Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Podsumowanie

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Streszczenie

Modele mysie są cennym narzędziem do badania ostrego uszkodzenia i przewlekłego przebudowywania mięśnia sercowego in vivo. Wraz z pojawieniem się modyfikacji genetycznych całego organizmu lub mięśnia sercowego oraz szerokiej gamy materiałów biologicznych i/lub syntetycznych, istnieje ogromny potencjał, aby dowolna kombinacja tych metod złagodziła zakres ostrego uszkodzenia niedokrwiennego i zahamowała wystąpienie niewydolności serca następującej po przebudowie mięśnia sercowego.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy metody i materiały wykorzystywane do niezawodnego przeprowadzenia tej mikrochirurgii oraz modyfikacje stosowane w badaniach nad tymczasową (z reperfuzją) lub trwałą okluzją tętnicy wieńcowej, a także przy wstrzykiwaniach domięśniowych. Efekty w obrębie serca, które można zaobserwować w trakcie procedury oraz po zakończeniu eksperymentu, wraz z oceną histologiczną, posłużą do weryfikacji skuteczności.

Krótko mówiąc, przygotowanie chirurgiczne obejmuje znieczulenie myszy, usunięcie futra z klatki piersiowej, a następnie dezynfekcję pola operacyjnego. Intubację dotchawiczą przeprowadza się przy użyciu iluminacji przezezyofagealnej z wykorzystaniem światłowodu. Następnie rurkę podłącza się do respiratora. Nacięcie wykonane na klatce piersiowej odsłania mięśnie piersiowe, które zostają przecięte w celu odsłonięcia żeber. W badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją stosuje się 1 cm fragment rurki PE umieszczony nad sercem, do którego przywiązuje się ligaturę, co pozwala na dostosowanie procesu okluzji/reperfuzji. Do iniekcji domyocardialnych używa się strzykawki Hamiltona ze sterylną igłą skośną o rozmiarze 30gauge. Po zakończeniu manipulacji na mięśniu sercowym kolejno zamyka się klatkę piersiową, mięśnie piersiowe oraz skórę. Analgezję blokową linii wykonuje się za pomocą 0,25% marcainy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, którą aplikuje się do warstwy mięśniowej przed zamknięciem skóry. Myszy otrzymują podskórny zastrzyk soli fizjologicznej i są umieszczane w komorze grzewczej, aż do momentu przyjęcia pozycji grzbietnej. Następnie są one przenoszone do wiwarium i utrzymywane w standardowych warunkach do czasu pobrania tkanek. W momencie poświęcenia myszy są znieczulane, a serce zostaje zatrzymane w rozkurczu za pomocą KCl lub BDM, przepłukane solą fizjologiczną i zanurzone w utrwalaczu. Następnie przeprowadza się rutynowe procedury przetwarzania, zatapiania, krojenia i barwienia histologicznego.

Niesurgicalna intubacja myszy oraz opisane manipulacje mikrosurgicalne sprawiają, że jest to model trudny technicznie do opanowania i uzyskania powtarzalności. Procedury te, w połączeniu z trudnością w wykonywaniu spójnych manipulacji ligaturą w celu zaplanowanych w czasie okluzji i reperfuzji lub iniekcji domięśniowych, mogą również wpływać na przeżywalność, dlatego optymalizacja i spójność są kluczowe.

