Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

23K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2574

⸱

28 marca 2011

 , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywowym. W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości, stosując metodę rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym (RCT).

Streszczenie

Rekonstrukcja za pomocą elektronowej mikroskopii pojedynczych cząsteczek (EM) stała się w ostatnim czasie popularnym narzędziem do pozyskiwania trójwymiarowych (3D) struktur dużych kompleksów makromolekularnych. W porównaniu z krystalografią rentgenowską wykazuje ona pewne unikalne zalety. Po pierwsze, rekonstrukcja EM pojedynczych cząsteczek nie wymaga krystalizacji próbki białka, co w krystalografii rentgenowskiej stanowi wąskie gardło, szczególnie w przypadku dużych kompleksów makromolekularnych. Po drugie, nie wymaga ona dużych ilości próbek białek. W przeciwieństwie do miligramów białka niezbędnych do krystalizacji, rekonstrukcja EM pojedynczych cząsteczek, przy zastosowaniu metody EM z barwieniem negatywowym, wymaga jedynie kilku mikrolitrów roztworu białka o stężeniach nanomolarnych. Jednakże, poza nielicznymi zgromadzeniami makromolekularnymi o wysokiej symetrii, metoda EM pojedynczych cząsteczek jest ograniczona do stosunkowo niskiej rozdzielczości (niższej niż rozdzielczość 1 nm) dla wielu preparatów, zwłaszcza tych pozbawionych symetrii. Technika ta jest również ograniczona przez rozmiar badanych cząsteczek, wynoszący zazwyczaj 100 kDa dla preparatów barwionych negatywowo i 300 kDa dla preparatów mrożonych w stanie uwodnionym.

W przypadku nowej próbki o nieznanej strukturze zazwyczaj stosujemy roztwór ciężkiego metalu do osadzenia cząsteczek metodą barwienia negatywowego. Następnie preparat jest badany w transmisyjnym mikroskopie elektronowym w celu wykonania dwuwymiarowych (2D) mikrografii cząsteczek. W idealnym przypadku cząsteczki białek mają jednorodną strukturę 3D, ale wykazują różne orientacje na mikrografiach. Mikrografie te są digitalizowane i przetwarzane komputerowo jako „pojedyncze cząstki”. Przy użyciu technik dopasowania i klasyfikacji dwuwymiarowej, jednorodne cząsteczki w tych samych rzutach są grupowane w klasy. Ich uśrednienie wzmacnia sygnał 2D kształtów cząsteczek. Po przypisaniu cząstkom odpowiedniej orientacji względnej (kąty Eulera) możliwe będzie zrekonstruowanie dwuwymiarowych obrazów cząstek w trójwymiarową wirtualną objętość.

W trójwymiarowej rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek kluczowym krokiem jest prawidłowe przypisanie właściwej orientacji każdej pojedynczej cząsteczki. Istnieje kilka metod przypisywania widoku dla każdej cząsteczki, w tym rekonstrukcja kątowa1 oraz metoda losowego nachylenia stożkowego (RCT)2. W niniejszym protokole opisujemy naszą praktykę uzyskiwania rekonstrukcji 3D kompleksu egzosomu drożdżowego przy użyciu EM z barwieniem negatywowym oraz metody RCT. Należy zaznaczyć, że nasz protokół mikroskopii elektronowej i przetwarzania obrazu opiera się na podstawowej zasadzie RCT, ale nie jest jedynym sposobem realizacji tej metody. Najpierw opisujemy, jak zatopić próbkę białka w warstwie formatu uranylowego o grubości porównywalnej z rozmiarem białka, używając dziurawatej siatki węglowej pokrytej warstwą ciągłej cienkiej folii węglowej. Następnie preparat wprowadza się do transmisyjnego mikroskopu elektronowego w celu zebrania par mikrografii niepochylonych (0 stopni) i pochylonych (55 stopni), które zostaną później wykorzystane do przetwarzania i uzyskania wstępnego modelu 3D egzosomu drożdżowego. W tym celu przeprowadzamy RCT, a następnie udoskonalamy wstępny model 3D, stosując metodę dopasowania projekcji (projection matching refinement)3.

