W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.
Artykuł metodologiczny
Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym protokole ekspresja genów u drożdży (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po ekspozycji na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), będącego środkiem utleniającym. W badaniu drożdże są hodowane przez 48 godzin w pożywce YPD 1/2X zawierającej glukozę 3X. Hodowlę dzieli się na grupę kontrolną i badaną. Hodowlę badaną traktuje się roztworem 0.5 mM H2O2 w soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) przez 1 godzinę. Hodowlę kontrolną traktuje się samym HBSS. Z obu hodowli izoluje się całkowite RNA, które w wieloetapowym procesie jest przekształcane w produkt cRNA znakowany biotyną. Końcowy produkt syntezy jest przekazywany do UVM Microarray Core Facility i hybrydyzowany z macierzami Affymetrix yeast GeneChips. Uzyskane dane dotyczące ekspresji genów są następnie wprowadzane do oprogramowania do bioinformatycznej analizy danych.
Protokół
1. Izolacja całkowitego RNA z Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem lizy enzymatycznej
- Przygotować strefę pracy wolną od RNaz, używając preparatu RNase ZAP (Ambion).
- Przygotować świeży roztwór roboczy litykazy, dodając 1 ml wody wolnej od RNaz bezpośrednio do fiolki z litykazą, aby uzyskać końcowe stężenie roztworu roboczego 10 U/ul. Dobrze wymieszać na wirówce typu vortex i kilkakrotnie odwrócić fiolkę, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Ten roztwór o stężeniu 10 jednostek/μl jest stabilny przez 12 godzin.
- Przygotować świeży roztwór DNazy I przy użyciu zestawu Qiagen DNase i przechowywać go w lodzie.
- Oznaczyć probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Przenieść 1,5 ml odpowiedniej kultury drożdży do probówki.
- Wirować probówkę z prędkością 5000 x g (około 3/4 pełnej prędkości) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć nadsącz (nie naruszając osadu) za pomocą mikropipety i wylać go. **** Powtórzyć krok 4, jeśli osad jest zbyt mały lub jeśli wskaże to instruktor.****
- Dodać 1000 μl wody z DEPC do osadu, wymieszać na vortexie i wirować przy 5000 x g przez 2 minuty. Usunąć nadsącz. Usunąć jak najwięcej cieczy z osadu drożdżowego.
- Dodać do osadu drożdżowego następujące składniki i wymieszać na vortexie.
Bufor SG 10 μl Roztwór litykazy (10u/μl) 30 μl - Inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie obracać probówką co 10 minut w celu wytworzenia sferoplastów. Sferoplasty należy traktować ostrożnie. Zbadać drożdże pod mikroskopem, aby zaobserwować całkowitą sferoplastyzację. Podczas badania drożdży na szkiełku mikroskopowym dodać niewielką ilość 0,1% SDS, aby spowodować pęcznienie drożdży i utworzenie idealnych sfer (nawet w przypadku komórek pączkujących). Wskazuje to na strawienie ścian komórkowych.
- Dodać 350 μl buforu b-RLT do probówki i intensywnie wymieszać na vortexie przez 1 minutę. Upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, trzymając pokrywkę zamkniętą podczas wirowania. Ta procedura spowoduje lizę sferoplastów.
- Dodać 250 μl 100% etanolu do probówki i krótko wymieszać na vortexie. Po dodaniu etanolu może powstać osad, ale nie wpłynie to na odzysk RNA.
- Odzyskiwanie RNA: Oznaczyć kolumienkę wirową RNeasy swoimi danymi identyfikacyjnymi i ostrożnie przenieść cały roztwór z kroku 10 do kolumienki za pomocą mikropipety. Należy uważać, aby nie dotknąć membrany krzemionkowej końcówką pipety. Zamknąć probówkę i wirować przez 15 sekund z pełną prędkością. RNA w próbce przylgnie do membrany krzemionkowej kolumienki wirowej.
