Rekonstrukcja kompleksu egzosomu w mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek metodą losowego pochylenia stożkowego

Summary

Ten artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych za pomocą mikroskopii elektronowej z ujemnym barwieniem (EM). W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości przy użyciu metody losowej stożkowej rekonstrukcji pochylenia (RCT).

Abstract

Rekonstrukcja mikroskopii elektronowej (EM) stała się ostatnio popularnym narzędziem do uzyskania trójwymiarowej (3D) struktury dużych kompleksów makromolekularnych. W porównaniu z krystalografią rentgenowską ma kilka wyjątkowych zalet. Po pierwsze, rekonstrukcja EM pojedynczej cząstki nie musi krystalizować próbki białka, co jest wąskim gardłem w krystalografii rentgenowskiej, szczególnie w przypadku dużych kompleksów makromolekularnych. Po drugie, nie potrzebuje dużych ilości próbek białka. W porównaniu z miligramami białek niezbędnych do krystalizacji, rekonstrukcja EM pojedynczej cząstki wymaga tylko kilku mikrolitrów roztworu białkowego o stężeniach nanomolowych, przy użyciu metody barwienia ujemnego EM. Jednak pomimo kilku zespołów makromolekularnych o wysokiej symetrii, pojedyncza cząstka EM jest ograniczona przy stosunkowo niskiej rozdzielczości (poniżej 1 nm) dla wielu próbek, zwłaszcza tych bez symetrii. Technika ta jest również ograniczona wielkością badanych cząsteczek, tj. 100 kDa dla próbek barwionych ujemnie i 300 kDa dla próbek mrożonych i uwodnionych ogólnie.

Dla nowej próbki o nieznanej strukturze, zazwyczaj używamy roztworu metalu ciężkiego do osadzenia cząsteczek poprzez barwienie ujemne. Próbka jest następnie badana w transmisyjnym mikroskopie elektronowym w celu wykonania dwuwymiarowych (2D) mikrofotografii cząsteczek. W idealnej sytuacji cząsteczki białka mają jednorodną strukturę 3D, ale wykazują różne orientacje na mikrofotografiach. Mikrofotografie te są digitalizowane i przetwarzane w komputerach jako "pojedyncze cząstki". Korzystając z dwuwymiarowych technik dopasowywania i klasyfikacji, jednorodne cząsteczki w tych samych widokach są grupowane w klasy. Ich średnie wzmacniają sygnał kształtów 2D cząsteczki. Po przypisaniu cząstkom odpowiedniej orientacji względnej (kąty Eulera), będziemy mogli zrekonstruować obrazy cząstek 2D do wirtualnej objętości 3D.

W rekonstrukcji 3D pojedynczej cząstki niezbędnym krokiem jest prawidłowe przypisanie właściwej orientacji każdej pojedynczej cząstki. Istnieje kilka metod przypisywania widoku dla każdej cząstki, w tym rekonstytucja kątowa¹ i metoda losowego pochylenia stożkowego (RCT)². W tym protokole opisujemy naszą praktykę w uzyskiwaniu rekonstrukcji 3D kompleksu egzosomów drożdży przy użyciu barwienia ujemnego EM i RCT. Należy zauważyć, że nasz protokół mikroskopii elektronowej i przetwarzania obrazu jest zgodny z podstawową zasadą RCT, ale nie jest jedynym sposobem wykonania tej metody. Najpierw opisujemy, jak osadzić próbkę białka w warstwie mrówczanu uranu o grubości porównywalnej do wielkości białka, używając dziurawej siatki węglowej pokrytej warstwą ciągłej cienkiej warstwy węgla. Następnie próbkę umieszcza się w transmisyjnym mikroskopie elektronowym w celu zebrania niepochylonych (0 stopni) i pochylonych (55 stopni) par mikrofotografii, które zostaną później wykorzystane do przetworzenia i uzyskania wstępnego modelu 3D egzosomu drożdży. W tym celu przeprowadzamy RCT, a następnie dopracowujemy początkowy model 3D za pomocą metody zagęszczenia dopasowania projekcji³.