Protokół

1. Zasada metody losowego nachylenia stożkowego

  1. Zasada metody losowego nachylenia stożkowego (RCT) wymaga wykonania pary mikrografii tego samego obszaru preparatu wewnątrz mikroskopu elektronowego. Jedno zdjęcie wykonuje się w pozycji bez nachylenia (Rysunek 1A), a drugie przy nachyleniu preparatu pod kątem od 50 do 70 stopni (w naszym przypadku stosujemy 55 stopni). (Rysunek 1B)
  2. Za pomocą komputera zdigitalizowana para mikrografii jest zestawiana obok siebie, a następnie wybierane są obrazy tych samych cząsteczek. (Rysunek 1C)
  3. W współrzędnych trójwymiarowych obrazy cząsteczek bez nachylenia i ich nachylonych odpowiedników są korelowane ze sobą poprzez kierunek osi nachylenia oraz kąt nachylenia. (Rysunek 1D)
  4. Wyrównanie obrazów cząsteczek bez nachylenia pozwala przypisać obrazy nachylonych cząsteczek do ich odpowiadających pozycji azymutalnych. (Rysunek 1E)
  5. Wykorzystując wiele obrazów nachylonych cząsteczek wypełniających przestrzeń azymutalne, można zrekonstruować trójwymiarową strukturę cząsteczki przy użyciu algorytmu projekcji wstecznej. (Rysunek 1F)
    Proces równowagi statycznej; ΣFx=0; schemat ilustrujący rozkład cząstek i analizę ruchu.
    Rysunek 1. Ilustracja zasady rekonstrukcji RCT.

2. Przygotowanie siatek z dziurawego węgla pokrytych cienką warstwą węgla

Uzasadnienie: W celu przygotowania próbki białka do rekonstrukcji z przypadkowymi nachyleniami stożkowymi stosujemy metodę barwienia negatywowego. Aby zapobiec nadmiernemu spłaszczeniu makrocząsteczek podczas suszenia, staramy się zatopić cząsteczki białek w głębokim barwniku o grubości zbliżonej do wymiarów białek4. Ogólnie do przygotowywania preparatów barwionych negatywowo stosuje się ciągłą warstwę węgla. W przypadku takiego węgla trudno jest jednak kontrolować grubość barwnika wokół cząsteczek białek. Dlatego do przygotowania preparatów barwionych negatywowo używamy własnych siatek z węglem dziurkowanym, pokrytych cienką warstwą folii węglowej (grubość ~5 nm). Małe wgłębienia powstałe w miejscach otworów pozwalają na zatrzymanie roztworu białka oraz roztworu barwnika na siatce, co znacznie ułatwia zatopienie białka w optymalnej grubości barwnika. Ponadto cienka warstwa węgla nad otworem znacznie redukuje szum tła.