- Wyjąć kolumienkę wirową z probówki zbiorczej. Przenieść za pomocą pipety ciecz, która przeszła przez kolumienkę (ciecz w probówce zbiorczej), z powrotem na kolumienkę wirową i ponownie wirować. Wyrzucić probówkę zbiorczą (z przefiltrowaną cieczą) i umieścić kolumienkę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumienki wirowej. Roztwór ten służy do przemywania RNA oraz usuwania soli i rozpuszczonych resztek komórkowych. Zamknąć probówkę i wirować przez 15 sekund z pełną prędkością.
- Trawienie DNA: Wyjąć kolumienkę wirową z wirówki, otworzyć pokrywkę probówki i dodać 80 μl roztworu DNazy I na środek membrany kolumienki wirowej. Ten krok spowoduje strawienie wszelkiego gDNA w próbce. Zamknąć pokrywkę kolumienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Przenieść kolumienkę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Oczyszczanie i przemywanie RNA: Dodać 350 μl buforu RW1 do kolumienki wirowej i wirować z pełną prędkością przez 15 sekund.
- Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumienkę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Dodać 500 μl buforu RPE do kolumienki wirowej, aby przemyć RNA na membranie krzemionkowej. Zamknąć probówkę i wirować przez 15 sekund z pełną prędkością.
- Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumienkę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Przemyć membranę krzemionkową ponownie, dodając kolejne 500 μl buforu RPE do kolumienki wirowej. Zamknąć probówkę i wirować przez 15 sekund z pełną prędkością.
- Umieścić kolumienkę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i wirować w mikrowirówce z pełną prędkością przez 1 minutę, aby upewnić się, że z membrany krzemionkowej usunięto wszelką pozostałą ciecz.
- Odzyskiwanie RNA: Przenieść kolumienkę wirową RNeasy do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml, która została oznaczona informacjami o próbce. Należy pamiętać, że pokrywka nowej probówki pozostanie otwarta przez następne kilka kroków.
- Ostrożnie nanieść 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na środek membrany krzemionkowej. Nie dotykać membrany krzemionkowej końcówką pipety (patrz schemat). Uważać podczas wykonywania tego kroku. Użyć obu rąk do prowadzenia pipety. Upewnić się, że woda jest równomiernie rozprowadzona na membranie.
- Inkubować kolumienkę wirową w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Wirować z pełną prędkością przez 30 sekund.
- Ostrożnie przenieść odzyskane 30 μl z probówki 1,7 ml z powrotem na środek membrany krzemionkowej tej samej kolumienki wirowej, jak w kroku 22 powyżej. Umieścić kolumienkę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej 1,7 ml i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wirować przez 1 minutę z pełną prędkością. Ta podwójna elucja zapewnia odzyskanie maksymalnej ilości RNA z membrany.
- Oznaczyć dwie nowe probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi i przenieść całą odzyskaną próbkę RNA do jednej z tych probówek.
- Przenieść 4 μl tej próbki do drugiej oznaczonej probówki. Próbka ta zostanie przetransportowana z powrotem do UVM w celu ilościowego oznaczania metodą Nanodrop i jakościowej oceny RNA (ma to na celu walidację ilościowej i jakościowej analizy RNA przeprowadzonej na miejscu w instytucji uczestniczącej).
- Umieścić wszystkie próbki w lodzie.
- Ilościowe oznaczanie RNA: Używając biofotometru Eppendorf, zmierzyć absorbancję próbki RNA na spektrofotometrze przy rozcieńczeniu od 1 do 50 (1μl próbki + 49μl H2O).
- Ocenić jakość RNA przy użyciu gotowego żelu agarozowego 1,2% E-Gel (Invitrogen) do elektroforezy.
- Jakościowa analiza RNA: Przygotować aparat do elektroforezy E-gel. Przeprowadzić wstępny rozbieg żelu przez 2 minuty zgodnie z procedurą producenta. Po wstępnym rozbiegu usunąć grzebień żelu i dodać 14 μl wody do każdego dołka, a następnie 1μl każdej próbki do każdego dołka. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół. W jednym dołku użyć odpowiedniej wielkości drabinki DNA w celu późniejszego porównania wielkości (standard wielkości BioLine Easy Ladder I lub marker PCR Novagen). Zapisać, która próbka znajduje się w której ścieżce. Prowadzić elektroforezę przez 20 minut.
