Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Summary

W tym protokole, ekspresja genów u drożdży (Saccharomyces cerevisiae) jest zmieniana po ekspozycji na stres oksydacyjny wywołany przez dodanie nadtlenku wodoru (H₂O₂), środka utleniającego.

Abstract

W tym protokole, ekspresja genów u drożdży (Saccharomyces cerevisiae) jest zmieniana po ekspozycji na stres oksydacyjny wywołany przez dodanie nadtlenku wodoru (H₂O₂), czynnika utleniającego. W eksperymencie drożdże są hodowane przez 48 godzin w bulionie 1/2X YPD zawierającym 3X glukozy. Kultura jest podzielona na grupę kontrolną i leczoną. Kultura eksperymentalna jest traktowana 0,5 mM H₂O₂ w buforowanej soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) przez 1 godzinę. Kultura kontrolna jest traktowana wyłącznie HBSS. Całkowite RNA jest ekstrahowane z obu kultur i przekształcane w produkt cRNA znakowany biotyną w wieloetapowym procesie. Końcowy produkt syntezy jest przenoszony z powrotem do UVM Microarray Core Facility i hybrydyzowany z drożdżami Affymetrix GeneChips. Uzyskane w ten sposób dane dotyczące ekspresji genów są przesyłane do oprogramowania do analizy danych bioinformatycznych.