Protokół

1. Jałowe instrumenty chirurgiczne (Tabela 1) oraz 3-calowe aplikatory z końcówką watną umieszcza się na jałowej podkładce. Sterylizator koralikowy (Germinator 500) zostaje włączony.
2. Myszy (wiek: > 6 tygodni; masa ciała: > 18 g) poddaje się znieczuleniu poprzez wstrzyknięcie dojamowe (i.p.) 20 µl/g masy ciała tribromoetanolu (250 mg/kg; czas trwania – około 40 minut).
3. Gdy myszy przestaną reagować na uciśnięcie palca u stopy, do oczu aplikuje się jałowy lubrykant (Tears Renewed), aby chronić je przed wysychaniem, a lewą stronę klatki piersiowej pokrywa się preparatem depilacyjnym (np. Nair) w celu usunięcia sierści ze skóry.
4. Preparat depilacyjny zmywa się ciepłą bieżącą wodą, a obszar operacyjny dezynfekuje się za pomocą tamponów z betadyną/alkoholem.
5. Mysz umieszcza się na ciepłej izotermicznej podkładce deltaphase przymocowanej do stołu z pleksiglasu. Każdą kończynę unieruchamia się za pomocą taśmy, a pod górnymi zębami poziomo umieszcza się grubą nić, aby utrzymać szczękę górną w stałej pozycji.
6. Stół ustawia się pionowo, a światło z włókna światłowodowego kieruje się bezpośrednio na obszar szyi w celu iluminacji przezezygealnej. Wymaga to precyzyjnego ustawienia, tak aby otwór gardła był widoczny jako dobrze oświetlony otwór, co umożliwia wizualizację tchawicy i ułatwia wprowadzenie rurki PE.
7. Rurkę podłącza się następnie do respiratora (podłączonego do mieszanki 95% O₂/5% CO₂), aby zastosować wentylację z dodatnim ciśnieniem (respirator TOPO; częstotliwość 125 oddechów/min; szczytowe ciśnienie wdechowe 10-12 cmH₂O; *uwaga: ustawienia różnią się w zależności od szczepu i płci 1-3). Po potwierdzeniu wentylacji poprzez synchroniczne ruchy klatki piersiowej, połączenie mocuje się do podkładki taśmą, aby uniknąć ekstubacji podczas operacji.
8. Używając pęsety z ząbkami do odciągnięcia skóry od klatki piersiowej, jałowym ostrzem skalpela nr 10 zamocowanym do rękojeści nr 3 wykonuje się nacięcie skóry o długości 1,5 cm równolegle do mostka.
9. Zakrzywione mikronożyczki Vanna służą do przecięcia mięśni piersiowych i wykonania małego otworu w mięśniu międzyżebrowym.
10. Prostymi, tępymi mikronożyczkami przecina się 3 żebra.
11. Do rozszerzenia klatki piersiowej używa się 9-milimetrowego pediatrycznego rozwieraka okulistycznego.
12. Używając zakrzywionej pęsety, odciąga się osierdzie od serca, a następnie za pomocą pęsety z ząbkami delikatnie je rozdziera.
13. Używając prowadnicy igieł Castroviejo, igłą 3/8 o zwężonym ostrzu i długości 6 mm przeprowadza się szew polietylenowy 8-0 pod lewą przednią zstępującą tętnicą wieńcową (wzdłuż długiej osi serca), prostopadle do niej.
    1. W przypadku ligatury tymczasowej, którą można usunąć w celu przeprowadzenia czasowej reperfuzji, na sercu, równolegle do tętnicy wieńcowej, umieszcza się jałowy fragment PE90 o długości 0,5-1 cm. Szew, który najpierw zapętlono pod tętnicą wieńcową, przywiązuje się następnie do rurki. W momencie planowanego zwolnienia, ligatura zostaje poluzowana. Czynność tę można powtarzać według uznania, a czas okluzji/reokluzji można modyfikować ⁴. W zależności od długości protokołu i zastosowanego rodzaju znieczulenia może być konieczne podanie dodatkowych dawek leku.
    2. W przypadku okluzji trwałej, ligaturę przeprowadzoną pod tętnicą wieńcową po prostu zawiązuje się. Widoczne staje się blaknięcie i dyskinezja, a następnie odcina się długi koniec szwu ^5-10.
    3. W przypadku wstrzyknięć wewnątrzmięśniowych, jałową strzykawkę Hamiltona z jałową igłą skośną 30 G wprowadza się do podstawy serca powyżej obszaru uszkodzenia po prawej stronie ligatury. Igłę przesuwa się następnie do obszaru uszkodzenia i lekko wycofuje, aby skos był widoczny mniej więcej w strefie granicznej. Część roztworu ze strzykawki (2-3 µl) wstrzykuje się do serca, utrzymując igłę w miejscu. Strzykawkę wycofuje się o kolejne 1-3 mm i wstrzykuje resztę roztworu. Strzykawkę trzyma się w miejscu do czasu rozproszenia się powstałej pęcherzyka roztworu. Następnie usuwa się igłę. W przypadku wystąpienia krwawienia, aplikator z końcówką watną delikatnie dociska się do miejsca wkłucia igły, aż krwawienie ustanie ^5-7.
14. Po zakończeniu manipulacji na mięśniu sercowym usuwa się rozwieraki żeber, a jamę klatki piersiowej zamyka się 2-3 szwami materacowymi przy użyciu nici surgipro 6-0.
15. Następnie wykonuje się dwa lub trzy szwy materacowe w celu zamknięcia mięśni piersiowych, aplikuje się 1-3 krople 0,25% markainy w proporcji 1:10 w jałowej soli fizjologicznej (0,1 ml/25 g myszy) na mięsień, a następnie wykonuje się 2-3 szwy materacowe w celu zamknięcia skóry.
16. Mysz odłącza się od respiratora. Po potwierdzeniu rytmicznego, szybkiego i płytkiego oddychania można przeprowadzić ekstubację myszy.
17. 0,5 ml ciepłej jałowej soli fizjologicznej wstrzykuje się do podskórnej przestrzeni grzbietowej, a mysz umieszcza się na podkładce grzejnej w klatce, aż odzyska sprawność ruchową (minimum 1 godzina).
18. W eksperymentach z przeżyciem myszy umieszcza się z powrotem w klatkach i przenosi do wiwarium do czasu utylizacji. Przez pierwsze 2 dni na dnie klatki umieszcza się zwilżony pokarm, aby ułatwić jedzenie (tak, aby myszy nie musiały się wyciągać, co mogłoby powodować ból), a buprenorfinę należy podawać co 6-12 godzin. Opieka pooperacyjna obejmuje również codzienne monitorowanie w pierwszym tygodniu w celu weryfikacji odpowiedniej ruchliwości, pielęgnacji i nawyków żywieniowych.
19. Instrumenty chirurgiczne przeciera się etanolem i umieszcza w sterylizatorze koralikowym przed kolejną operacją.
20. W momencie utylizacji myszy poddaje się znieczuleniu sodem pentobarbitalu (65 mg/ml; 55-65 mg/kg). Po osiągnięciu odpowiedniego stopnia znieczulenia otwiera się jamę klatki piersiowej.
21. Gdy serce wciąż bije, strzykawką z igłą 23 G zawierającą zimny chlorek potasu (KCl, 30 mM) lub monoksym 2,3-butanodionu (BDM; 10 mM) nakłuwa się tylny obszar podstawy komory i powoli wstrzykuje roztwór do komory, aż do zatrzymania serca w rozkurczu.
22. Po usunięciu serca, strzykawką z PBS wykonuje się wsteczną perfuzję płuczącą serce, aby usunąć pozostałą krew. W badaniach ostrych, pod koniec okresu reperfuzji, LAD zostaje ponownie podwiązana w pierwotnym miejscu okluzji. Do aorty wstrzykuje się roztwór zawierający 1% błękitu Evansa. Po wyjęciu serca przecina się je poprzecznie na 3 sekcje o jednakowej grubości, inkubuje w 1% chlorku 2,3,5-trifenylotetrazolium i wykonuje obrazowanie do analiz morfometrycznych ¹¹. W badaniach chronicznych serce zanurza się w utrwalaczu, a następnie przetwarza i zatapia zgodnie z rutynowymi procedurami. Preparaty mogą być następnie barwione histologicznie i obrazowane do analiz morfometrycznych (przy użyciu Scion, NIH Image J lub Image Pro Plus) ^9,10,12.