- Wykonać zdjęcie żelu.
2. Synteza pierwszej nici cDNA
- Oznakuj probówkę PCR o pojemności 0.5 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Na podstawie stężenia RNA wyznaczonego w poprzednim doświadczeniu oblicz objętość próbki potrzebną do uzyskania 3.0 ug. Przenieś tę ilość do probówki. Dodaj odpowiednią ilość wody wolnej od RNaz, aby zwiększyć objętość do 11.0 ul.
- Dodaj do probówki 1.0 μl odczynnika T7 oligo (dT)24. Podczas tego kroku zwróć szczególną uwagę na objętość końcówki pipety, aby upewnić się, że cały odczynnik został przeniesiony. Wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex i odwiruj z maksymalną prędkością przez 5 sekund. Umieść probówkę w termocyklerze ustawionym na 70°C na 10 minut.
- Podczas inkubacji w 70°C przygotuj w nowej probówce master mix do syntezy pierwszej nici. Pamiętaj, aby dodać poniższe odczynniki W PODANEJ KOLEJNOŚCI, wymieszać w vortexie, odwirować z maksymalną prędkością przez 5 sekund i umieścić probówkę w lodzie.
Master mix do pierwszej nici: FirstStrandBuffer5X 4 μl 0.1MDTT 2 μl 10mMdNTP 1 μl SuperscriptII 1 μl
Do pomiaru objętości 2 μl lub mniejszych użyj mikropipety P2. - Po zakończeniu inkubacji w 70°C z kroku 2, dodaj do probówki 8 μl przygotowanego w kroku 3 master mixu do pierwszej nici i inkubuj w termocyklerze w temperaturze 42°C przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji syntezy pierwszej nici umieść probówkę w lodzie. Podczas tej inkubacji przygotuj master mix do drugiej nici.
3. Synteza drugiej nici cDNA
- Przygotować następującą mieszaninę główną (master mix) do syntezy drugiej nici w nowej probówce. Przechowywać ją w lodzie. Przed użyciem wszystkie odczynniki wymieszać w wirówce laboratoryjnej (vortex) i odwirować. Odczynniki dodawać w podanej kolejności.
Mieszanina główna do syntezy drugiej nici Woda DEPC 91 ul Bufor 5X do syntezy drugiej nici 30 ul dNTPs (10mM) 3 ul Ecoli DNA ligaza (10U/ul) 1 ul Ecoli polimeraza DNA I (10U/ul) 4 ul Ecoli RNaza H (2U/ul) 1 ul - Wymieszać zawartość probówki w vortexie i odwirować przez 5 sekund przy maksymalnej prędkości.
- Po zakończeniu inkubacji w 42°C przenieść całe 130 μl mieszaniny głównej do syntezy drugiej nici do probówki z próbką zawierającej RNA i odczynniki do syntezy pierwszej nici. Wymieszać w vortexie i odwirować przez 5 sekund w temperaturze pokojowej. Inkubować probówkę przez 2 godziny w 16°C w termocyklerze.
- Po zakończeniu 2-godzinnej inkubacji, gdy próbka wciąż znajduje się w 16°C, dodać do probówki 2μl odczynnika polimerazy DNA T4. Krótko wymieszać w vortexie, odwirować probówkę i inkubować w 16°C NIE DŁUŻEJ NIŻ przez dodatkowe 5 minut. Inkubacja dłuższa niż 5 minut może obniżyć jakość cDNA ze względu na aktywność egzonukleazy 3'do 5' polimerazy T4.
- Po zakończeniu 5-minutowej inkubacji dodać 10 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję polimerazy DNA T4. Przechowywać probówkę w -20°C.