Protocol

1. Zasada metody losowego stożkowego pochylenia

1. Zasada metody losowego stożkowego pochylenia wymaga pobrania pary mikrofotografii tego samego obszaru próbki wewnątrz mikroskopu elektronowego. Jedno zdjęcie jest robione próbce w pozycji niepochylonej (ryc. 1A), a drugie zdjęcie jest robione próbce przechylonej pod kątem od 50 do 70 stopni (w naszym przypadku używamy 55 stopni). (Rysunek 1B)
2. Za pomocą komputera zdigitalizowana para mikrofotografii jest umieszczana obok siebie i wybierane są obrazy z tych samych cząstek. (Rysunek 1C)
3. We współrzędnych trójwymiarowych obrazy nienachylonych cząstek i ich nachylonych partnerów są ze sobą skorelowane kierunkiem osi nachylenia i kątem nachylenia. (Rysunek 1D)
4. Wyrównanie obrazów cząstek nienachylonych przenosi obrazy nachylonych cząstek do odpowiadających im lokalizacji azymutalnych. (Rysunek 1E)
5. Korzystając z wielu obrazów nachylonych cząstek wypełniających przestrzeń azymutalną, trójwymiarową strukturę cząsteczki można zrekonstruować za pomocą algorytmu projekcji wstecznej. (Rysunek 1F)
   
   Rysunek 1. Ilustracja zasady rekonstrukcji RCT.

2. Przygotuj siatki z węgla kamiennego pokrytego cienkim węglem

Uzasadnienie: Używamy metody barwienia ujemnego, aby utrwalić próbkę białka do losowej rekonstrukcji stożkowego pochylenia. Aby zachować makrocząsteczki bez zbytniego spłaszczania podczas suszenia, staramy się zatopić cząsteczki białka w głębokim barwieniu o grubości zbliżonej do wymiaru białek⁴. Ogólnie rzecz biorąc, węgiel ciągły jest używany do wytwarzania próbek barwionych ujemnie. Taki rodzaj węgla jest jednak trudny do kontrolowania grubości barwienia wokół cząstek białka. W związku z tym używamy domowej roboty dziurawych siatek węglowych pokrytych cienką warstwą filmu węglowego (grubość ~5 nm) do wykonania próbek barwionych ujemnie. Małe dołki utworzone przez otwory pozwalają na zatrzymanie roztworu białka i roztworu barwienia na siatce, dzięki czemu znacznie łatwiej jest osadzić białko w optymalnej grubości barwienia. Co więcej, cienka warstwa węgla nad otworem znacznie redukuje szumy tła.