Reprezentatywne wyniki:

Przy prawidłowym wykonaniu, przeżywalność myszy (samce: wiek 8-10 tygodni, 22-28g; samice: wiek 10-12 tygodni, 20-26g) wynosi: ponad 90% w eksperymentach nad ostrym niedokrwieniem/reperfuzją i prekondycjonowaniem niedokrwiennym, ponad 85% w badaniach nad trwałą ligacją tętnicy oraz około 80% w przypadku wtryskiwań wewnątrzmięśniowych do mięśnia sercowego. Ponieważ wczesne uszkodzenia są łatwiej dostrzegalne poprzez zmiany metaboliczne niż strukturalne, wyznaczanie wielkości zawału w eksperymentach nad niedokrwieniem/reperfuzją i prekondycjonowaniem niedokrwiennym przeprowadza się poprzez podanie 1% barwnika błękitu Evansa do aorty, który upłynni części serca niezaopatrywane przez LAD (Rycina 1A). Po wycięciu serca i przecięciu go poprzecznie na pół, tkankę inkubuje się w 1% roztworze chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliوم w celu pomiaru wielkości zawału (Rycina 1B). Powierzchnie mierzy się przy użyciu oprogramowania obrazującego Scion lub NIH, które można skalibrować za pomocą mikrometru obrazowanego przy tym samym powiększeniu. Wartości te są wykorzystywane do obliczenia stosunku obszaru zagrożonego do lewej komory oraz wielkości zawału do obszaru zagrożonego ¹¹. Różnice między szczepami mogą prowadzić do zmienności masy ciała i wielkości serca, dlatego w celu porównawczym należy dbać o normalizację tych pomiarów do masy serca, masy ciała lub długości kości piszczelowej.