4. Wytrącanie cDNA
- Wirowarkę z probówką Phase Lock Gel należy ustawić na maksymalne obroty na jedną minutę, aby upewnić się, że żel znajduje się na dnie probówki. NIE WOLNO MIESZAĆ PROBÓWEK PHASE LOCK NA WYTRZĄSARKU (VORTEXIE).
- Do zawartości probówki z reakcją syntezy cDNA drugiej nici należy dodać 162 μl dolnej warstwy buforowanego w Tris (pH 8,0) fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (PCI), a następnie mieszać na wstrząsarce przez 5 sekund (Całkowita objętość etapu syntezy cDNA z powyższego eksperymentu wynosi 162 μl. Etap PCI wymaga równych objętości mieszanin wodnej i organicznej).
- Całą mieszaninę cDNA-PCI należy przenieść do probówki z żelem Phase Lock za pomocą mikropipety. NIE WOLNO MIESZAĆ probówki z żelem Phase Lock na wstrząsarce.
- Wirować na maksymalnych obrotach przez 2 minuty.
- Oznakować nową probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Za pomocą mikropipety przenieść górną warstwę z probówki z żelem Phase Lock do nowo oznakowanej probówki 1,7 ml. Należy starać się zebrać jak największą ilość tej warstwy.
- Do probówki do mikrowirówki 1,7 ml dodać następujące odczynniki i wymieszać na wstrząsarce:
Etanol (100%) 405 μl NH4OAc 80 μl Pellet Paint 1 μl - Umieścić probówkę w wirówce zawiasem do zewnątrz i wirować na maksymalnych obrotach przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
- OSTROŻNIE wyjąć probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadu cDNA. Osad powinien być różowy, mieć wielkość zbliżoną do ziarnka soli i znajdować się na ściance probówki pod zawiasem. Umieścić na lodzie i niezwłocznie przejść do następnego kroku.
5. Oczyszczanie osadu cDNA
- Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń cały nadsącz z probówki. Uważaj, aby nie naruszyć osadu. Pamiętaj, że osad jest Twoją próbką!
- Do probówki dodaj 500μl zimnego 80% etanolu (przechowywanego w zamrażarce w -20°C). Delikatnie zakręć probówkę i powoli odwróć ją kilka razy. Bardzo uważnie obserwuj osad. Jeśli osad się oddzieli, umieść probówkę z powrotem w statywie i poczekaj, aż opadnie na dno. Alternatywnie można odwirować probówkę z maksymalną prędkością przez 15 sekund, aby osad ponownie opadł na dno probówki.
- Za pomocą mikropipety P1000 ostrożnie usuń etanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechyl probówkę, aby umożliwić usunięcie jak największej ilości cieczy.
- Powtórz kroki 2 i 3 z nową porcją 80% etanolu.
- Na koniec, za pomocą mikropipety P1000, usuń cały możliwy etanol. Odwiruj probówkę z maksymalną prędkością przez 5 sekund i za pomocą mikropipety P20 usuń ostatnie kilka mikrolitrów etanolu. Celem jest usunięcie jak największej ilości etanolu bez naruszania osadu.
- Umieść otwartą probówkę w statywie lub pudełku do suszenia na 10-20 minut, aby odparować pozostały etanol. Wysuszony osad jest łatwo gubiony po wyschnięciu. Należy ostrożnie obchodzić się z probówką. Po zakończeniu zamknij zakrętkę. Sprawdź wizualnie, czy wysuszony osad znajduje się w probówce.
- Resuspenduj osad w 22 μl wody wolnej od RNaz i umieść probówkę na lodzie.
6. Transkrypcja in vitro (IVT)
- Zestaw bioarray ENZO zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do przygotowania znakowanego biotyną cRNA z cDNA.
Mieszanina master mix dla całej grupy zostanie przygotowana w następujący sposób. Mieszaninę tę przygotuje instruktor lub wyznaczona osoba z grupy. Czynność tę należy przeprowadzić w obszarze wolnym od RNaz.