1. Przygotować 0,5% roztwór Formvaru. Do dygestorium dodać 0,45 g poliwinylo-formalnej żywicy i 90 ml chloroformu do szklanej zlewki o pojemności 100 ml. Użyj folii aluminiowej do przykrycia zlewki i użyj małego mieszadła, aby pomóc rozpuścić formalną żywicę na mieszadle magnetycznym. Rozpuszczenie żywicy zajmuje około 15 minut.
2. Podczas rozpuszczania preparatu Formvar należy oczyścić szkiełka mikroskopowe w metanolu i wytrzeć do sucha chusteczkami Kimwipes.
3. Po całkowitym rozpuszczeniu żywicy Formvar w chloroformie dodać 1 ml 50% glicerolu na powierzchnię roztworu. Regulacja objętości dodanego glicerolu wpływa na gęstość otworów w dziurawym węglu. Zanurz końcówkę ultrasonografu w roztworze na głębokości około 1 cala i użyj maksymalnej mocy do sonikacji przez 1 minutę, aby uzyskać emulsję kropelek glicerolu w roztworze Formvar. Po tym kroku roztwór staje się mleczny. Dłuższa sonikacja powoduje mniejszy rozmiar otworów w dziurawym węglu.
4. Bezpośrednio po sonikacji zanurz oczyszczone szkiełka pionowo w emulsji na 1 sekundę, wyjmij je i osusz dno szkiełek za pomocą bibuły filtracyjnej, aby utworzyć cienką folię z tworzywa sztucznego na powierzchni szkiełek. Po odparowaniu pęcherza żółciowego sprawdź gęstość i rozmiar otworów w folii pod mikroskopem świetlnym. Dostosuj warunki przygotowania do potrzeb. Przy opisanym tutaj warunku zazwyczaj uzyskujemy otwory o średnicy 3 ~ 4 mikrometry i 10 ~ 20 otworów w każdym kwadracie siatki o oczkach 400.
5. Po wyschnięciu szkiełek odetnij krawędź folii z tworzywa sztucznego na powierzchni szkiełka. Zetrzyj folię na powierzchni wody destylowanej. Cienką warstwę na powierzchni wody można zaobserwować pod kątem patrzenia na odbicie światła. Umieść siatki miedziane o oczkach 400 na folii jeden po drugim, gładką powierzchnią kratek skierowaną w dół.
6. Podnieś plastikową folię z siatkami za pomocą kawałka papieru. Odwróć papier i pozostaw do wyschnięcia na szalce Petriego. Namocz papier w metanolu, aby usunąć resztki glicerolu z otworów i pozwól papierowi wyschnąć na powietrzu.
7. Pokryj siatki warstwą węgla o grubości ~20 nanometrów w parowniku węglowym. Grubość można określić na podstawie szarego koloru węgla.
8. Namocz siatki węglem w chloroformie przez pół godziny, aby usunąć Formvar. Po wysuszeniu kratek uzyskaliśmy domowe dziurawe kratki węglowe.
9. Odparuj cienką warstwę węgla o grubości około 5 nanometrów na świeżo rozszczepioną powierzchnię miki.
10. Ostrożnie umieść dziurawe kratki węglowe pod wodą destylowaną. Unieś cienki węgiel z powierzchni miki na powierzchnię wody i powoli osadź go na dziurawych siatkach węglowych. Wysuszyć kratki w dygestorium.

3. Negatywne zabarwienie kompleksu egzosomów

Uzasadnienie: Istnieje sporo roztworów barwników metali ciężkich, które mogą być użyte do barwienia negatywnego EM, w tym octan uranylu, mrówczan uranylu, kwas fosfowolframowy, molibdenian amonu i inne. Różne roztwory bejc mają różne unikalne właściwości. Na przykład octan uranylu zapewnia wysoki kontrast cząsteczki, ale może rozbijać kompleksy białkowe, które nie lubią kwaśnego środowiska. W przypadku tych próbek kwas fosfotungestowy o neutralnym pH może być dobrym roztworem barwienia. Wybieramy nasycony roztwór mrówczanu uranylu (UF) ze względu na jego drobną ziarnistość i wysoką zdolność penetracji cząsteczek.

1. Gotuj wodę destylowaną przez 1 min. Powoli schładzaj do temperatury pokojowej. Ten krok ma na celu usunięcie rozpuszczonego tlenu z wody.
2. Przygotuj świeży 2% roztwór mrówczanu uranylu (UF). Wymieszaj 1 ml wody i 20 mg UF w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować przez 10 minut.
3. Dostosuj wartość pH do 5,0, dodając 2 mikrolitry 10 M wodorotlenku potasu. Natychmiast wymieszaj. Kolor roztworu powinien być bardziej żółty. pH roztworu nie powinno być zbyt wysokie, w przeciwnym razie plama wytrąca się.
4. Umieść rurkę na wirowniku na kolejne 10 minut.
5. Wirować roztwór na wirówce stołkowej z maksymalną prędkością przez 10 minut.
6. Przefiltrować roztwór przez membranę PVDF o grubości 0,2 mikrometra. To jest świeże rozwiązanie UF. Przykryj probówkę z roztworem kawałkiem folii aluminiowej, aby zapobiec przedostawaniu się światła. Roztwór należy zużyć tego samego dnia.
7. Wyładowanie jarzeniowe jedną cienką, przedziurawioną siatką węglową za pomocą aparatu do rozładowania jarzeniowego przez 30 sekund przy prądzie 25 mA.
8. Połóż kawałek czystego parafilmu na ławce. Umieść 3 kropelki 50 mikrolitrowego roztworu plamy UF na wierzchu parafilmu.
9. Rozcieńczyć kompleks egzosomów do stężenia 50 ~ 100 nM za pomocą buforu rozcieńczającego (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT). Umieść 4 mikrolitry rozcieńczonego białka na siatce rozładowanej jarzeniowo. Pozostaw próbkę na siatce przez jedną minutę. (Uwaga: Takie końcowe stężenie cząsteczek na ogół daje optymalną gęstość dobrze zdyspergowanych cząstek na ujemnie zabarwionej siatce. W przypadku mrówczanu uranylu lub roztworu barwienia octanu uranylu fosforan lub wysokie stężenie soli (ponad 0,5 M) na ogół nie jest dobre dla uzyskania dobrych wyników barwienia. Z naszego doświadczenia wynika, że Hepes lub Pipes dobrze współpracują z roztworami barwników uranylowych.)
10. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby osuszyć pozostały roztwór z krawędzi siatki i natychmiast odwróć siatkę na kropelki plamy i płucz siatkę przez około 10 sekund na każdej kropli.
11. Po ostatnim płukaniu pozostaw plamę na siatce przez kolejną 1 minutę, a następnie zetrzyj plamę kawałkiem bibuły filtracyjnej. Utrzymuj cienką warstwę roztworu bejcy na powierzchni siatki, aby uzyskać dobre wyniki głębokiego barwienia. Pozostaw ruszt do szybkiego wyschnięcia w dygestorium.