  1. Przygotować 0,5% roztwór Formvaru. W dygestorium, do szklanego zlewki o pojemności 100 mL, dodać 0,45 g żywicy poliwinyloformalowej oraz 90 mL chloroformu. Zlewkę przykryć folią aluminiową i użyć małego mieszadła magnetycznego, aby pomóc w rozpuszczeniu żywicy formalnej na mieszadle magnetycznym. Rozpuszczenie żywicy zajmuje około 15 minut.
  2. Podczas rozpuszczania Formvaru, oczyścić szkiełka mikroskopowe w metanolu i wytrzeć do sucha za pomocą chusteczek Kimwipes.
  3. Po całkowitym rozpuszczeniu żywicy Formvar w chloroformie, dodać na powierzchnię roztworu 1 mL 50% glicerolu. Regulacja objętości dodanego glicerolu wpływa na gęstość otworów w węglu dziurkowanym. Zanurzyć końcówkę sonikatora w roztworze na głębokość około 1 cala i przy maksymalnej mocy sonikować przez 1 min, aby stworzyć emulsję kropel glicerolu w roztworze Formvaru. Po tym kroku roztwór staje się mętny. Dłuższa sonikacja powoduje powstanie mniejszych otworów w węglu dziurkowanym.
  4. Natychmiast po sonikacji zanurzyć oczyszczone szkiełka pionowo w emulsji na 1 sekundę, wyjąć je i osuszyć spód szkiełek papierem filtracyjnym, aby utworzyć cienką plastikową błonę na ich powierzchni. Po odparowaniu chloroformu sprawdzić gęstość i wielkość otworów w błonie pod mikroskopem świetlnym. Dostosować warunki przygotowania zgodnie z potrzebami. Przy opisanych tutaj warunkach zazwyczaj otrzymujemy otwory o średnicy 3~4 $\mu$m oraz 10~20 otworów w każdym kwadracie siatki o oczku 400 mesh.
  5. Po wyschnięciu szkiełek odciąć krawędź plastikowej błony na powierzchni szkiełka. Wypłynąć błonę na powierzchnię wody destylowanej. Cienką błonę na powierzchni wody można zaobserwować pod kątem ostrym przeciwko odbiciu światła. Kłaść kolejno miedziane siatki 400-mesh na błonie, tak aby gładka powierzchnia siatek była skierowana w dół.
  6. Podnieść plastikową błonę z siatkami za pomocą kawałka papieru. Odwrócić papier i pozostawić do wyschnięcia w szalce Petriego. Namoczyć papier w metanolu, aby usunąć pozostały glicerol z otworów, a następnie pozostawić papier do wyschnięcia na powietrzu.
  7. Pokryć siatki warstwą węgla o grubości ~20 nm w parowniku węglowym. Grubość można określić na podstawie szarości koloru węgla.
  8. Namoczyć siatki z węglem w chloroformie przez pół godziny, aby usunąć Formvar. Po wyschnięciu siatek otrzymujemy własnoręcznie wykonane siatki z węglem dziurkowanym.
  9. Naparować cienką warstwę węgla o grubości około 5 nm na świeżo łupaną powierzchnię miki.
  10. Ostrożnie umieścić siatki z węglem dziurkowanym pod wodą destylowaną. Wypłynąć cienki węgiel z powierzchni miki na powierzchnię wody i powoli osadzić go na siatkach z węglem dziurkowanym. Wysuszyć siatki w dygestorium.

3. Barwienie negatywne kompleksu egzosomu

Uzasadnienie: Istnieje całkiem sporo roztworów barwników do metali ciężkich, które można stosować w negatywnym barwieniu do EM, w tym octan uranylu, mrówczan uranylu, kwas fosfotungstowy, molibdan amonu i inne. Różne roztwory barwników posiadają odmienne, unikalne właściwości. Na przykład octan uranylu zapewnia wysoki kontrast cząsteczek, ale może powodować precypitację kompleksów białkowych wrażliwych na środowisko kwasowe. W przypadku takich próbek dobrym roztworem barwiącym może być kwas fosfotungstowy o neutralnym pH. Wybraliśmy nasycony roztwór mrówczanu uranylu (UF) ze względu na jego drobną ziarnistość i wysoką zdolność penetracji cząsteczek.