Trwałe podwiązanie tętnicy prowadzi do makroskopowych zmian strukturalnych, takich jak martwica, ścieńczenie ścian i rozszerzenie komory. Porównanie wpływu leczenia i/lub czasu na wielkość zawału i martwicę w stosunku do lewej komory, powierzchnię komory, grubość ściany przegrody oraz wolnej ściany lewej komory w modelu trwałej okluzji (Rycina 2A) można również przeprowadzić przy użyciu oprogramowania do obrazowania Scion lub NIH. Barwienie kolagenu przy użyciu czerwieni picrosirius/fast green (Rycina 2B) może służyć do pomiaru włóknienia śródmiąższowego, które koreluje z funkcjonalnymi wskaźnikami sztywności ściany^8-10. Obraz na Rycinie 3 przedstawia rozkład 6ul roztworu (błękitu Evansa) wstrzykniętego w strefę przyzawałową serca po trwałym podwiązaniu tętnicy. Należy zauważyć, że roztwór przemieszcza się w kierunku uszkodzenia, a także w stronę podstawy i przez całą grubość ściany.

Rycina 1. A. Błękit Evansa wstrzyknięty do aorty przed wycięciem. Obraz przedstawia obszary serca poddane perfuzji (zabarwione) oraz obszar zamknięty (niezabarwiony). B. Barwienie Błękitem Evansa i TTC po ostrym urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym. Jest to reprezentatywny obraz (20x) pokazujący rozkład niebieskiego barwnika, który zabarwił obszary niezamknięte, a także barwienie TTC tkanki metabolicznie żywej (czerwona). Obszary martwicze nie ulegają zabarwieniu, przez co pozostają blade (obrysowane).

Rysunek 2. A. Barwienie hematoksyliną i eozyną. Jest to reprezentatywny obraz (20x) barwienia H&E serca myszy przekrojonego poprzecznie przez obszar zawału 4 dni po MI (20x). Symbol * oznacza martwicę tkanki, strzałki wskazują tkankę ziarninową, RV = prawa komora i LV = lewa komora. B. Barwienie czerwienią picrosirius i fast green. Jest to reprezentatywny obraz (20x) barwienia czerwienią picrosirius/fast green przekroju serca myszy 4 tygodnie po MI. Cytoplazma barwi się na zielono, a włókna kolagenowe na czerwono.

Rycina 3. Rozkład barwnika Evan's Blue po wstrzyknięciu 6ul wewnątrzmięśniowo do serca. Jest to reprezentatywny obraz przedstawiający globalny i transmuralny rozkład barwnika Evan's Blue w całym sercu po wstrzyknięciu 6ul wewnątrzmięśniowo w strefie granicznej bezpośrednio po ligacji tętnicy wieńcowej (12x).

Dyskusja

Choroba wieńcowa pozostaje istotnym problemem zdrowia publicznego, zarówno pod względem epidemiologicznym, jak i finansowym. Wciąż niezbędne są znaczące badania podstawowe, aby zrozumieć mechanizmy, zgodnie z którymi postępują uszkodzenia i przebudowa, oraz w jaki sposób potencjalne terapie mogą modulować te procesy, jeśli mają zostać opracowane do zastosowań klinicznych. Najczęściej wykorzystuje się gryzonie, a szeroki zakres dostępnych myszy modyfikowanych genetycznie sprawia, że gatunek ten jest bardziej atrakcyjnym modelem.

Mimo że istnieją różnice między myszami a innymi gatunkami, model mysi oferuje wiele zalet. Użycie prostego mikroskopu sekcyjnego lub lupy oraz odpowiednie oświetlenie pozwalają na łatwe uwidocznienie naczyń krwionośnych (szczegółową anatomię makroskopową naczyń krwionośnych opisano w pracy Salto-Tellez et al., 2004¹³). Aby zmniejszyć ryzyko śmiertelności pooperacyjnej, bardzo ważne jest unikanie przecinania dużych naczyń, ponieważ całkowita objętość krwi u myszy o masie 25g wynosi mniej niż 2ml¹⁴. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia, w celu jego zahamowania można zastosować delikatny ucisk lub kauteryzację punktową.