4. Mikroskopia elektronowa kompleksu egzosomów

Uzasadnienie: Każdy transmisyjny mikroskop elektronowy z odchylanym stolikiem może być użyty do zebrania par nachylenia próbki do rekonstrukcji RCT. Teoretycznie im większy kąt można przechylić próbkę w celu zebrania danych, tym lepiej. W praktyce, ze względu na konstrukcję uchwytu na próbki i geometrię siatki, maksymalny kąt działania jest ograniczony od 50 do 70 stopni. W tym protokole opisujemy tylko naszą procedurę przy użyciu mikroskopu elektronowego FEI Tecnai-12. W przypadku innych modeli mikroskopów operacje należy dostosować do wymagań projektu i właściwości urządzenia.

1. Umieść siatkę próbki w uchwycie na próbkę, a następnie umieść uchwyt w mikroskopie elektronowym FEI Tecnai -12. Mikroskop pracuje pod napięciem 120 kV. Do robienia zdjęć używamy kamery CCD Gatan Ultrascan4000. Upewnij się, że opcja "Odwróć oś pionową" w oknie dialogowym "kamera konfiguracyjna" w interfejsie Digital Micrograph jest odznaczona, aby zapewnić prawidłowe określenie ręczności. (Uwaga: jest to ważne zwłaszcza wtedy, gdy czytelnik polega na procedurach rekonstrukcji SPIDER RCT, aby uzyskać model 3D.)
2. Sprawdź siatkę próbki w małym powiększeniu, aby znaleźć najlepiej poplamione kwadraty. Tego rodzaju kwadraty powinny mieć kilkanaście otworów o wymiarze około 1~2 mikrometrów oraz ciemne plamy w nich. (Rysunek 2)
   
   Rysunek 2. Mikrofotografia siatki w małym powiększeniu przedstawiająca kwadraty z dobrymi i złymi plamami.
3. Włącz tryb niskiej dawki w interfejsie użytkownika FEI i dostosuj pozycję wyszukiwania, ostrości i ekspozycji w trybie niskiej dawki. Używamy powiększeń 150 000 do ustawiania ostrości, 52 000 do ekspozycji i 1,5 metra długości aparatu w dyfrakcji do wyszukiwania. Czas naświetlania jest ustawiony na 1 sekundę. Ustaw pozycję ostrości w odległości 2 mikrometrów od pozycji ekspozycji wzdłuż osi nachylenia.
4. Znajdź z dobrym zabarwieniem w trybie wyszukiwania i zapisz lokalizacje. Dobre na ogół mają w sobie gradient ciemnej plamy obserwowany w trybie wyszukiwania. Zrób zdjęcie kwadratu na matrycy CCD. Przechyl próbkę do 55 stopni, zrób kolejne zdjęcie. Porównaj dwa zdjęcia, zidentyfikuj sparowane otwory w dwóch mikrofotografiach. (Rysunek 3)
   