  1. Gotuj wodę destylowaną przez 1 min. Powoli schłodź ją do temperatury pokojowej. Krok ten służy usunięciu rozpuszczonego tlenu z wody.
  2. Przygotuj świeży 2% roztwór formatu uranylu (UF). W probówce o pojemności 1,5 mL zmieszaj 1 mL wody i 20 mg UF. Mieszaj na wortexie przez 10 min.
  3. Dostosuj wartość pH do 5,0, dodając 2 µL 10 M wodorotlenku potasu. Wymieszaj natychmiast. Kolor roztworu powinien stać się bardziej żółty. pH roztworu nie powinno być zbyt wysokie, w przeciwnym razie barwnik ulegnie wytrąceniu.
  4. Umieść probówkę na wortexerze na kolejne 10 min.
  5. Wiruj roztwór w wirówce laboratoryjnej z maksymalną prędkością przez 10 min.
  6. Przefiltruj roztwór przez membranę PVDF o porach 0,2 µm. Jest to świeży roztwór UF. Osłoń probówkę z roztworem kawałkiem folii aluminiowej, aby chronić go przed światłem. Roztwór należy zużyć tego samego dnia.
  7. Poddaj siatkę z cienką warstwą węgla na węglu dziurkowanym działaniu wyładowań koronowych (glow discharge) przy użyciu aparatu do wyładowań koronowych przez 30 sekund przy natężeniu prądu 25 mA.
  8. Połóż kawałek czystego parafilmu na blacie. Nanieś na parafilm 3 krople roztworu barwiącego UF po 50 µL każda.
  9. Rozcieńcz kompleks egzosomów do stężenia 50 ~ 100 nM, używając buforu do rozcieńczania (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT). Nanieś 4 µL rozcieńczonego białka na siatkę po wyładowaniach koronowych. Pozostaw próbkę na siatce przez jedną minutę. (Uwaga: Takie końcowe stężenie cząsteczek zazwyczaj zapewnia optymalną gęstość dobrze rozproszonych cząstek na siatce barwionej negatywnie. W przypadku roztworów barwiących na bazie formatu uranylu lub octanu uranylu obecność fosforanów lub wysokiego stężenia soli (powyżej 0,5 M) zazwyczaj utrudnia uzyskanie dobrych efektów barwienia. Nasze doświadczenie wskazuje, że bufory Hepes lub Pipes dobrze współpracują z roztworami barwiącymi na bazie uranylu).
  10. Za pomocą kawałka papieru filtracyjnego odsącz resztki roztworu z krawędzi siatki, a następnie natychmiast odwróć siatkę i przykładaj ją do kropli barwnika, płucząc siatkę przez około 10 sekund w każdej kropli.
  11. Po ostatnim płukaniu pozostaw barwnik na siatce przez kolejną 1 min, a następnie odsącz go kawałkiem papieru filtracyjnego. Pozostaw cienką warstwę roztworu barwiącego na powierzchni siatki, aby uzyskać efekt głębokiego barwienia. Pozostaw siatkę do szybkiego wyschnięcia w dygestorium.

4. Mikroskopia elektronowa kompleksu egzosomu

Uzasadnienie: Do zbierania par nachylenia próbki w celu rekonstrukcji RCT można wykorzystać każdy transmisyjny mikroskop elektronowy z ruchomym stołem. Teoretycznie im większy kąt nachylenia próbki podczas zbierania danych, tym lepiej. W praktyce, ze względu na konstrukcję uchwytu próbki i geometrię siatki, maksymalny kąt operacyjny jest ograniczony do zakresu od 50 do 70 stopni. W niniejszym protokole opisujemy procedurę z wykorzystaniem mikroskopu elektronowego FEI Tecnai-12. W przypadku innych modeli mikroskopów czynności należy dostosować do wymagań projektu oraz specyfiki urządzenia.