Protocol

1. Izolowanie całkowitego RNA od Saccharomyces cerevisiae za pomocą lizy enzymatycznej

1. Przygotuj strefę pracy wolną od RNaz za pomocą RNazy ZAP (Ambion).
2. Przygotować świeży odczynnik roboczy litykazy, dodając 1 ml wody wolnej od RNaz bezpośrednio do fiolki z litykazą, aby uzyskać końcowy roztwór roboczy 10 j./ul. Dobrze zwiruj i odwróć kilka razy, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Ten roztwór 10 jednostek/μl jest stabilny przez 12 godzin.
3. Przygotuj świeży roztwór DNazy I za pomocą zestawu Qiagen DNase i przechowuj na lodzie.
4. Oznacz probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Przenieść 1,5 ml odpowiedniej kultury drożdży do probówki.
5. Odwirować probówkę o sile 5000 x g (około 3/4 pełnej prędkości) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć supernatant (bez naruszania osadu) za pomocą mikropipety i wyrzucić supernatant. Powtórz krok 4, jeśli rozmiar granulki jest zbyt mały lub jeśli jest to wskazane przez instruktora.****
6. Dodaj 1000 μl wody DEPC do osadu, wiru i wirówki przy 5000 x g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant. Usuń jak najwięcej płynu z granulki drożdży.
7. Dodaj następujące składniki do granulki drożdży i wymieszaj.
   Bufor SG 10 μl Roztwór litykazy (10u / μl) 30 μl
8. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
9. Delikatnie obracaj probówkę co 10 minut, aby wytworzyć sferoplasty. Ze sferoplastami należy obchodzić się delikatnie. Zbadaj drożdże pod mikroskopem, aby zaobserwować pełną sferoplastykę. Podczas badania drożdży na szkiełku mikroskopowym dodaj niewielką ilość 0,1% SDS, aby drożdże pęcznieły i tworzyły idealne kule (nawet dla pączkujących komórek). Oznacza to, że ściany komórkowe zostały strawione.
10. Dodać 350 μl buforu b-RLT do probówki i energicznie wirować przez 1 minutę. Upewnij się, że rurka jest szczelnie zamknięta, przytrzymując pokrywę zamkniętą podczas wirowania. Ta procedura spowoduje lizę sferoplastów.
11. Dodaj 250 μl 100% etanolu do probówki i krótko odwiruj. Po dodaniu etanolu może powstać osad, ale nie wpłynie to na zbieranie RNA.
12. Pobieranie RNA: Oznacz kolumnę wirową RNeasy swoimi danymi identyfikacyjnymi i ostrożnie przenieś cały roztwór z kroku 10 do kolumny wirowej za pomocą mikropipety. Należy uważać, aby nie dotknąć membrany krzemionkowej końcówką pipety. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z pełną prędkością. RNA w próbce będzie przylegać do membrany krzemionkowej kolumny wirowej.
13. Wyjmij kolumnę wirującą z probówki zbiorczej. Odpipetować płyn przepuszczony przez płyn (ciecz w probówce zbiorczej) z powrotem na kolumnę wirową i ponownie odwirować. Wyrzuć probówkę zbiorczą (z przepływem płynu) i umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
14. Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej. Roztwór ten służy do przemywania RNA oraz usuwania soli i rozpuszczonych zanieczyszczeń komórkowych. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z pełną prędkością.
15. Trawienie DNA: Wyjmij kolumnę wirową z wirówki, otwórz pokrywę probówki i dodaj 80 μl roztworu DNazy I do środka membrany kolumny wirowej. Ten etap spowoduje strawienie dowolnego gDNA w próbce. Zamknij pokrywę kolumny i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
16. Przenieść kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
17. Czyszczenie i mycie RNA: Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumny wirowej i wirować z pełną prędkością przez 15 sekund.
18. Wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
19. Dodaj 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej, aby przepłukać RNA na membranie krzemionkowej. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z pełną prędkością.
20. Wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę wirującą w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
21. Ponownie umyć membranę krzemionkową, dodając kolejny bufor RPE o wielkości 500 μl do kolumny wirowej. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z pełną prędkością.
22. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwiruj w mikrowirówce z pełną prędkością przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszelkie pozostałości cieczy zostały usunięte z membrany krzemionkowej.
23. Odzyskiwanie RNA: Przenieś kolumnę wirową RNeasy do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml, która została oznaczona informacjami o próbce. Zwróć uwagę, że nasadka nowej rurki pozostanie otwarta przez kilka następnych kroków.
24. Ostrożnie odpipetować 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na środek membrany krzemionkowej. Nie dotykaj membrany krzemionkowej końcówką pipety (patrz schemat). Przyjrzyj się uważnie podczas wykonywania tego kroku. Prowadź pipetę obiema rękami. Upewnij się, że woda jest równomiernie rozprowadzona na membranie.
25. Inkubować kolumnę wirową w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Wirować z pełną prędkością przez 30 sekund.
26. Ostrożnie przenieść 30 μl odzyskane w probówce o pojemności 1,7 ml z powrotem na środek membrany krzemionkowej tej samej kolumny wirowej, jak w kroku 22 powyżej. Umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 1,7 ml i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować przez 1 minutę na pełnych obrotach. Ta podwójna elucja zapewnia, że maksymalna ilość RNA zostanie odzyskana z błony.
27. Oznacz dwie nowe probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi i przenieś całą odzyskaną próbkę RNA do jednej z tych probówek.
28. Przenieść 4 μl tej próbki do drugiej oznakowanej probówki. Próbka ta zostanie przetransportowana z powrotem do UVM w celu kwantyfikacji Nanodrop i oceny jakościowej RNA (ma to na celu walidację analizy ilościowej i jakościowej RNA przeprowadzonej na miejscu w uczestniczącym instytucie).
29. Umieść wszystkie próbki na lodzie.
30. Kwantyfikacja RNA: Za pomocą biofotometru Eppendorf zmierz absorbancję próbki RNA na spektrofotometrze w rozcieńczeniu od 1 do 50 (1 μl próbki + 49 μl H₂O).
31. Oceń jakość RNA za pomocą E-Gel (Invitrogen) 1,2% prefabrykowanego żelu agarozowego do elektroforezy.
32. Analiza jakościowa RNA: Skonfiguruj aparat do elektroforezy E-gel. Uruchom żel przez 2 minuty zgodnie z procedurą producenta. Po uruchomieniu wstępnym wyjmij grzebień żelowy i dodaj 14 μl wody do każdej studzienki, a następnie 1 μl każdej próbki do każdej studzienki. Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół. Użyj drabinki DNA o odpowiednim rozmiarze w jednym dołku w celu późniejszego porównania rozmiarów (BioLine Easy Ladder I rozmiar wzorcowy lub marker Novagen PCR). Zapisz, która próbka znajduje się na każdym pasie. Uruchom żel na 20 minut.
33. Zrób zdjęcie żelu.

