Przeszczep jelita cienkiego u myszy

Podsumowanie

Model transplantacji jelita cienkiego myszy jest uznawany za istotne narzędzie do badania mechanizmów odrzutu immunologicznego oraz przesiewowego badania nowych leków immunosupresyjnych. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone, ponieważ techniki w nim wykorzystywane stanowią niezwykle trudne wyzwanie techniczne. W niniejszym materiale przedstawiamy zmodyfikowaną technikę.

Streszczenie

Od 1990 roku rozwój immunosupresji opartej na takrolimusie i udoskonalenie technik chirurgicznych, zwiększona gama silnych leków immunosupresyjnych, profilaktyka infekcji oraz odpowiedni dobór pacjentów przyczyniły się do poprawy aktuarialnych wskaźników przeżywalności przeszczepów i pacjentów we wszystkich rodzajach transplantacji jelita. Pacjenci z nieodwralną niewydolnością jelit oraz powikłaniami żywienia pozajelitowego powinni być obecnie rutynowo rozważani w kierunku transplantacji jelita cienkiego. Jednakże tempo poprawy przeżywalności po transplantacji jelita cienkiego jest powolne w porównaniu z coraz korzystniejszymi wynikami w przypadku nerek, wątroby, serca i płuc. Wyniki transplantacji jelita cienkiego są nadal niezadowalające w porównaniu z innymi narządami. Dalszy postęp może zależeć od lepszego zrozumienia immunologii i fizjologii przeszczepu, co może zostać znacznie ułatwione dzięki modelom zwierzęcym. W badaniach nad immunologią i fizjologią przeszczepionego jelita, jak również w opracowywaniu skutecznych metod diagnostyki wczesnego odrzucenia, niezbędne jest szersze zastosowanie modelu transplantacji jelita cienkiego u myszy. Jednak zastosowanie tego modelu jest ograniczone, ponieważ zaangażowane techniki są niezwykle wymagające pod względem technicznym. Opracowaliśmy zmodyfikowaną technikę. Podczas wykonywania anastomozy żyły wrotnej i żyły głównej dolnej, w bliższym i dalszym wierzchołku żyły głównej dolnej biorcy oraz żyły wrotnej dawcy wykonuje się dwa szwy stabilizujące. Lewą ścianę żyły głównej dolnej i żyłę wrotną dawcy zamyka się szwami ciągłymi wewnątrz żyły głównej dolnej; po wykonaniu jednego węzła przy bliższym szwie stabilizującym, prawą ścianę żyły głównej dolnej i żyłę wrotną dawcy zamyka się szwami ciągłymi na zewnątrz żyły głównej dolnej, używając nici 10-0. Metoda ta jest łatwiejsza do wykonania, ponieważ anastomoza jest tworzona tylko po jednej stronie żyły głównej dolnej, a nici 10-0 mają odpowiednią wielkość, aby uniknąć krwawień i zakrzepicy. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegóły techniki uzupełniające materiał wideo.

Protokół

Przygotowanie dawcy i pobranie jelita cienkiego:

1. Myszy podaje się znieczulenie za pomocą doprzewłoniowego wstrzyknięcia pentobarbitalu, a następnie umieszcza się ją w pozycji grzbietnej na polu operacyjnym.
2. Wykonuje się długie cięcie w linii średniej brzucha. Identyfikuje się proksymalną część jelita czczego i podwiązuje ją szwami 6-0. Przyległe naczynia krezkowe położone dystalnie względem podwiązania jelita czczego podwiązuje się szwami 8-0.
3. Identyfikuje się dystalną część jelita krętego i podwiązuje ją szwami 6-0. Przyległe naczynia krezkowe położone dystalnie względem jelita krętego podwiązuje się szwami 8-0.
4. Żyłę wrotną odsłania się z otaczającej tkanki tłuszczowej i tkanek przyległych, a następnie podwiązuje   i przecina żyły trzustkowo-dwunastnicze oraz żyłę śledzionową.
5. Odsłania się aortę brzuszną, a następnie wydziela się tętnicę krezkową górną z otaczających ją tkanek.
6. W celu heparynizacji do żyły głównej dolnej wstrzykuje się 1 ml heparyny (10u/ml).
7. Żyłę wrotną przecina się w miejscu wnęki wątroby, a tętnicę krezkową górną oddziela się od aorty wraz z łatem Carrela aorty.
8. Jelito czcze i kręte przecina się dystalnie względem podwiązań. Całe jelito cienkie zostaje usunięte, a następnie przechowywane w temperaturze 4°C  w roztworze soli fizjologicznej.

