utworzenia kolonii liczącej 50 lub więcej komórek) pomiędzy niepoddanymi działaniu kontrolnymi komórkami a komórkami, które zostały poddane różnym zabiegom, takim jak ekspozycja na promieniowanie jonizujące, działanie różnych związków chemicznych (np. czynników cytotoksycznych) lub w innych przypadkach manipulacje genetyczne. Test ten stał się najszerzej akceptowaną techniką w radiobiologii i jest powszechnie stosowany do oceny radiowrażliwości różnych linii komórkowych. Ponadto test klonogenny jest powszechnie wykorzystywany do monitorowania skuteczności związków modyfikujących odpowiedź na promieniowanie oraz do określania wpływu czynników cytotoksycznych i innych leków przeciwnowotworowych na zdolność do tworzenia kolonii w różnych liniach komórkowych. Typowy eksperyment przeżywalności klonogennej z użyciem adherentnych linii komórkowych składa się z trzech odrębnych etapów: 1) traktowania monowarstwy komórek w kolbach do hodowli tkankowych, 2) przygotowania zawiesin pojedynczych komórek i wysiewu odpowiedniej liczby komórek na szalki Petriego oraz 3) utrwalania i barwienia kolonii po odpowiednim okresie inkubacji, który w zależności od linii komórkowej może trwać od 1 do 3 tygodni. W niniejszej pracy prezentujemy ogólną procedurę przeprowadzania testu klonogennego z adherentnymi liniami komórkowymi przy użyciu unieśmiertelnionej linii komórek keratynocytów ludzkich (FEP-1811)². Naszym celem jest również opisanie wspólnych cech testów klonogennych, w tym obliczania wydajności wysiewu i frakcji przeżywalności po narażeniu komórek na promieniowanie, a także zilustrowanie modyfikacji odpowiedzi na promieniowanie z wykorzystaniem naturalnego preparatu antyoksydacyjnego.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i przygotowanie eksperymentalne

1. Ludzkie keratynocyty hoduje się jako monowarstwy w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 75 cm² zawierających 15 mL pożywki keratinocyte-SFM (K-SFM) (GIBCO, pożywka bezsurowicza) uzupełnionej o L-glutaminę (2 mM), czynnik wzrostu naskórka (5 ng/ mL), ekstrakt z przysadki bydlęcej (40 μg/ mL) oraz gentaomycynę (20 mg/ mL). Komórki hoduje się w warunkach zwiększonej wilgotności w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C.
2. Komórki wysiewa się do 12 kolb do hodowli tkankowej o powierzchni 25 cm² zawierających 5 mL pożywki K-SFM.

Zawiesiny pojedynczych komórek przygotowuje się poprzez trypsynizację. Komórki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i inkubuje z 0,05% roztworem trypsyny / EDTA przez 5-10 minut. Gdy komórki zaczną stawać się okrągłe, a około 30% z nich oddzieli się od podłoża, dodaje się 3 objętości medium Eagle'a modyfikowanego przez Dulbecco zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, aby zneutralizować trypsynę. Komórki oddziela się poprzez pipetowanie w górę i w dół (20 razy). Liczbę komórek wyznacza się przy użyciu hemocytometru.

Odpowiednią liczbę komórek wysiewa się zgodnie z czasem podwojenia danej linii komórkowej (około 20 godzin dla ludzkich keratynocytów FEP-1811). Celem jest uzyskanie ~90% konfluencji (~10⁶ komórek na kolbę) w dniu przeprowadzenia eksperymentu.

Eksperyment obejmujący 12 kolb jest optymalny dla pojedynczego testu klonogennego (sześć kolb kontrolnych nienapromieniowanych i sześć kolb napromieniowanych), który można przeprowadzić w ciągu około czterech godzin.

2. Traktowanie i naświetlanie

1. Traktuj komórki przez odpowiedni czas odpowiednim związkiem modyfikującym działanie promieniowania, a następnie poddaj je działaniu promieniowania jonizującego: promieniowania γ lub promieni rentgenowskich.

Zazwyczaj sześć kolb służy jako kontrole wydajności wysiewu (nieleczone) oraz kontrole z samym lekiem. Pozostałe sześć kolb poddawanych jest napromieniowaniu.

W tym przykładzie ludzkie keratynocyty poddano działaniu różnych stężeń Cinnulin PF (CPF; Integrity Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, US; poniżej przedstawiono reprezentatywne dane dla 20 μg/mL), rozpuszczalnej w wodzie naturalnej formulacji przeciwutleniającej, przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Komórki naświetlono dawką 4 Gy przy użyciu źródła ¹³⁷Cs (naświetlacz Gammacell 1000 Elite; Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy/min).

3. Wysiewanie

1. Po zakończeniu zabiegu uzyskuje się zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z wcześniejszym opisem.
2. Liczbę komórek w każdej próbce należy starannie odliczyć za pomocą hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę tak, aby do szalek Petriego wysiać odpowiednią liczbę komórek (pięć powtórzeń dla każdej próbki w szalkach 15 mm).
   Przy określaniu liczby komórek do wysiania na płytkę należy wziąć pod uwagę przewidywaną wydajność wysiewu i/lub frakcję przeżycia. Celem jest uzyskanie liczby kolonii w przedziale od 20 do 150.