   Rysunek 3. Pochylona para mikrofotografii kwadratu w trybie wyszukiwania. Wskazane są odpowiednie sparowane otwory.
5. Przechyl stolik z powrotem do 0 stopni. Używanie zestawu do pomiaru niskiej dawki do robienia zdjęć każdej zidentyfikowanej w trybie wyszukiwania w dużym powiększeniu. Zastosowane rozmycie wynosi około -0,7 mikrometra.
6. Po zrobieniu zdjęć wszystkich otworów przechyl scenę do 55 stopni. Wykonaj mikrofotografie pochylonej próbki w takim samym powiększeniu, jak niepochylone, z rozogniskowaniem około -1,2 mikrometra. Zidentyfikuj odpowiadające im pochylone pary mikrofotografii na podstawie wzorów na mikrofotografiach w małym powiększeniu. Nieregularny wzór domowej roboty dziurawych siatek węglowych pomaga w korelacji. Zbadaj pary mikrofotografii z nachyleniem i usuń mikrofotografie ze złymi plamami, takimi jak płytkie poplamione obszary (cząstki wydają się mieć wokół siebie aureolę w stanie pochylonym). (Rysunek 4)
   
   Rysunek 4. Dwie pary mikrofotografii próbki pod kątem przy dużym powiększeniu. Dobre i złe mikrofotografie są zaznaczone.

5. Przetwarzanie danych przez obraz

Uzasadnienie: Istnieją różne opcje i pakiety oprogramowania do przeprowadzenia rekonstrukcji RCT w komputerze. Najczęściej używany jest SPIDER⁵. Podstawowy protokół do wykonywania RCT w SPIDER można znaleźć na stronie internetowej http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html. Szczegółowy protokół wykonywania RCT w SPIDER został opisany w artykule Shaikh i wsp.⁶ W naszym protokole używamy kombinacji IMAGIC-5 ⁷ i SPIDER w wersji wideo protokołu. Udostępniamy również alternatywną procedurę korzystania wyłącznie z SPIDER w wersji tekstowej protokołu.

1. Skonfiguruj programy. Używamy proc2d w pakiecie EMAN⁸ do zmiany formatu obrazu z obrazu Gatan Digital na format obrazu SPIDER. IMAGIC-5 służy do wyrównywania 2D. PAJĄK służy do rekonstrukcji i udoskonalania 3D.

Podsekcja 1: Wybieranie par nachylenia cząstek.

2. Konwertuj obraz *.dm3 Gatan Digital na format obrazu SPIDER za pomocą polecenia proc2d w EMAN. Pary pochylone i nieprzechylone są nazwane we wzorcu odpowiednio jako ***t.spi i ***u.spi.
3. Wybierz pary cząstek za pomocą programu 'WEB' dystrybuowanego w pakiecie programu SPIDER. Postępuj zgodnie z instrukcjami na stronach internetowych http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/web.html i http://www.wadsworth.org/spider_doc/web/docs/particles.html. Współrzędne są automatycznie zapisywane w dcu***.spi i dct***.spi odpowiednio dla cząstek nienachylonych i pochylonych. Inny dokument, dcb***.spi, zawiera informacje o kącie nachylenia między cząstkami nachylonymi i nienachylonymi. (Uwaga: Trzy kąty podczas montażu w WEB między parami pochylenia nie gwarantują prawidłowej ręczności końcowej rekonstrukcji, ponieważ theta nie ma znaku (wartość dodatnia), a phi i gamma zależą od ustawionych im wartości początkowych. Zbadanie kierunku gradientu rozmycia na pochylonej mikrofotografii pomogłoby ustawić prawidłowe początkowe wartości phi i gamma przed dopasowaniem, aby uzyskać prawidłową ręczność rekonstrukcji. Rysunek 5 ilustruje poprawną konwencję).
   