  1. Umieść siatkę z próbką w uchwycie, a następnie wprowadź uchwyt do mikroskopu elektronowego FEI Tecnai -12. Mikroskop pracuje przy napięciu 120 kV. Do wykonywania zdjęć używamy kamery CCD Gatan Ultrascan4000. Upewnij się, że w dialogu „config camera” interfejsu Digital Micrograph opcja „Flip around vertical axis” jest odznaczona, aby zapewnić prawidłowe określenie chiralności (Uwaga: jest to szczególnie istotne, jeśli użytkownik korzysta z procedur rekonstrukcji SPIDER RCT w celu uzyskania modelu 3D).
  2. Sprawdź siatkę z próbką przy niskim powiększeniu, aby znaleźć najlepiej barwione kwadraty. Takie kwadraty powinny zawierać kilkanaście otworów o rozmiarze około 1~2 µm z ciemnymi obszarami barwnika w ich wnętrzu. (Rycina 2)
    Analiza siatki mikroskopowej, rozkład cząsteczek; ocena jakości oznaczona jako „dobra” lub „zła”.
    Rycina 2. Mikrofotografia siatki przy niskim powiększeniu, pokazująca kwadraty z dobrym i złym barwieniem.
  3. Włącz tryb niskiej dawki (low dose) w interfejsie użytkownika FEI i ustaw pozycje wyszukiwania, ostrości oraz ekspozycji w tym trybie. Do wyszukiwania stosujemy długość kamery 1,5 m w trybie dyfrakcyjnym, powiększenie 52 000 dla ekspozycji oraz 150 000 dla ostrości. Czas ekspozycji ustawiono na 1 s. Ustaw pozycję ostrzenia 2 µm od pozycji ekspozycji wzdłuż osi nachylenia.
  4. W trybie wyszukiwania zlokalizuj otwory z dobrym barwieniem i zapisz ich położenia. Dobre otwory charakteryzują się zazwyczaj ciemnym gradientem barwnika widocznym w trybie wyszukiwania. Wykonaj zdjęcie CCD kwadratu. Przechyl preparat pod kątem 55 stopni i wykonaj kolejne zdjęcie. Porównaj oba zdjęcia i zidentyfikuj pary odpowiadających sobie otworów na obu mikrofotografiach. (Rycina 3)
    Porównanie mikroskopowe; technika statyczna; dwupanelowy obraz struktury powierzchni z analizą kąta nachylenia.
    Rycina 3. Para mikrofotografii kwadratu w trybie wyszukiwania przy różnym nachyleniu. Wskazano odpowiadające sobie pary otworów.
  5. Przywróć stół mikroskopu do kąta 0 stopni. Używając zestawu do niskiej dawki, wykonaj zdjęcia każdego otworu zidentyfikowanego w trybie wyszukiwania przy dużym powiększeniu. Zastosowany defokus wynosi około -0,7 µm.
  6. Po wykonaniu zdjęć wszystkich otworów, przechyl stół pod kątem 55 stopni. Wykonaj mikrofotografie przechylonego preparatu przy tym samym powiększeniu co w przypadku nieprzechylonego, z defokusem około -1,2 µm. Zidentyfikuj odpowiadające sobie pary mikrofotografii na podstawie wzorów widocznych na zdjęciach przy niskim powiększeniu. Nieregularny wzór wykonanych własnoręcznie dziurawych siatek węglowych ułatwia korelację. Przeanalizuj pary mikrofotografii i odrzuć te ze złym barwieniem, np. z płytkimi obszarami barwnika (w warunkach nachylenia wokół cząsteczek pojawia się efekt halo). (Rycina 4)
    Wyniki Cryo-EM, pary dobre i złe, mikrofotografia, analiza nanostruktury, biologia strukturalna.
    Rycina 4. Dwie pary mikrofotografii preparatu przy dużym powiększeniu z różnym kątem nachylenia. Oznaczono mikrofotografie dobre i złe.

5. Przetwarzanie obrazów danych

Uzasadnienie: Istnieje wiele różnych opcji i pakietów oprogramowania do przeprowadzania rekonstrukcji RCT komputerowo. Najpowszechniej stosowanym jest SPIDER5. Podstawowy protokół przeprowadzania RCT w programie SPIDER znajduje się na stronie internetowej http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html. Szczegółowy protokół przeprowadzania RCT w SPIDER został opisany w artykule autorstwa Shaikh et al.6 W naszym protokole, w wersji wideo, stosujemy kombinację IMAGIC-5 7 i SPIDER. W wersji tekstowej protokołu przedstawiamy również alternatywną procedurę opartą wyłącznie na programie SPIDER.