2. Synteza pierwszej nici cDNA

1. Oznacz probówkę PCR o pojemności 0,5 ml danymi identyfikacyjnymi. Ze stężenia RNA określonego w powyższym doświadczeniu oblicz objętość próbki, aby uzyskać 3,0 ug. Przenieś tę ilość do probówki. Dodaj tyle wody wolnej od RNaz, aby zwiększyć objętość do 11,0 ul.
2. Dodać 1,0 μl odczynnika T7 oligo (dT)₂₄ do probówki. Na tym etapie należy zwrócić szczególną uwagę na objętość końcówki pipety, aby upewnić się, że cały odczynnik został przeniesiony. Wiruj probówkę i wiruj z pełną prędkością przez 5 sekund. Umieść probówkę w termocyklerze ustawionym na 70°C na 10 minut.
3. Podczas inkubacji w temperaturze 70°C przygotuj pierwszą mieszankę wzorcową pasm w nowej probówce. Pamiętaj, aby dodać następujące odczynniki W KOLEJNOŚCI, wirować i wirować na pełnych obrotach przez 5 sekund i umieścić probówkę na lodzie.
   Główny miks pierwszej nici: FirstStrandBuffer5X 4 μl 0,1MDTT 2 μl 10mMdNTP 1 μl Indeks górnyII 1 μl
   Użyj mikropipety P2, aby odmierzyć objętość 2 μl lub mniejszą.
4. Po zakończeniu inkubacji w temperaturze 70°C w kroku 2 dodać do probówki 8 μl pierwszej mieszanki wzorcowej nici wykonanej w kroku 3 i inkubować w termocyklerze w temperaturze 42°C przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji syntezy pierwszej nici umieścić probówkę na lodzie. Podczas tej inkubacji należy przygotować drugą nić mieszanki wzorcowej.

3. Synteza drugiej nici cDNA

1. Wykonaj następującą drugą mieszankę wzorcową nici w nowej tubie. Trzymaj go na lodzie. Odwiruj i odwiruj wszystkie odczynniki przed użyciem. Dodaj odczynniki w podanej kolejności.
   Druga nić główna mix DEPC Woda 91 ul 5X bufor drugiej żyły 30 ul Zasilacze dNTP (10 mM) 3 ul Ligaza DNA Ecoli (10U/ul) 1 ul Ecoli DNA Polimeraza I (10U/ul) 4 ul Ecoli RNase H (2U/ul) 1 ul
2. Wirować probówkę i wirować przez 5 sekund z pełną prędkością.
3. Po zakończeniu inkubacji w temperaturze 42°C przenieść całe 130 μl mieszanki wzorcowej drugiej nici do probówki zawierającej RNA i odczynniki pierwszej nici. Wirować i wirować przez 5 sekund w temperaturze pokojowej. Inkubować probówkę przez 2 godziny w temperaturze 16°C w termocyklerze.
4. Pod koniec 2-godzinnej inkubacji, gdy próbka jest jeszcze w temperaturze 16°C, dodać do probówki 2 μl odczynnika polimerazy DNA T4. Krótko zwirować i odwirować probówkę i inkubować w temperaturze 16°C przez NIE WIĘCEJ NIŻ 5 dodatkowych minut. Inkubacja dłuższa niż 5 minut może obniżyć jakość cDNA ze względu na aktywność 3' do 5'egzonukleazy polimerazy T4.
5. Pod koniec 5-minutowej inkubacji dodać 10 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję polimerazy DNA T4. Przechowywać probówkę w temperaturze -20°C.

4. Wytrącanie cDNA

1. Odwiruj probówkę z żelem Phase Lock z pełną prędkością przez jedną minutę, aby upewnić się, że żel znajduje się na dnie probówki. NIE WOLNO WIROWAĆ PROBÓWEK BLOKUJĄCYCH FAZĘ.
2. Dodać 162 μl dolnej warstwy z buforowanego fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (PCI) o pH 8,0-Tris do zawartości drugiej probówki reakcyjnej syntezy cDNA i wirować przez 5 sekund, aby wymieszać zawartość (Całkowita objętość etapu syntezy cDNA z powyższego doświadczenia wynosi 162 ul. Etap PCI wymaga równych objętości mieszanin wodnych i organicznych).
3. Przenieść całą mieszaninę cDNA-PCI do probówki żelowej z blokadą fazową za pomocą mikropipety. NIE WIROWAĆ rurki żelowej z blokadą fazy.
4. Wirować na pełnych obrotach przez 2 minuty.
5. Oznaczyć nową probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Za pomocą mikropipety przenieś wierzchnią warstwę z probówki z żelem z synchronizacją fazową do nowo oznaczonej probówki o pojemności 1,7 ml. Postaraj się zebrać jak najwięcej warstwy.
6. Dodać następujące składniki do probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 ml i vortex.
   Etanol (100%) 405 ul NH₄OAc 80 ul Farba granulkowa 1 ul
7. Umieść probówkę w wirówce zawiasami probówki skierowanymi na zewnątrz i wiruj z pełną prędkością przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
8. DELIKATNIE wyjmij probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadu cDNA. Granulka powinna być różowa i mniej więcej wielkości ziarna soli i znajdować się z boku rurki pod zawiasem. Umieść na lodzie i natychmiast przejdź do następnego kroku.