Przygotowanie biorcy i transplantacja:

1. Myszy podaje się znieczulenie poprzez dostojenne wstrzyknięcie pentobarbitalu, a następnie kładzie się ją na plecach w polu operacyjnym.
2. Wykonuje się długie cięcie w linii środkowej brzucha. Zawartość jamy brzusznej jest odsuwana na zewnątrz za pomocą gazy, aby odsłonić aortę brzuszną i żyłę główną dolną.
3. Gałęzie aorty brzusznej oraz żyły głównej dolnej zostają odsłonięte i podwiązane szwami 10-0.
4. Podwiązanie proksymalne i dystalne jest umieszczane odpowiednio wokół aorty i żyły głównej dolnej.
5. W żyle głównej dolnej biorcy wykonuje się wenotomię za pomocą igły 30 G. Otwór jest następnie poszerzany mikronożyczkami do długości równej średnicy żyły wrotnej dawcy.
6. W aorcie brzusznej biorcy wykonuje się aortotomię za pomocą igły 30 G. Otwór jest następnie poszerzany mikronożyczkami do długości równej łacie Carrela tętnicy krezkowej górnej dawcy.
7. Nacięcia aorty brzusznej i żyły głównej dolnej są przepłukiwane roztworem soli fizjologicznej.
8. Jelito cienkie dawcy jest umieszczane po lewej stronie jamy brzusznej biorcy i przykrywane gazą.
9. Szwy stabilizujące są umieszczane w obrębie szczytu proksymalnego i dystalnego aorty brzusznej biorcy oraz łaty Carrela tętnicy krezkowej górnej dawcy.
10. W pierwszej kolejności wykonuje się anastomozę prawej strony aorty brzusznej biorcy i łaty Carrela tętnicy krezkowej górnej dawcy za pomocą szwów ciągłych.
11. Dwa szwy stabilizujące są najpierw umieszczane w szczycie proksymalnym i dystalnym żyły głównej dolnej biorcy oraz żyły wrotnej dawcy, w celu wykonania anastomozy żyły wrotnej dawcy z żyłą główną dolną biorcy.
12. Lewą ścianę żyły głównej dolnej oraz żyły wrotnej dawcy zamyka się szwami ciągłymi wewnątrz żyły głównej dolnej.
13. Po zawiązaniu jednego węzła szwu stabilizującego w szczycie proksymalnym, prawą ścianę żyły głównej dolnej i żyły wrotnej dawcy zamyka się szwami ciągłymi na zewnątrz żyły głównej dolnej.
14. Jelito cienkie dawcy jest przekładane na prawą stronę jamy brzusznej biorcy. Prawa ściana anastomozy aorty brzusznej biorcy i tętnicy krezkowej górnej dawcy jest zamykana szwami ciągłymi.
15. Po wykonaniu wszystkich anastomoz, w pierwszej kolejności usuwa się podwiązanie dystalne, aby sprawdzić, czy nie występują krwawienia z anastomoz.
16. Jeśli krwawienie z anastomoz jest minimalne lub nie występuje, usuwa się podwiązanie proksymalne. Jelito cienkie dawcy zostaje natychmiast wypełnione krwią, a jego kolor zmienia się na czerwony.
17. Dystalny koniec przeszczepionego jelita krętego jest anastomozowany bok-końcu do proksymalnej części jelita czczego biorcy za pomocą ciągłego szwu 8-0.
18. Proksymalna część jelita czczego dawcy jest wyprowadzona na zewnątrz jako stoma i przymocowana do skóry po prawej stronie ściany brzusznej za pomocą czterech szwów 8-0 z każdej strony.
19. Jelita są wprowadzane z powrotem do jamy brzusznej, która zostaje zamknięta ciągłymi szwami 6-0.
20. Myszy biorcy zapewnia się miejsce w cieple. Po jednej godzinie biorca budzi się z narkozy.

Dyskusja

Unikalna odpowiedź immunologiczna po przeszczepie jelita cienkiego była przedmiotem szeroko zakrojonych badań z wykorzystaniem modelu przeszczepu jelita cienkiego u myszy. W grę wchodziły podstawowe reakcje immunologiczne, takie jak reakcja przeszczep przeciwko przeszczepowi, reakcja gospodarz kontra przeszczep, kombinacja obu reakcji, przewlekłe odrzucenie i tolerancja. Prawie wszystkie leki immunosupresyjne o udowodnionym lub potencjalnym znaczeniu klinicznym zostały przetestowane pod kątem skuteczności w modelu przesz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szwy	10-0 i 11-0	MONOSOF
Mikroskop	Unversal S3	Carl Zeiss, Inc.