  1. Skonfiguruj programy. Używamy narzędzia proc2d z pakietu EMAN8 do zmiany formatu obrazu z obrazu cyfrowego Gatan na format obrazu SPIDER. Do wyrównania 2D wykorzystuje się program IMAGIC-5. Do rekonstrukcji 3D i doprecyzowania modelu służy program SPIDER.

Podrozdział 1: Wybór par nachylenia cząsteczek.

  1. Konwertuj obraz cyfrowy Gatan w formacie *.dm3 na format obrazu SPIDER, używając komendy proc2d w programie EMAN. Pary obrazów nachylonych i nienachylonych są nazywane zgodnie ze wzorcem odpowiednio ***t.spi oraz ***u.spi.
  2. Wybierz pary cząstek za pomocą programu 'WEB' dostarczanego w pakiecie oprogramowania SPIDER. Postępuj zgodnie z instrukcjami na stronach internetowych http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/web.html oraz http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/particles.html. Współrzędne są automatycznie zapisywane w plikach dcu***.spi oraz dct***.spi odpowiednio dla cząstek nienachylonych i nachylonych. Inny dokument, dcb***.spi, zawiera informacje o kącie nachylenia między cząstkami nachylonymi a nienachylonymi. (Uwaga: Trzy kąty wyznaczane podczas dopasowywania w programie WEB między parami nachylonymi nie gwarantują poprawnej chiralności końcowej rekonstrukcji, ponieważ theta nie posiada znaku (wartość dodatnia), a phi i gamma zależą od przypisanych im wartości początkowych. Analiza kierunku gradientu defokusowania na nachylonej mikrografii pomogłaby ustawić poprawne wartości początkowe phi i gamma przed dopasowywaniem, aby uzyskać prawidłową chiralność rekonstrukcji. Rysunek 5 ilustruje poprawną konwencję.)
    Równowaga statyczna, diagram Phi=Gamma; oznaczenia H i L dla pozycji siatki.
    Rysunek 5. Ilustracja wyjaśniająca konwencję wyznaczania kątów w trybie dopasowywania wyboru par cząstek nachylonych w programie WEB, określaną przez gradient defokusowania. H reprezentuje obszar wysokiego defokusowania, natomiast L reprezentuje obszar niskiego defokusowania. Strzałka reprezentuje oś nachylenia. Dla każdego schematu wskazano odpowiadające im poprawne kąty początkowe dla PHI i GAMMA.
  3. Wytnij wszystkie wybrane cząstki, używając zmodyfikowanej wersji skryptu SPIDER, zgodnie z instrukcją na stronie internetowej http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html. Skrypt zapisuje stosy cząstek nienachylonych i nachylonych jako u.spi oraz t.spi. Numery mikrografii, z których pochodzą cząstki, powinny zostać zapisane w pliku particle_list.spi. (Uwaga: Jest to bardzo ważne dla wygenerowania poprawnych plików kątów Eulera dla RCT.)

Podrozdział 2: Dwuwymiarowe dopasowanie i klasyfikacja obrazów cząstek w orientacji niepochylonej.