   Rysunek 5. Ilustracja wyjaśniająca konwencję wyznaczania kąta w trybie dopasowania WEB dobierania cząstek z parą pochyleń określanych przez gradient rozmycia. H oznacza obszar o wysokim rozmyciu, a L oznacza obszar o niskim rozmyciu. Strzałka reprezentuje oś pochylenia. Odpowiednie prawidłowe kąty początkowe dla PHI i GAMMA są wskazane dla każdego schematu.
4. Usuń wszystkie wybrane cząstki za pomocą zmodyfikowanej wersji skryptu SPIDER, jak pokazano na stronie internetowej http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/partpick.html. Skrypt zapisuje niepochylone i pochylone stosy cząstek jako u.spi i t.spi. Numery mikrofotografii, z których pochodzą cząstki, powinny być zapisane w particle_list.spi. (Uwaga: Jest to bardzo ważne dla generowania prawidłowych plików kątów eulera dla RCT.)

Podsekcja 2: Dwuwymiarowe wyrównanie i klasyfikacja obrazów nienachylonych cząstek.

5. Przekształć niepochylone cząstki do formatu IMAGIC-5 za pomocą programu em2em w pakiecie Imagic-5. Wyrównaj i zaklasyfikuj cząstki do jednorodnych klas iteracyjnie za pomocą programów IMAGIC-5 (Dodatek A). Użycie polecenia msa-names-in-class w IMAGIC-5 do wygenerowania tabeli przeglądowej klas cząstek, którą zapisujemy jako imagic_classes.lis. (Uwaga: Klasyfikacja i wyrównanie ma na celu zwiększenie liczby cząstek o tym samym kształcie, a także zmniejszenie zmienności w klasie. Mapa wariancji każdej klasy może dostarczyć informacji o jakości klasy).
6. Wygeneruj plik wykresu (ali_50.plt w demonstracji wideo) dla wartości translacji i obrotu wyrównania każdej cząstki za pomocą polecenia nagłówka w IMAGIC-5.
7. Przekonwertuj tabelę przeglądową klas na pliki dokumentów SPIDER base_file***.spi za pomocą skryptu perla, lis2spi.pl dystrybuowane w http://cryoem.berkeley.edu.
8. Przekonwertuj wartości translacji i obrotu wyrównania każdej cząstki z pliku wykresu wygenerowanego dla wartości translacji i obrotu w kroku 5.6 do pliku dokumentu SPIDER ali_50.spi za pomocą skryptu plt2spi.pl dystrybuowanego w http://cryoem.berkeley.edu.
   Używamy IMAGIC-5 do wyrównywania i klasyfikacji 2D, ponieważ zapewnia najlepszą wydajność tego zadania w naszych rękach. Alternatywną strategię w SPIDER dla dwuwymiarowego dopasowania i klasyfikacji można znaleźć pod adresem http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html. Wykorzystaliśmy również SPIDER do przeprowadzenia analizy 2D na niepochylonych cząstkach egzosomu. Poniżej znajduje się prosta procedura.
   Alternatywa 5.5) Użyj wyrównania bez odniesień, zgodnie z opisem na stronach internetowych http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/align.html#refree i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/reffreealign.html aby wyrównać obrazy. Dwa proste skrypty można znaleźć w http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b05.aps i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/proc/b06.rts. Zapisywanie obrotu i przesunięcia wszystkich cząstek w pliku dokumentu angular_file.spi.
   Alternatywa 5.6) Klasyfikuj wyrównane cząstki w grupy z tym samym widokiem, jak opisano na stronach internetowych http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/MSA/index.htm i http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/classification/tutorial.html. Do klasyfikacji użyliśmy metody K-średnich. Wygeneruj plik base_file***.spi na podstawie klasyfikacji.

Podsekcja 3: Rekonstrukcja trójwymiarowa z wykorzystaniem obrazów nachylonych cząstek.