Szalki Petri umieszcza się w plastikowym, nawilżonym pudełku do klonowania i inkubuje w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C w celu formowania kolonii.

Czas inkubacji niezbędny do formowania kolonii wynosi od 1 do 3 tygodni w zależności od linii komórkowej; przyjmuje się, że czas ten musi odpowiadać co najmniej sześciu podziałom komórkowym. W tym przykładzie szalki kontrolne dla ludzkich keratynocytów wymagają ośmiu dni, aby utworzyły dostatecznie duże klony składające się z 50 lub więcej komórek.

4. Fixowanie i barwienie kolonii

Następujące kroki należy wykonać w dygestorium.

1. Ostrożnie usuń pożywkę z każdej z płytek za pomocą aspiratora.
2. Przemyj każdą płytkę 5 mL 0,9% soli fizjologicznej.
3. Utrwal kolonie, stosując 5 mL 10% neutralnego buforowanego formaliny przez 15-30 minut.
4. Barwi przez 30-60 minut, używając 5 mL 0,01% (w/v) fioletu krystalicznego w dH₂O.
5. Przemyj nadmiar fioletu krystalicznego dH₂O i pozostaw płytki do wyschnięcia.

5. Liczenie kolonii

Stereomikroskop

1. Kolonie zawierające więcej niż 50 pojedynczych komórek są zliczane przy użyciu stereomikroskopu.

Obrazowanie cyfrowe i zliczanie przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu

1. Cyfrowe obrazy kolonii pozyskuje się za pomocą kamery lub skanera
2. Kolonie są liczone przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, zgodnie z poniższym opisem.

Liczenie komórek przy użyciu programu ImageJ (Fiji Wersja 1.44a)

1. Otwórz plik obrazu w programie Fiji, wybierając File -> Open.
2. W razie potrzeby przekonwertuj obraz na format 8-bitowy, przechodząc do Image -> Adjust...-> Threshold.
3. Dostosuj próg (threshold), aby zredukować poziom nieswoistego tła, tak aby wykryte zostały tylko kolonie.
4. Policz kolonie w następujący sposób: przejdź do Process -> Binary -> Find maxima.

W przypadku tego formatu obrazu tolerancję szumu można ustawić na 0. Należy upewnić się, że zaznaczono opcję jasnego tła, a następnie wyświetlić podgląd wykrytych maksimów, aby sprawdzić, czy wszystkie kolonie komórek zostały prawidłowo zarejestrowane.

Dyskusja

W tym przykładzie ludzkie keratynocyty FEP-181 poddano działaniu różnych stężeń CPF do 100 μg/mL; dane przedstawiono dla stężenia 20 μg/mL CPF przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Po zakończeniu inkubacji komórki napromieniowano dawką 4 Gy przy użyciu źródła ¹³⁷Cs (naświetlacz Gammacell 10 Elite; Nordion International, ON, Kanada; 1,6 Gy/min). W przypadku kontroli nieleczonej oraz prób tylko z lekiem, w każdej szalce Petriego wysiano 10 komórek, natomiast dla próbek napromieniowanych wysiano 10 komórek na szal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezsierwatkowe pożywka dla keratynocytów	Pożywka wzrostowa	Invitrogen	17005042	Uzupełniona o 2mM L-glutaminy, 20μg/ml gentamycyny, czynnik wzrostu naskórka i ekstrakt z przysadki bydlęcej.
Trypsyna-EDTA		Invitrogen	15400-054	0,05% trypsyny / EDTA do odrywania komórek adherentnych; roztwór stok 10x rozcieńczony w PBS bez Ca2+/Mg2+.
Modyfikowana pożywka podstawowa Dulbecco’s	Pożywka wzrostowa	Invitrogen	11885-084	Uzupełniona o 10% FBS i 20μg/ml gentamycyny; stosowana do neutralizacji trypsyny/EDTA.
0,09% roztwór soli fizjologicznej	Roztwór			Stosowany do przemywania kolonii.
10% neutralny buforowany roztwór formaliny	Roztwór	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehydu; stosowany do fiksacji kolonii.
Fiolet krystaliczny	Proszek	SPI Supplies	02577-MB	0,01% roztwór fioletu krystalicznego, przygotowany w dH2O, stosowany do barwienia kolonii.
Naświetlacz Gammacell 1000 elite		Nordion International Inc.
Szalki Petriego	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Hemocytometr		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Pojemnik do klonowania				Plastikowy pojemnik z otworami w przeciwległych stronach pokrywy; do przechowywania szalek Petriego podczas długotrwałej inkubacji w celu tworzenia kolonii.
Stereomikroskop	Typ 102	Nikon Instruments		Stosowany do zliczania kolonii składających się z >50 komórek.