5. Czyszczenie granulatu cDNA

1. Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usunąć cały supernatant z probówki. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu. Pamiętaj, że pellet to Twoja próbka!
2. Dodaj 500 μl zimnego 80% etanolu (przechowywanego w zamrażarce -20^°C) do probówki. Delikatnie zakryj rurkę i odwróć ją powoli kilka razy. Obserwuj swój pellet bardzo uważnie. Jeśli pellet zostanie odczepiony, umieść rurkę z powrotem w stojaku i pozwól pelletowi osiąść na dnie. Alternatywnie można odwirowywać probówkę z pełną prędkością przez 15 sekund, aby osad wrócił na dno probówki.
3. Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń etanol, bardzo uważając, aby nie naruszyć granulki. Przechyl rurkę, aby umożliwić usunięcie jak największej ilości płynu.
4. Powtórzyć kroki 2 i 3 z nową podwielokrotnością 80% etanolu.
5. Na koniec usuń cały możliwy etanol za pomocą mikropipety P1000. Odwirować probówkę z pełną prędkością przez 5 sekund i za pomocą mikropipety P20 usunąć ostatnie kilka mikrolitrów etanolu. Celem jest usunięcie jak największej ilości etanolu bez naruszania granulatu.
6. Umieść otwartą probówkę na stojaku lub suszarce na 10-20 minut, aby odparować pozostały etanol. Wysuszony granulat łatwo się gubi po wyschnięciu. Uważaj, aby delikatnie obchodzić się z rurką. Po zakończeniu zamknij korek. Wizualizuj wysuszone granulki, aby potwierdzić, że są obecne w probówce.
7. Zawiesić osad w 22 μl wody wolnej od RNaz i umieścić probówkę na lodzie.

6. Transkrypcja InVitro (IVT)

1. Zestaw biomacierzy ENZO zawiera wszystkie odczynniki potrzebne do przygotowania cRNA znakowanego biotyną z cDNA.
   Miks wzorcowy dla całej klasy zostanie przygotowany w następujący sposób. Instruktor przygotuje tę mieszankę lub wyznaczy kogoś z klasy. Należy to zrobić w obszarze wolnym od RNaz.
     Ilość/próbka #Samples łączny Odczynnik 1 [10x Bufor reakcyjny] 4μl     Odczynnik 2 [10x Biotynukleotydy] 4μl     Odczynnik 3 [10x DTT] 4μl     Odczynnik 4 [10x Inhibitor RNazy] 4μl     Odczynnik 5 [20x polimeraza RNA T7] 2μl     Całkowita objętość 18 μl    
   nuta: Przygotować mieszankę wzorcową wystarczającą na liczbę próbek plus jedną. To zapewni wystarczającą ilość do celów pipetowania.
2. Oznacz probówkę do PCR o pojemności 0,5 ml. Połączyć następujące elementy w probówce i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Wirować wirówkę z pełną prędkością przez 5 sekund, aby wszystkie odczynniki znalazły się na dnie probówki.
   Mieszanina cDNA 22μl Enzomastermix[odgóra] 18μl Całkowity wolumen 40μl
3. Inkubować probówkę w temperaturze 37°C przez 16 godzin w termocyklerze. Po zakończeniu reakcji należy przechowywać próbkę w temperaturze -20°C