9. Filtruj pasmowo-przepustowe, maskuj i wyśrodkuj nachylone cząstki, tak jak w przypadku nienachylonych cząstek w IMAGIC-5. Wygeneruj nowy zestaw danych dla nazwanych cząstek. (Uwaga: ten krok jest opcjonalny. Można to zrobić w SPIDER.)
10. Utwórz pliki dokumentów anglular z dokumentów tabeli przeglądów klas ali_50.spi, plików dcb***.spi wygenerowanych przez Internet w kroku 5.3 oraz pliku listy cząstek partile_list.spi z kroku 5.4 za pomocą skryptu SPIDER, jak w dodatku B.
11. Użyj skryptów rekonstrukcyjnych w SPIDER, aby wykonać rekonstrukcję każdej klasy zgodnie z opisem w http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html. Każda klasa cząstek składa się na jedną objętość rekonstrukcji 3D. Modele 3D można badać w UCSF-Chimera⁹. Dwuwymiarowe rzutowanie modelu 3D pod kątem eulera (0,0,0) można porównać z odpowiednią średnią klasy 2D z nienachylonych cząstek w celu sprawdzenia jakości rekonstrukcji. Znajdź podobne woluminy, wyrównaj je i scal, aby wygenerować początkowe woluminy zgodnie z procedurą http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/rancon/recn.html.

Podsekcja 4: Udoskonalanie rekonstrukcji 3D za pomocą niepochylonych obrazów cząstek.

12. Wykonuj projekcję dopasowującą udoskonalenie scalonej objętości początkowej do wszystkich niepochylonych cząstek, aby uzyskać objętość o wyższej rozdzielczości bez pomijania stożka i artefaktu spłaszczania za pomocą skryptów SPIDER, jak opisano w http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/techs/recon/refine.html.

6. Reprezentatywne wyniki:

Korzystając z metody RCT, uzyskaliśmy około 50 rekonstrukcji egzosomu z łącznej liczby 5 000 par tiltów (Rysunek 6). Z 50 modeli 3D możemy zobaczyć różne orientacje kompleksu siedzącego na siatce z głównie dwoma widokami ortogonalnymi. Artefakt spłaszczający jest również wykrywalny w wielu objętościach w kierunku prostopadłym do powierzchni węgla. Przeprowadziliśmy wyrównanie i scalenie objętości 3D, aby wygenerować dwie początkowe objętości w widokach ortogonalnych. Korzystając z 5000 obrazów nienachylonych cząstek, uzyskaliśmy tę samą ostateczną rekonstrukcję 3D egzosomu w rozdzielczości około 18 angstremów z obu początkowych modeli (Rysunek 7). Struktura ujawniła architekturę egzosomu drożdży i dostarczyła informacji na temat szlaku rekrutacji substratu RNA¹⁰.

Rysunek 6. 50 modeli 3D kompleksu egzosomów metodą rekonstrukcji RCT.

Rysunek 7. Rekonstrukcja 3D kompleksu egzosomu po udoskonaleniu.

Dodatek:

Dodatek A. Plik skryptu do wyrównywania i klasyfikacji 2D w IMAGIC-5.
Plik: auto_align_i.sh
Kliknij tutaj, aby pobrać plik

Dodatek B. Plik skryptu do generowania pliku kątowego do rekonstrukcji 3D w SPIDER.
Plik: generate_angular_file.spi
Kliknij tutaj, aby pobrać plik

Discussion

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół przygotowania próbki i trójwymiarowej rekonstrukcji kompleksu egzosomów z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej z barwieniem ujemnym. Za pomocą tej metody uzyskaliśmy rekonstrukcję 3D metodą losowego pochylenia stożkowego bez wcześniejszej znajomości konstrukcji. Metoda losowego stożkowego pochylenia niekoniecznie wymaga jednorodnej próbki, ale następujący etap udoskonalania dopasowania projekcji wymagałby jednorodnej próbki w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskopia elektronowa	z żywicy poliwinylowej	63450-15-7
Mikroskopia elektronowa	mrówczanu uranylu	22451
Szkiełka mikroskopowe Superfrost	Thermo Fisher Scientific, Inc.	4951F-001
Regularna siatka siatkowa 400	SPI Supplies	3040C
Powlekarka węglowa Auto 306	Edwards Lifesciences
Tecnai-12 Mikroskop elektronowy	FEI
Wyładowarka jarzeniowa	BAL-TEC		Napylarka SCD 005