Ilość/próbka Liczba próbek Suma Odczynnik 1 [10x bufor reakcyjny] 4μl Odczynnik 2 [10x nukleotydy biotynowane] 4μl Odczynnik 3 [10x DTT] 4μl Odczynnik 4 [10x inhibitor RNazy] 4μl Odczynnik 5 [20x polimeraza RNA T7] 2μl Objętość całkowita 18 μl
UWAGA: Należy przygotować wystarczającą ilość master mix dla liczby próbek powiększonej o jedną. Zapewni to odpowiednią ilość cieczy do pipetowania. - Oznakować probówkę PCR 0,5 ml. Połączyć w probówce następujące składniki i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół w celu wymieszania. Wirować w wirówce z maksymalną prędkością przez 5 sekund, aby wszystkie odczynniki zebrały się na dnie probówki.
mieszanina cDNA 22μl Enzo master mix [z powyższego] 18μl Objętość całkowita 40μl - Inkubować probówkę w termocyklerze w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Po zakończeniu reakcji przechowywać próbkę w temperaturze -20°C
7. Oczyszczanie biotynilowanego cRNA
- Przenieś całą próbkę cRNA do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Dodaj 60 μl wody wolnej od RNaz oraz 350 μl buforu RLT i wymieszaj w wirówce wortex na 5 sekund.
- Dodaj 250 μl 100% etanolu i ponownie wymieszaj w wirówce wortex.
- Oznakuj kolumnę wirową RNeasy i przenieś do niej całą próbkę cRNA. Należy uważać, aby końcówka pipety nie dotknęła membrany krzemionkowej. Zamknij pokrywkę i wiruj przez 15 sekund z maksymalną prędkością.
- Wyjmij kolumnę wirową z probówki zbiorczej. Przenieś pipetą płyn przefiltrowany (płyn w probówce zbiorczej) z powrotem na kolumnę wirową i ponownie wiruj przez 15 sekund.
- Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i nanieś pipetą 500 μl buforu RPE na kolumnę wirową. Zamknij probówkę i wiruj przez 15 sekund z maksymalną prędkością. Wyrzuć probówkę zbiorczą oraz płyn przefiltrowany. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
- Dodaj kolejne 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej.
- Przenieś kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej i wykonaj wirowanie „suszące” kolumny z maksymalną prędkością przez 2 minuty.
- Oznakuj nową probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Przenieś do tej probówki kolumnę wirową.
- Nanieś pipetą 30 μl wody wolnej od RNaz na środek membrany krzemionkowej RNeasy i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Zamknij probówkę i wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością.
- Ostrożnie przenieś odzyskane 30 μl z probówki 1,7 ml z powrotem na środek membrany krzemionkowej RNeasy tej samej kolumny wirowej. Umieść kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej 1,7 ml i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wiruj przez 1 minutę z maksymalną prędkością. Podwójna elucja zapewnia odzyskanie maksymalnej ilości cRNA z membrany.
- Przenieś to oczyszczone cRNA znakowane biotyną do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml i odpowiednio ją oznakuj.
- Oznacz stężenie cRNA, stosując tę samą procedurę, która została opisana powyżej w części dotyczącej izolacji RNA. Zapisz stężenie oraz stosunek 260/280.
8. Fragmentacja cRNA w celu przygotowania celu
- Oznakuj probówkę PCR o pojemności 0,5 ml swoimi danymi identyfikacyjnymi. Przenieś do probówki 5 ug równoważnej ilości cRNA. Dodaj odpowiednią ilość wody wolnej od RNaz, aby uzyskać objętość całkowitą 16,0 ul, a następnie dodaj do probówki 4,0 μl 5X buforu do fragmentacji. Objętość całkowita w probówce powinna wynosić 20,0 ul.
- Wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex i wiruj przez 10 sekund. Inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 94°C przez 30 minut. Po inkubacji umieść probówkę na lodzie.