  1. Konwertuj niepochylone cząstki do formatu IMAGIC-5, używając programu em2em z pakietu Imagic-5. Iteracyjnie wyrównaj i podziel cząstki na klasy jednorodne, korzystając z programów IMAGIC-5 (Dodatek A). Użyj polecenia msa-names-in-class w IMAGIC-5 do wygenerowania tabeli wyszukiwania klas cząstek, którą zapisujemy jako imagic_classes.lis. (Uwaga: Klasyfikacja i wyrównywanie służą zwiększeniu liczby cząstek o tym samym kształcie oraz zmniejszeniu zmienności wewnątrz klasy. Mapa wariancji każdej klasy może dostarczyć informacji o jakości danej klasy.)
  2. Wygeneruj plik wykresu (ali_50.plt w demonstracji wideo) dla wartości translacji i rotacji wyrównania każdej cząstki, korzystając z polecenia header w IMAGIC-5.
  3. Konwertuj tabelę wyszukiwania klas do plików dokumentacji SPIDER base_file***.spi za pomocą skryptu perl lis2spi.pl udostępnionego pod adresem http://cryoem.berkeley.edu.
  4. Konwertuj wartości translacji i rotacji wyrównania każdej cząstki z pliku wykresu wygenerowanego w kroku 5.6 do pliku dokumentacji SPIDER ali_50.spi, używając skryptu plt2spi.pl udostępnionego pod adresem http://cryoem.berkeley.edu.
    Używamy IMAGIC-5 do dwuwymiarowego wyrównywania i klasyfikacji, ponieważ w naszym doświadczeniu program ten zapewnia najlepsze wyniki w tym zadaniu. Alternatywną strategię w SPIDER dla dwuwymiarowego wyrównywania i klasyfikacji można znaleźć pod adresem http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html. Używaliśmy również SPIDER do przeprowadzenia analizy 2D niepochylonych cząstek egzosomu. Poniżej przedstawiono prostą procedurę.
    Alternatywa 5.5) Użyj wyrównywania bez referencji (reference-free alignment), zgodnie z opisem na stronach http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html#refree i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/reffreealign.html, aby wyrównać obrazy. Dwa proste skrypty znajdują się pod adresami http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b05.aps i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b06.rts. Zapisz rotację i przesunięcie wszystkich cząstek w pliku dokumentacji angular_file.spi.
    Alternatywa 5.6) Podziel wyrównane cząstki na grupy o tym samym widoku, zgodnie z opisem na stronach http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/MSA/index.htm i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/classification/tutorial.html. Do klasyfikacji zastosowaliśmy metodę K-średnich. Wygeneruj pliki base_file***.spi na podstawie przeprowadzonej klasyfikacji.

Podrozdział 3: Rekonstrukcja trójwymiarowa z wykorzystaniem obrazów cząsteczek pod kątem.

  1. Zastosuj filtr pasmowy, maskę i wyśrodkuj nachylone cząsteczki w taki sam sposób, jak w przypadku cząsteczek nienachylonych w programie IMAGIC-5. Wygeneruj nowy zestaw danych dla cząsteczek nachylonych. (Uwaga: ten krok jest opcjonalny. Można go wykonać w programie SPIDER).
  2. Utwórz pliki dokumentów kątowych z tabeli wyszukiwania klas ali_50.spi, plików dcb***.spi wygenerowanych przez web w kroku 5.3 oraz pliku listy cząsteczek partile_list.spi z kroku 5.4, używając skryptu SPIDER zgodnie z Appendix B.
  3. Użyj skryptów rekonstrukcyjnych w programie SPIDER, aby przeprowadzić rekonstrukcję każdej klasy zgodnie z opisem w http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html. Każda klasa cząsteczek przyczynia się do jednej objętości rekonstrukcji 3D. Modele 3D można badać w programie UCSF-Chimera9. Dwuwymiarową projekcję modelu 3D pod kątem Eulera (0,0,0) można porównać z odpowiadającą jej średnią klasą 2D z cząsteczek nienachylonych, aby zweryfikować jakość rekonstrukcji. Znajdź podobne objętości, wyrównaj i połącz je w celu wygenerowania objętości początkowych zgodnie z procedurą http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html.

Podrozdział 4: Udoskonalenie rekonstrukcji 3D przy użyciu obrazów cząsteczek bez przechyłu.

  1. Przeprowadź udoskonalenie poprzez dopasowanie projekcji (projection matching refinement) złączonej początkowej objętości względem wszystkich niepochylonych cząsteczek, aby uzyskać objętość o wyższej rozdzielczości, pozbawioną artefaktu spłaszczenia oraz efektu brakującego stożka, wykorzystując skrypty SPIDER zgodnie z opisem w http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html.

