Prezentacja sposobu wykonania i zastosowania zewnątrzkomórkowej elektrody ssącej używanej do pomiarów elektrofizjologicznych w rdzonach kręgowych noworodków gryzoni in vitro
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Elektrofizjologia rdzenia kręgowego II: Wytwarzanie przyssawkowych elektrod zewnątrzkomórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozwój obwodów neuronalnych i lokomocji można badać, analizując zachowanie centralnego generatora wzorców (CPG) w rdzeniu kręgowym noworodków gryzoni. Prezentujemy metodę wykonania elektrod ssących, które są wykorzystywane do badania aktywności CPG, czyli lokomocji fiktywnej, w wyizolowanych rdzeniach kręgowych gryzoni. Rdzenie kręgowe gryzoni umieszcza się w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, a korzenie brzuszne wprowadza do elektrody ssącej. Elektrodę konstruuje się poprzez modyfikację dostępnej komercyjnie elektrody ssącej. Zamiast standardowego drutu dołączonego do elektrody komercyjnej, stosuje się grubszy drut srebrny. Szklana końcówka elektrody komercyjnej zostaje zastąpiona końcówką plastikową w celu zwiększenia trwałości. Przygotowujemy elektrody wyciągane ręcznie oraz elektrody wykonane z rurek o określonych rozmiarach, co zapewnia spójność i powtarzalność. Dane są zbierane przy użyciu wzmacniacza i oprogramowania do akwizycji neurogramów. Pomiary są przeprowadzane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya, aby odpowiednio zapobiec zakłóceniom mechanicznym i elektrycznym.
Protokół
Rejestracje elektrofizjologiczne wyizolowanych rdzeni kręgowych mogą ujawnić genetyczne i rozwojowe zmiany w obwodach neuronalnych 1. Wcześniej zaprezentowaliśmy metodę wyizolowania rdzeni kręgowych myszy noworodkowych 2. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metodę przygotowania elektrod ssących, które są użyteczne w rejestracji fikcyjnej lokomocji w wyizolowanych rdzeniach kręgowych 3.
Koniec elektrody wykonanej z plastikowej rurki można ręcznie wyciągnąć do postaci bardzo cienkiej końcówki, używając niskotemperaturowej lampy alkoholowej 3-5. Plastikową rurkę (PE90, Clay Adams IntramedicTM) trzyma się nad płomieniem, aby zmiękczyć ją do formy plastycznej. Gdy rurka zaczyna topnieć i staje się bardziej przezroczysta, zostaje usunięta z źródła ciepła, a jej końce są delikatnie rozciągane. Moment usunięcia rurki z płomienia jest kluczowy, aby zapobiec zapadnięciu się lub pęknięciu plastiku podczas wyciągania. Cienką część rurki odcina się żyletką, aby uzyskać pożądaną średnicę wewnętrzną, zależną od wieku preparatu lub poziomu segmentarnego rdzenia. Aby ułatwić założenie o-ringu na rurkę, gruby koniec rurki przecina się żyletką pod kątem 45°. Na grubym końcu montuje się tulejkę i o-ring, aby przymocować końcówkę elektrody do korpusu elektrody.
Aby uzyskać elektrody o ściśle określonym rozmiarze i uniknąć trudności związanych z ręcznym wyciąganiem końcówek elektrod, można je skonstruować, wkładając cienką rurkę do rurki o większej średnicy (PE90). Długości rurek zależą od wymagań danej konfiguracji rejestracyjnej i mogą być zmienne. Przedstawiamy wymiary zastosowane w naszych eksperymentach 1-3,5. Za pomocą żyletki odcina się odcinek 1cm cienkiej rurki PTFE (Zeus, Small Parts) oraz odcinek 10cm rurki PE90. Należy sprawdzić końce cienkiej rurki, aby upewnić się, że nie są one zmiażdżone ani zamknięte. Można je udrożnić za pomocą szpilki entomologicznej (Fine Science Tools). Kroplę kleju (JB Weld) nanosi się na środek rurki PTFE. Rurkę PTFE wraz z klejem wciąga się do rurki PE90, zasysając powietrze ustami z końcówki rurki PE90. Na grubym końcu rurki wykonuje się cięcie pod kątem 45°, a następnie mocuje tulejkę i o-ring, zgodnie z wcześniejszym opisem.
Z komercyjnej elektrody ssącej odkręca się tulejkę i złącze BNC. Złącze BNC namacza się w ksylenie przez jedną godzinę w celu usunięcia woskowej uszczelki. Następnie złącze płucze się w wodzie i suszy.