Procedurę tę można również zmodyfikować na różne sposoby. Na przykład myszy można znieczulić izofluranem, ketaminą/ksylazyną lub pentobarbitalem sodu, a właściwy wybór zależy od czasu trwania protokołu.^15-18Odruch uciskowy palca stopy jest najczęściej stosowanym wskaźnikiem głębokości znieczulenia. Ponadto, w celu zwiększenia prawdopodobieństwa długoterminowego przeżycia, niektórzy badacze stosują leki przeciwarytmiczne, takie jak lidokaina, aby zmniejszyć częstość występowania śmiertelnych arytmii.^19,20 należy jednak wziąć pod uwagę, że ostatnio wykazano, iż posiada ono właściwości antyapoptotyczne w modelu ostrym²¹Dodatkowo, w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego, przez pierwsze 48 godzin po zabiegu można podawać leki przeciwbólowe, takie jak buprenorfina.^{3,16,17,22,23}Aby utrzymać temperaturę ciała podczas operacji (zwłaszcza w przypadku dłuższych protokołów), zamiast podkładki izotermicznej często stosuje się sondę rektalną połączoną szeregowo z podkładką grzewczą. W przypadku niedokrwienia/reperfusji i/lub przedwarunkowania lub powarunkowania niedokrwiennego: czas trwania zakrzepicy (zakrzepic) i reperfuzji (reperfuzji) może ulec zmianie; w przypadku trwałego zamknięcia naczynia wielkość obszaru zawału może być modyfikowana poprzez dostosowanie miejsca założenia ligatury; a w przypadku wstrzykiwań domięśniowych (np. komórek, białek) może być od 1 do 3 miejsc wstrzyknięcia, a objętość pojedynczej dawki może wynosić do 15 μl.²⁴. W przypadku wstrzykiwania komórek, należy podać rozmiar użytej igły (zazwyczaj 26-30 G)^5,25,26 należy dobrać na podstawie wielkości komórek, tak aby średnica wewnętrzna igły była wystarczająco duża, by uniknąć sił ścinających. Aby uniknąć czynników zakłócających wynik wynikających z procesów zapalnych wywołanych zabiegiem chirurgicznym, niektórzy badacze zgłaszali zastosowanie pętli, którą manipuluje się ex vivo aby przeprowadzić okluzję i reperfuzję serca u myszy z zamkniętą klatką piersiową w dowolnym momencie po zabiegu chirurgicznym^27-29W ostatnim czasie Gao i wsp.³⁰ wykazali, że czasowe i trwałe zamknięcie można przeprowadzić bez konieczności stosowania wentylacji, a niektóre laboratoria zaczęły wykorzystywać ultradźwięki do wykonywania domięśniowych iniekcji wewnątrzmiąższowych przy zamkniętej klatce piersiowej^25,31.

Od czasu opublikowania przez Johnsa i Olsona w 1954 roku³² pierwszej pracy wykazującej możliwość przeprowadzenia ligacji tętnicy wieńcowej u myszy, wielu innych badaczy przyjęło ten model i zmodyfikowało go w celu badania różnych aspektów uszkodzenia i przebudowy mięśnia sercowego^3,33-45. Cechy myszy, takie jak niewielki rozmiar, zdolność rozrodcza oraz stosunkowo niższe koszty zakupu i utrzymania, sprawiają, że gatunek ten jest atrakcyjnym narzędziem w szerokim zakresie badań fizjologicznych i patofizjologicznych. Wraz z postępem w miniaturyzacji technologii obrazowania in vivo^46-49, a także rozwojem metod przeprowadzania i analizy genomiki i proteomiki na dużą skalę, przesiewania leków, badania skuteczności terapii opartych na komórkach i/lub białkach oraz biomateriałów^50-64, w połączeniu z coraz szerszym zakresem manipulacji genetycznych umożliwianych przez powszechnie dostępne lub tkankowo specyficzne myszy transgeniczne bądź mutanty/knockouty, mysi model zawału mięśnia sercowego bez wątpienia pozostanie nieocenionym narzędziem w ocenie ostrego uszkodzenia serca i długoterminowej przebudowy. W związku z tym, umiejętność niezawodnego i powtarzalnego przeprowadzania tych eksperymentów ma niepodważalną wartość.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Długie nożyczki Vanna	George Tiemann & Co.	160-159
Mikro-nożyczki sekcyjne	George Tiemann & Co.	160-161
Pinceta – prosta, 1x2 ząbki	George Tiemann & Co.	105-205
Rękojeść skalpela nr 3	George Tiemann & Co.	105-64	sterylne ostrze nr 10
Pinceta – półzakrzywiona, ząbkowana	George Tiemann & Co.	160-19
Nożyczki tkankowe	George Tiemann & Co.	105-410
Igłotrzymacz Castroviejo	Miltex Inc.	18-1828
Wziernik do oka Cooka	Miltex Inc.	18-63
Surgipro II 8-0	Suture Express	VP-900-X
Prolene 6-0	Suture Express	8776
Sterylizator koralikowy Germinator 500	Cellpoint Scientific	65369-1
Mata izotermiczna Deltaphase	Braintree Scientific, Inc.	39DP
Strzykawka Hamiltona - 25μl	Hamilton Co	80430
Igła skośna G 30	Hamilton Co	7803-07
Wentylator	Kent Scientific	TOPO