6. Reprezentatywne wyniki:

Stosując metodę RCT, uzyskaliśmy około 50 rekonstrukcji egzosomu z całkowitej liczby 5 000 par tiltów (Rysunek 6). Na podstawie 50 modeli 3D można zaobserwować różne orientacje kompleksu osadzonego na siatce, z dominacją dwóch widoków ortogonalnych. W wielu wolumenach wykryto również artefakt spłaszczenia w kierunku prostopadłym do powierzchni węglowej. Przeprowadziliśmy dopasowanie i scalanie wolumenów 3D w celu wygenerowania dwóch początkowych wolumenów w widokach ortogonalnych. Wykorzystując 5 000 niepochylonych obrazów cząstek, uzyskaliśmy tę samą końcową rekonstrukcję 3D egzosomu o rozdzielczości około 18 Angstrom z obu modeli początkowych (Rysunek 7). Struktura ta ujawniła architekturę egzosomu drożdżowego i dostarczyła informacji na temat ścieżki rekrutacji substratu RNA10.

Schemat wariantów trójwymiarowej struktury białka do analiz biomolekularnych w badaniach z zakresu biologii obliczeniowej.
Rycina 6. 50 modeli 3D kompleksu egzosomu uzyskanych za pomocą rekonstrukcji RCT.

Wizualizacja struktury białka, trójwymiarowe modele molekularne, diagram rotacji, badanie biologii strukturalnej.
Rycina 7. Rekonstrukcja 3D kompleksu egzosomu po dopasowaniu.

Dodatek:

Dodatek A. Plik skryptu do dopasowania 2D i klasyfikacji w programie IMAGIC-5.
Plik: auto_align_i.sh
Kliknij tutaj, aby pobrać plik

Dodatek B. Plik skryptu do generowania pliku kątowego dla rekonstrukcji 3D w programie SPIDER.
Plik: generate_angular_file.spi
Kliknij tutaj, aby pobrać plik

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania próbek oraz rekonstrukcji trójwymiarowej kompleksu egzosomu z wykorzystaniem elektronowej mikroskopii z barwieniem negatywowym. Stosując tę metodę, uzyskaliśmy rekonstrukcję 3D za pomocą metody losowych nachyleń stożkowych (random conical tilt) bez uprzedniej wiedzy na temat struktury. Metoda losowych nachyleń stożkowych niekoniecznie wymaga homogenicznej próbki, jednak następujący po niej etap doprecyzowania poprzez dopasowanie projekcji wymagałby ho...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Nogales na UC-Berkeley za pomoc w opracowaniu wstępnych protokołów oraz członkom laboratorium Wang na Uniwersytecie Yale za pomoc w opracowaniu pełnych protokołów. Dziękujemy również pracownikom centrum cryo-EM oraz Centrum Obliczeń Wysokiej Wydajności (High-Performance Computation Center) w Yale School of Medicine za wsparcie. HW jest laureatem Smith Family Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żywica polwinylowo-formaldehydowaElectron Microscopy Sciences63450-15-7
Formian uranyluElectron Microscopy Sciences22451
Lamelki mikroskopowe SuperfrostThermo Fisher Scientific, Inc.4951F-001
Siatka 400 mesh regularSPI Supplies3040C
Powlekarka węglowa Auto 306Edwards Lifesciences
Mikroskop elektronowy Tecnai-12FEI
Urządzenie do glow-dischargeBAL-TECSputter Coater SCD 005

Bibliografia

  1. van Heel, M. Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction. Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).
  2. Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series. J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).
  3. Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles. Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).
  4. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy. Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).
  5. Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
  6. Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).
  7. Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).
  8. Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
  9. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).
  10. Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).
  11. Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp. Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).
  12. Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation. J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

EM pojedynczych cz stekbarwienie negatywowetransmisyjny mikroskop elektronowyrekonstrukcja 3Dprzetwarzanie obraz wdopasowanie projekcjiformat uranylusiatka z dziurkowanego w gla
Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.