7. Czyszczenie biotynylowanego cRNA

1. Przenieś całą próbkę cRNA do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Dodaj 60 μl wody wolnej od RNaz i 350 μl buforu RLT i wiruj przez 5 sekund.
2. Dodaj 250 μl 100% etanolu i ponownie odwiruj.
3. Oznacz kolumnę wirową RNeasy i przenieś całą próbkę cRNA do kolumny. Należy uważać, aby nie dotknąć końcówką pipety membrany krzemionkowej. Zamknij pokrywkę i wiruj przez 15 sekund na pełnych obrotach.
4. Wyjmij kolumnę wirującą z probówki zbiorczej. Odpipetować przepuszczoną ciecz (ciecz w probówce) z powrotem do kolumny wirowej i ponownie odwirować przez 15 sekund.
5. Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odpipetować 500 μl buforu RPE na kolumnę wirową. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z pełną prędkością. Wyrzuć probówkę zbiorczą i przepuszczony płyn. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
6. Dodaj kolejny bufor RPE o pojemności 500 μl do kolumny wirowej.
7. Przenieś kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej i wykonuj wirowanie kolumny "suszącej" z pełną prędkością przez 2 minuty.
8. Oznacz nową probówkę do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Przenieś kolumnę wirującą do tej rurki.
9. Odpipetuj 30 μl wody wolnej od RNaz na środkową membranę krzemionkową RNeasy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Zamknij probówkę i wiruj przez 1 minutę z pełną prędkością.
10. Ostrożnie przenieś 30 μl, które są odzyskiwane w probówce o pojemności 1,7 ml z powrotem na środek membrany krzemionkowej RNeasy tej samej kolumny wirowej. Umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 1,7 ml i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować przez 1 minutę na pełnych obrotach. Ta podwójna elucja zapewnia, że maksymalna ilość cRNA zostanie odzyskana z błony.
11. Przenieś to czyste, znakowane biotyną cRNA do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml i odpowiednio oznacz.
12. Określić stężenie cRNA, stosując tę samą procedurę, jak opisano powyżej, podczas procedury izolacji RNA. Zapisać stężenie i stosunek 260/280.

8. Fragmentacja cRNA w celu przygotowania celu

1. Oznacz probówkę PCR o pojemności 0,5 ml danymi identyfikacyjnymi. Przenieś 5 ug równoważnej ilości cRNA do probówki. Dodaj tyle wody wolnej od RNaz, aby doprowadzić całkowitą objętość do 16,0 ul, a następnie dodaj 4,0 μl 5-krotnego buforu fragmentacyjnego do probówki. Całkowita objętość w rurze powinna wynosić 20,0 ul.
2. Wirować probówkę i wirować przez 10 sekund. Inkubować probówkę w temperaturze 94°C przez 30 minut w termocyklerze. Po inkubacji umieścić na lodzie.

9. Ocena rozdrobnionego i nierozdrobnionego cRNA za pomocą żelu agarozowego

1. Ustawić aparat do elektroforezy E-gel przy użyciu 1,2% prefabrykowanego żelu agarozowego. Uruchom żel przez 2 minuty zgodnie z zaleceniami producenta
2. Dodaj 14 μl wody do każdej studzienki na E-gel.
3. Dodaj 2 μl każdej próbki do każdej studzienki i pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Przeanalizuj zarówno pofragmentowane, jak i nierozdrobnione cRNA każdej próbki. Najlepiej jest ładować próbki (rozdrobnione i nierozdrobnione) na sąsiednie tory. Należy zapisać tożsamość każdej próbki na każdym torze ruchu.
4. Dodać 4 μl drabinki DNA (BioLine Easy Ladder I size standard lub marker Novagen PCR) do jednego pasa żelu
5. Uruchom żel na 20 minut.
6. Wizualizuj E-żel na transiluminatorze. Zrób zdjęcie żelu.

10. Hybrydyzacja do Yeast 2.0 GeneChip

Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Zeskanowany obraz Affymetrix Yeast GeneChip (oprogramowanie operacyjne Affymetrix GeneChip (GCOS))

Rysunek 2. Wykres punktowy 2D wszystkich transkryptów genetycznych (~6,700 genów), porównujący dane dotyczące drożdży kontrolnych i poddanych działaniu środka. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy gen. Geny pokolorowane na fioletowo wskazują geny, które są wyrażane w różny sposób, podczas gdy geny oznaczone na czerwono nie. Opisy genów o zróżnicowanej ekspresji są oznaczone w odpowiedniej legendzie, a większość z nich jest zaangażowana w kontrolę cyklu komórkowego w tym przykładzie. (Oprogramowanie operacyjne Affymetrix GeneChip (GCOS))