9. Ocena sfragmentaryzowanego i niesfragmentaryzowanego cRNA za pomocą żelu agarozowego
- Przygotuj aparat do elektroforezy E-gel, używając gotowego żelu agarozowego 1.2 %. Przeprowadź wstępny rozruch żelu przez 2 minuty zgodnie z zaleceniami producenta
- Dodaj 14 μl wody do każdego oczka żelu E-gel.
- Dodaj 2 μl każdej próbki do odpowiednich oczek i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół. Przeanalizuj pofragmentowane oraz niefragmentowane cRNA każdej próbki. Zaleca się naniesienie próbek (pofragmentowanej i niefragmentowanej) do sąsiednich ścieżek. Zapisz tożsamość każdej próbki w poszczególnych ścieżkach.
- Dodaj 4 μl drabinki DNA (standard wielkości BioLine Easy Ladder I lub marker PCR Novagen) do jednej ścieżki żelu
- Prowadź elektroforezę przez 20 minut.
- Wizualizuj żel E-gel na transiluminatorze. Wykonaj zdjęcie żelu.
10. Hybrydyzacja z macierzą Yeast 2.0 GeneChip
Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1. Zeskanowany obraz Affymetrix Yeast GeneChip (oprogramowanie Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))
Rysunek 2. Dwuwymiarowy wykres rozrzutu wszystkich transkrypty genetycznych (~6 700 genów), porównujący dane z drożdży kontrolnych i traktowanych. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy gen. Geny zaznaczone kolorem fioletowym wskazują na geny o ekspresji różnicowej, natomiast geny zaznaczone kolorem czerwonym nie wykazują takiej różnicy. Opisy genów o ekspresji różnicowej znajdują się w odpowiedniej legendzie; w tym przykładzie większość z nich bierze udział w kontroli cyklu komórkowego. (Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS))
Rycina 3. Ten schemat blokowy ilustruje geny o różnej ekspresji w dotkniętym szlaku biologicznym. Geny oznaczone czerwoną gwiazdką wskazują geny o obniżonej regulacji w szlaku mejozy. (The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki na wykresie wulkanicznym. Próbki kontrolne i traktowane porównano przy zastosowaniu progu wartości p wynoszącego .05 oraz progu zmiany ekspresji 1,5-krotnej. Wykres został wygenerowany przy użyciu oprogramowania Genesifter firmy Geospiza, które zostało przekazane studentom nieodpłatnie do celów edukacyjnych.
Dyskusja
Zastosowania i znaczenie.
Program edukacyjny Vermont Genetics Network na Uniwersytecie Vermont prowadzi działania skierowane do studentów studiów licencjackich w ośmiu partnerskich uczelniach na terenie całego stanu. Celem VGN Outreach Core jest zapoznanie studentów w stanie Vermont z najnowocześniejszą technologią i zasobami naukowymi poprzez praktyczne doświadczenia. Opisany moduł mikromacierzy został opracowany w 2003 roku, a następnie zaktualizowany. Jest on oferowany w formie minikursu lub jako element zintegrowany z istniejącym programem zajęć laboratoryjnych w uczestniczących instytucjach.
Projekt ten, realizowany wspólnie przez jednostki centralne uniwersytetów badawczych i uczelnie licencjackie, sprzyja współpracy w obszarze edukacji i badań. Działania upowszechniające technologię mikromacierzy w całym stanie przyczyniły się do usprawnienia programów nauczania oraz stworzyły możliwości badawcze i networkingowe dla placówek centralnych, kadry naukowej oraz studentów.
W miarę wdrażania programu przez kadrę naukową uczelni, zachęca się ich do projektowania własnych eksperymentów, pod warunkiem dostępności odpowiednich chipów Affymetrix GeneChips oraz adnotacji. Wszystkie informacje dotyczące tego modułu, w tym podręcznik laboratoryjny, bibliografia i prezentacje PowerPoint, są dostępne online (Vermont Genetics Network, 2008).