W bocznej ścianie obudowy należy wykonać otwór boczny pod mniejszym kątem. Metalowy pręt jest podgrzewany palnikiem Bunsena i wciskany pod niskim kątem w istniejący otwór w bocznej ściance obudowy. Odcina się odcinek drutu srebrnego o długości 15cm i średnicy 0.010 inch (A-M Systems), a następnie moczy go w wybielaczu przez piętnaście minut. Zabieg ten ma na celu utworzenie powłoki z chlorku srebra, która wspomaga przewodzenie sygnału 6. Drut jest płukany wodą, suszony, a następnie lutowany do złącza BNC. Złącze BNC oraz srebrny drut są wkładane do obudowy elektrody ssącej w taki sposób, aby złącze BNC pozostało z boku obudowy. Do otworu bocznego wprowadza się rurkę ssącą na głębokość 2-3cm. Do obudowy wstrzykuje się około 2-3cm uszczelniacza silikonowego. Złącze BNC jest wkręcane do obudowy elektrody, przesuwając uszczelniacz do przodu.
Końcówkę elektrody należy teraz wprowadzić do przedniej części elektrody. W celu wzmocnienia linii ssącej z portu bocznego można dołożyć rurkę termokurczliwą.
Elektrody są zamontowane na mikromanipulatorach przymocowanych do podstaw magnetycznych i umieszczone w pobliżu naczynia do rejestracji. Koncentryczne kable BNC są podłączone do wzmacniacza wstępnego (headstage), który jest połączony z wzmacniaczem. Wzmacniacz jest podłączony do adaptera (Polyview), który z kolei jest połączony z kartą analogowo-cyfrową (National Instruments) w komputerze PC z oprogramowaniem do akwizycji danych (Polyview).
Podczas rejestracji danych elektrofizjologicznych konieczne jest wyeliminowanie wszelkich zakłóceń zewnętrznych. Naczynie pomiarowe, wzmacniacz i przedwzmacniacz głowicowy są umieszczane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya, aby zapobiec odpowiednio zakłóceniom mechanicznym i elektrycznym.
Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Dostępna komercyjnie elektroda ssąca może zostać zmodyfikowana poprzez dodanie srebrnego drutu o większym przekroju oraz plastikowej końcówki, uformowanej ręcznie nad lampą alkoholową lub wykonanej z dostępnych komercyjnie plastikowych rurek o określonych wymiarach. Ponadto uszczelnienie parafiniowe zastąpiono trwalszym uszczelnianiem z silikonu.
Rysunek 2. Schemat elektrody ssącej w odniesieniu do stołu pneumatycznego (izolacja mechaniczna), klatki Faradaya (izolacja elektryczna), wzmacniacza i komputera. Należy zauważyć, że istnieje uziemienie odniesione do naczynia rejestracyjnego oraz drugie uziemienie odniesione do stołu pneumatycznego i klatki Faradaya.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rozwój układu nerwowego można badać z wykorzystaniem wyizolowanych rdzeni kręgowych gryzoni. W obecności neuroprzekaźników w rdzeniu kręgowym można wywołać fikcyjną lokomocję w formie wzorców aktywności elektrycznej 1,3. Rytmiczne wyładowania te występują z częstotliwością od 0,2 do 0,5 Hz i charakteryzują się naprzemiennością lewo-prawo oraz zginacz-prostownik. Wytrzymałość i wzorce tej aktywności różnią się w zależności od etapu rozwoju 1. Mutacje genetyczne mogą również zakłócać strukturę tej akt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Samuel L. Pfaff jest profesorem w laboratoriach ekspresji genów w The Salk Institute for Biological Studies oraz badaczem w Howard Hughes Medical Institute. Praca ta była wspierana przez Christopher and Dana Reeve Foundation. Joe Belcovson, Kent Schnoeker oraz Mike Sullivan z działu zasobów multimedialnych w Salk Institute pomogli w fotografii i montażu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rurka PTFE Sub Lite Wall (mała rurka) | Zeus | 36AWG | 0.005” ID x 0.003” ścianka (małe elementy). Dostępna również w rozmiarach od 0.003” do 0.006” |
| Duża rurka (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Korpus elektrody | A-M Systems | 573000 | |
| Klej | JB Weld | ||
| Klej: silikonowy uszczelniacz | |||
| Cyna i lutownica | |||
| Wybielacz | |||
| Ksylen | |||
| Srebrny drut: 0.010” | A-M Systems | ||
| Szpilki entomologiczne: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Statyw magnetyczny | Narishige International | GJ-8 | |
| Mikromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Minopłyta (przedwzmacniacz głowicowy) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Jednostka adaptera Polyview | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Przenośny bipolarny system wzmacniaczy Physiodata | Grass Technologies | 15LT | |
| KARTA ANALOGOWO-CYFROWA | National Instruments | 6035E | |
| Stół pneumatyczny; Vibraplane | Kinetic Systems |
Bibliografia
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. , (2010).
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