Rysunek 3. Ten schemat blokowy ilustruje geny o zróżnicowanej ekspresji w dotkniętym szlaku biologicznym. Geny oznaczone czerwoną gwiazdą wskazują na obniżoną regulację genów w szlaku mejotycznym. (Baza danych do adnotacji, wizualizacji i zintegrowanego odnajdywania (DAVID)

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki wykresu wulkanicznego. Próbki kontrolne i poddane działaniu substancji porównano z wartością odcięcia wartości p wynoszącą 0,05 i 1,5-krotnym odcięciem zmiany ekspresji. Ta działka została wygenerowana przy użyciu oprogramowania Genesifter firmy Geospiza, które zostało podarowane uczniom w celach edukacyjnych.

Discussion

Zastosowania i znaczenie.

Program informacyjny Vermont Genetics Network na Uniwersytecie Vermont prowadzi działania informacyjne na poziomie studiów licencjackich w ośmiu partnerskich szkołach maturalnych w całym stanie. Celem VGN Outreach Core jest zapoznanie studentów studiów licencjackich w stanie Vermont z najnowocześniejszymi technologiami i zasobami naukowymi przy użyciu praktycznych doświadczeń. Opisywany moduł mikromacierzy został opracowany w 2003 roku, a następnie zmodernizowany. Został on zaoferowany jako mini-kurs lub zintegrowany z istniejącym programem nauczania laboratoriów w uczestniczących instytucjach.

Projekt ten, realizowany pomiędzy uniwersytetami badawczymi a szkołami licencjackimi, promuje współpracę w zakresie edukacji i badań. Zasięg mikromacierzy w całym stanie wzbogacił program nauczania i stworzył możliwości badawcze i sieciowe dla głównych obiektów, wykładowców i studentów.

Gdy wykładowcy studiów licencjackich przyjmują program, są zachęcani do projektowania unikalnych eksperymentów, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie chipy Affymetrix GeneChips i adnotacje. Wszystkie informacje dotyczące tego modułu, w tym podręcznik laboratoryjny, referencje i prezentacje PowerPoint, są dostępne online (Vermont Genetics Network, 2008).

Kroki krytyczne:

Feroplastyka: Ważne jest, aby obserwować udaną sferoplastykę pod mikroskopem. Stosowanie SDS jest bardzo korzystne, ponieważ powoduje pęcznienie drożdży, co prowadzi do powstania sferoid. Ważne jest, aby zaobserwować, że pączkujące komórki również tworzą sferoidy. W przypadku zaobserwowania częściowego sferoblastyzmu zaleca się przedłużone leczenie litykazą.

Czyszczenie peletów: Podczas reakcji wytrącania i następującego po niej etapu płukania etanolem bardzo łatwo jest stracić osad cDNA. Niezbędna jest wyjątkowa ostrożność i skrupulatna dbałość o pellet.

Nakładanie wody na środek membrany: Podczas etapu elucji RNA z błony ważne jest, aby "wstrzyknąć" 30 μl wody bezpośrednio do środka membrany krzemionkowej. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, kolumnę można odwirować, a powstały eluant można ponownie nałożyć na membranę krzemionkową. Można to powtórzyć tyle razy, ile to konieczne.

Modyfikacje i zamienniki produktów:

1. Można zastąpić alternatywne kolumny oczyszczające RNA. Przykładami są USB prep-ease i zestaw Invitrogen Pure Link RNA oraz zestaw do czyszczenia Omega RNA, żeby wymienić tylko kilka.
2. Schizosaccharomyces pombe to drożdże opcjonalne. Affymetrix GeneChip zawiera oba genomy na tym samym chipie
3. Można stosować różne zabiegi i czasy. Może to obejmować leczenie farmakologiczne, leczenie temperaturą, przeciwutleniacze itp. Czas leczenia może również ulec dostosowaniu.
4. Leczenie DNazą może nie być wymagane, ponieważ opisane metody wykorzystują użycie startera Oligo (dT).
5. Nie jest wymagane przeprowadzanie podwójnej elucji RNA z kolumny o tej samej 30 μl podwielokrotności. Raz jest prawie zawsze wystarczający. Jest to sugerowane, aby zapewnić całkowite wyzdrowienie. Dodatkowo woda używana do elucji RNA z kolumny może być wstępnie podgrzana do 65°C, aby jeszcze bardziej zwiększyć zdolność odzyskiwania RNA z kolumny krzemionkowej.
6. Dostępnych jest wiele metod ilościowego oznaczania RNA. Eppendorf i Nanodrop zostały wybrane wyłącznie ze względu na ich łatwość obsługi i przetestowaną dokładność.
7. Elektroforeza w żelu agarozowym może być wykonywana przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. E-Gel nie jest wymagany, ale jest pożądany, ponieważ nie zawiera RNaz i nie wymaga czasu oczekiwania na zestalenie żelu.
8. Podano informacje dotyczące zamawiania produktów. Jednak wiele odczynników ogólnych można zamówić u wielu dostawców.
9. Odczynniki cDNA One Cycle można kupić osobno, jeśli jest to bardziej opłacalne.
10. Istnieją inne docelowe metody przygotowania, ale uważamy, że ta oferuje uczniowi więcej możliwości nauczania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrofotometr
Termocyler
Mikrowirówka
Wirowe
płytki mieszające (2)
P-10s pipety
P-20 i # 39; s pipety:
P-200' s pipety:
P-1000' s pipety:
Kamera i transilluminator
Aparat E-Gel	Invitrogen	G6000-08
E-Gels	Invitrogen	G6018-02
Axygen 1,7 ml. Przezroczysty	Krackeler Scientific, Inc.	383-MCT175C
Axygen 0,5 ml przezroczyste tubki	Krackeler Scientific, Inc.	383-MCT060C
Probówki wychwytujące Axygen 2ml	Krackeler Scientific, Inc.	383-MCT200NC
P-10 ART:	CLP	BT10XL
Pudełka końcówek P-100 ART:	CLP	BT200
Pudełka P-20 ART Wskazówki:	CLP	BT20
Pudełka P-1000 ART Wskazówki:	CLP	BT1000
Chipsy
25 ml sterylne jednorazowe pipety-
5 ml sterylne jednorazowe pipety -
Stojaki
KimWipes:
Fartuchy laboratoryjne
Batony
Kolby
hodowlane Pętle do wszczepiania Sharpies
Rękawice
Taśma
Mieszadełka
30% Nadtlenek	wodoru EMD Millipore	386790
HBSS bez Ca, Mg lub barwnika	Sigma-Aldrich	H6648-100ml
Qiagen Rneasy Mini Kit:	Qiagen	74104
Qiagen DNase Kit:	Qiagen	79254
Remover Rnazy	Denville Scientific	D1180
Harleco Alcohol 100%	EMD Millipore	65347
ENZO IVT Kit	Enzo Life Sciences	ENZ-42655-10
Licykaza: jedna butelka	VWR International	IC19012310
Woda, klasa	hodowli komórkowych EMD Millipore	4.86505
Kultura drożdży:	ATCC	18824
Rosół YPD w proszku	EMD Millipore	4.8504
D(+) Glukoza, bezwodna	EMD Millipore	346351
Sorbitol	EMD Millipore	56755
EDTA	a href="http://www.merck-chemicals.com" target="_blank"> Roztwór EMD Millipore	4005
SDS, 20%	EMD Millipore	7990-OP
Pellet Paint	EMD Millipore	69049
PCI RNase bez DNaz (7 podwielokrotności):	Fisher Scientific	AC32711-500
7,5 M NH4OAc	Bufor fragmentacyjny Fisher Scientific	ICN1987 5980
(200 mM tris-octan, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)
Trizma Base	Fiaher	50-899-90034
KOAc	Fisher Scientific	NC9757725
MgOA	Fisher Scientific	NC9681042
Ładowanie barwnika	Invitrogen	10482055
markerów	PCR EMD Millipore	69278-3
Phase Lock Gels	Fisher Scientific	FP2302820
One-Cycle cDNA	Kit Invitrogen	A10752-030
Zawiera;
E. coli DNA Pol
dNTP' s
T4 DNA Pol.
T-7 oligod(T)
0,5 ml EDTA pH 8,0
Bufor
E. Coli RNaseH
Bufor
E. Coli Ligaza
SuperScript II
Naziemna