Kluczowe etapy:
Sferoplastowanie: Ważne jest, aby potwierdzić pomyślny przebieg sferoplastowania pod mikroskopem. Zastosowanie SDS jest bardzo korzystne, ponieważ powoduje ono pęcznienie drożdży, co prowadzi do powstania sferoidów. Należy zwrócić uwagę, czy komórki pączkujące również tworzą sferoidy. W przypadku zaobserwowania częściowego sferoplastowania zaleca się wydłużenie czasu inkubacji z litykazą.
Oczyszczanie osadu: Podczas reakcji wytrącania i następnego etapu przemywania etanolem bardzo łatwo jest zgubić osad cDNA. Niezbędna jest najwyższa ostrożność i skrupulatna uwaga podczas pracy z osadem.
Aplikowanie wody do centrum membrany: Podczas etapu elucji RNA z membrany ważne jest, aby „wstrzyknąć” 30 μl wody bezpośrednio do centrum membrany krzemionkowej. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, kolumnę można odwirować, a otrzymany eluat ponownie nanieść na membranę krzemionkową. Czynność tę można powtarzać tyle razy, ile jest to konieczne.
Modyfikacje i zamienniki produktów:
- Można zastosować alternatywne kolumny do oczyszczania RNA. Przykłady to m.in. USB prep-ease, zestaw Invitrogen Pure Link RNA oraz zestaw Omega RNA clean-up.
- Schizosaccharomyces pombe jest opcjonalnym drożdżem. Affymetrix GeneChip zawiera oba genomy na tym samym chipie.
- Można zastosować różne rodzaje i czasy traktowania. Może to obejmować traktowanie lekami, temperaturą, przeciwutleniaczami itp. Czas traktowania można również dostosować.
- Traktowanie DNazą może nie być wymagane, ponieważ opisane metody wykorzystują starter Oligo (dT).
- Podwójna elucja RNA z kolumny tą samą 30 μl alikwotą nie jest wymagana. Jednokrotna elucja jest prawie zawsze wystarczająca. Procedurę tę sugeruje się w celu zapewnienia całkowitego odzysku. Dodatkowo wodę używaną do elucji RNA z kolumny można wstępnie podgrzać do 65°C, aby dodatkowo zwiększyć wydajność odzyskiwania RNA z kolumny krzemionkowej.
- Dostępnych jest wiele metod ilościowego oznaczania RNA. Urządzenia Eppendorf i Nanodrop wybrano ze względu na łatwość obsługi i potwierdzoną dokładność.
- Elektroforezę w żelu agarozowym można przeprowadzić przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego. System E-Gel nie jest wymagany, ale jest zalecany, ponieważ jest wolny od RNaz i nie wymaga czasu oczekiwania na zestalenie żelu.
- Podano informacje o zamawianiu produktów. Jednak wiele odczynników ogólnych można zamówić u wielu różnych dostawców.
- Odczynniki do syntezy cDNA w jednym cyklu (One Cycle cDNA) można zakupić oddzielnie, jeśli jest to bardziej ekonomiczne.
- Istnieją inne metody przygotowania matrycy, jednak uważamy, że ta metoda oferuje studentowi więcej możliwości dydaktycznych.
Oświadczenia
Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez EMD-Millipore.
Podziękowania
University of Vermont, Vermont Genetics Network. Publikacja ta została zrealizowana dzięki Vermont Genetics Network, w ramach grantu nr P20 RR16462 z programu BRIN oraz grantu nr P20 RR16462 z programu INBRE National Center for Research Resources (NCRR), który jest częścią National Institutes of Health (NIH). Treść publikacji leży wyłącznie w odpowiedzialności autorów i nie musi odzwierciedlać oficjalnego stanowiska NCRR lub NIH.
Pragniemy podziękować wszystkim uczestniczącym instytucjom edukacyjnym za współpracę i wkład w dopracowanie tego modułu: Castleton State College, Green Mountain College, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro College, Middlebury College, Norwich University oraz Saint Michael's College.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Spektrofotometr | |||
| Termocykler | |||
| Mikrowirówka | |||
| Wymieszaj w wstrząsarku wiroksowym | |||
| Mieszadła magnetyczne (2) | |||
| dozowniki P-10s | |||
| P-20'pipety automatyczne: | |||
| P-200'pipety automatyczne: | |||
| P-1000'pipety automatyczne: | |||
| Kamera i transiluminator | |||
| Aparatura E-Gel | Invitrogen | G6000-08 | |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 | |
| Axygen 1,7 ml. Przezroczyste | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT175C | |
| przezroczyste probówki Axygen 0,5 ml | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT060C | |
| probówki do wychwytywania Axygen 2 ml | Krackeler Scientific, Inc. | 383-MCT200NC | |
| pudełka z końcówkami P-10 ART: | CLP | BT10XL | |
| Pudełka z końcówkami P-100 ART: | CLP | BT200 | |
| Pudełka z końcówkami P-20 ART: | CLP | BT20 | |
| Pudełka z końcówkami ART do pipety P-1000: | CLP | BT1000 | |
| Chipsy drożdżowe | |||
| sterylne jednorazowe pipety 25 ml- | |||
| sterylne jednorazowe pipety 5 ml | |||
| Statywy na probówki do mikrowirówki | |||
| chusteczki KimWipes: | |||
| Fartuchy laboratoryjne | |||
| Mieszadła magnetyczne | |||
| Kolby hodowlane | |||
| Pętliki do szczepień | |||
| markery permanentne | |||
| Rękawiczki | |||
| Taśma autoklawowa | |||
| Mieszadła magnetyczne | |||
| 30% nadtlenek wodoru |  EMD Millipore | 386790 | |
| HBSS bez Ca, Mg i barwnika | Sigma-Aldrich | H6648-100ml | |
| Zestaw Qiagen RNeasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 | |
| Zestaw Qiagen DNase: | Qiagen | 79254 | |
| Środek do usuwania RNazy | Denville Scientific | D1180 | |
| Alkohol Harleco 100% | EMD Millipore | 65347 | |
| Zestaw ENZO IVT | Enzo Life Sciences | ENZ-42655-10 | |
| Litykaza: jedna butelka | VWR international | IC19012310 | |
| Woda, stopień do hodowli komórkowych | EMD Millipore | 4.86505 | |
| Kultura drożdży: | ATCC | 18824 | |
| proszek do pożywki YPD | EMD Millipore | 4.8504 | |
| D(+) glukoza, bezwodna | EMD Millipore | 346351 | |
| Sorbitol | EMD Millipore | 56755 | |
| EDTA | EMD Millipore | 4005 | |
| roztwór SDS, 20% | EMD Millipore | 7990-OP | |
| Farba do pelletów | EMD Millipore | 69049 | |
| PCI wolny od RNaz i DNaz (7 alikwotów): | Fisher Scientific | AC32711-500 | |
| 7,5M NH4OAc | Fisher Scientific | ICN1987 5980 | |
| Bufor do fragmentacji (200 mM Tris-octan, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | |||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 | |
| KOAc | Fisher Scientific | NC9757725 | |
| MgOA | Fisher Scientific | NC9681042 | |
| Barwnik do nakładania próbek | Invitrogen | 10482055 | |
| Markery PCR | EMD Millipore | 69278-3 | |
| Żele Phase Lock | Fisher Scientific | FP2302820 | |
| Zestaw do jednocyklowej syntezy cDNA | Invitrogen | A10752-030 | |
| Zawiera: | |||
| Polimeraza DNA E. coli | |||
| dNTP's | |||
| T4 DNA polimeraza | |||
| oligod(T) T-7 | |||
| 0,5 ml EDTA pH 8,0 | |||
| Bufor do syntezy pierwszej nici | |||
| RNaza H z E. coli | |||
| Bufor do syntezy drugiej nici | |||
| Ligaza DNA z E. coli | |||
| SuperScript II | |||
| DTT |
Bibliografia
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. Microarray Outreach. , (2008).
- Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
Przedruki i uprawnienia
