Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Podsumowanie

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Streszczenie

Spektroskopia Ramana jest często utrudniana przez silne tło fluorescencyjne, szczególnie w przypadku próbek biologicznych. Jeśli próbka jest wzbudzana serią ultrakrótkich impulsów, system zdolny do czasowej separacji sygnałów nakładających się widmowo w skali pikosekund może wyizolować szybko docierające światło rozproszone Ramanowsko od później docierającego światła fluorescencyjnego. W niniejszym opracowaniu omawiamy budowę i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje przełączanie całkowicie optyczne w formie niskomocowej bramki Kerra do izolacji sygnałów Ramana i fluorescencji. Pojedynczy laser 808 nm o średniej mocy 2,4 W i częstotliwości repetycji 80 MHz jest dzielony, przy czym około 200 mW światła 808 nm jest konwertowane do < 5 mW światła 404 nm kierowanego do próbki w celu wzbudzenia rozpraszania Ramanowskiego. Pozostałe niekonwertowane światło 808 nm jest następnie kierowane do ośrodka nieliniowego, gdzie pełni rolę pompy dla całkowicie optycznej migawki. Migawka otwiera się i zamyka w czasie 800 fs z maksymalną wydajnością wynoszącą około 5%. Dzięki temu systemowi jesteśmy w stanie skutecznie oddzielić sygnały Ramana i fluorescencji przy częstotliwości repetycji 80 MHz, stosując energie impulsów i średnie moce, które pozostają bezpieczne biologicznie. Ponieważ system nie posiada zapasu mocy optycznej, szczegółowo opisujemy kilka kwestii projektowych i kwestii związanych z ustawianiem, które pomagają w maksymalizacji przepustowości układu. Omawiamy również nasz protokół uzyskiwania nakładania się przestrzennego i czasowego wiązek sygnałowej oraz pompy w ośrodku Kerra, a także szczegółowy protokół akwizycji widmowej. Na koniec przedstawiamy kilka reprezentatywnych wyników widm Ramana uzyskanych w obecności silnej fluorescencji przy użyciu naszego systemu bramkowania czasowego.

Protokół

1. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania i umieszczania próbki do analizy Ramana w tym systemie.

1. Ponieważ system zazwyczaj wykorzystuje obiektywy o bardzo wysokiej aperturze numerycznej i bardzo krótkich odległościach roboczych, próbki umieszcza się na lamellce. Próbki biologiczne zazwyczaj umieszcza się na lamellce o grubości No. 1 zamontowanej w komorze Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Próbki w formie ciekłej, zwłaszcza te toksyczne dla ludzi, umieszcza się w małej szklanej buteleczce z lamellką przyklejoną do otworu za pomocą silikonowej żywicy epoksydowej. Następnie buteleczkę odwraca się do pomiaru.
3. Ze względu na to, że nasz system opiera się na precyzyjnym czasie trwania impulsów pompowych i sygnałowych, nie możemy korzystać z konwencjonalnej regulacji ostrości naszego mikroskopu, która przesuwa obiektyw w górę i w dół. Powoduje to zmianę długości drogi optycznej w systemie. Zamiast tego umieszczamy próbki na dodatkowym stoliku zamontowanym na górze stolika mikroskopowego, który posiada niezależną regulację ostrości.

2. W celu zarejestrowania czasowo bramkowanych widm Ramanowskich, wiązka wzbudzająca musi zostać odpowiednio przygotowana.

1. Wyjściowym źródłem światła jest 2,4 W strojony impulsowy laser Ti:Szafir (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Każdy impuls w pociągu impulsów o częstotliwości 80 MHz posiada energię 30 nJ, szerokość czasową 140 fs oraz widmo centrowane na 808 nm z szerokością spektralną ok. 6 nm.
2. Aby zapobiec powrotowi odbić do wnęki laserowej, światło przechodzi przez izolator Faradaya. Płytka półfalowa umieszczona przed izolatorem Faradaya umożliwia ciągłe strojenie całkowitej mocy wprowadzanej do układu.
3. Ponieważ szerokość pasma 6 nm jest zbyt duża, aby rozdzielić większość modów Ramana, wiązka jest kierowana przez bardzo wąski (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) filtr pasmowy centrowany na 808 nm.
4. Światło jest następnie ogniskowane przez dublet achromatyczny (f = 100 mm) na kryształ β-boranu baru (BBO) o grubości 5 mm (CASIX, Fuzhou, Fujian, P. R. China) w celu skrócenia długości fali z 808 nm do 404 nm. Kryształ BBO jest umieszczony w uchwycie z regulacją nachylenia (tip i tilt), a także zamontowany na stole translacyjnym. Aby zmaksymalizować wydajność konwersji długości fali, kryształ musi być umieszczony precyzyjnie symetrycznie względem ogniska dubletu, a jego oś krystaliczna musi być wyrównana z polaryzacją wiązki wejściowej.
5. Ponieważ wydajność konwersji długości fali zależy od polaryzacji, kontrolę nad ilością światła kierowanego na próbkę można uzyskać poprzez umieszczenie drugiej płytki półfalowej za izolatorem Faradaya. Poprzez obracanie tej płytki można regulować natężenie światła docierającego do próbki niezależnie od natężenia wiązki pompowania (omówionej poniżej).
6. Światło o przekonwertowanej długości fali jest ponownie kolimowane przez drugi dublet achromatyczny (f = 500 mm) dobrany tak, aby wiązka wyjściowa była wystarczająco duża, by wypełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopowego, a następnie kierowane do mikroskopu odwróconego (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) za pomocą dwóch luster sterujących.
7. Obiektyw mikroskopowy, będący elementem optycznym znajdującym się w najbardziej monolitycznej części układu, definiuje oś optyczną. Aby wyrównać wiązkę wzbudzenia do tej osi, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Następnie iteracyjnie reguluje się dwa lustra sterujące, obserwując wstecznie odbitą wiązkę laserową na kamerze CCD (μEye, IDS, Obersulm, Niemcy) podłączonej do portu obrazowania mikroskopu. Przy założeniu, że obraz na kamerze jest wycentrowany w polu widzenia mikroskopu, wiązka znajduje się na osi, gdy plamka ogniskowa jest wyśrodkowana na matrycy mikroskopu, a przesunięcie obiektywu wzdłuż osi z nie zmienia punktu środkowego rozogniskowanej wiązki.
8. Gdy w płaszczyźnie próbki zostanie umieszczona próbka i naświetlona światłem laserowym, dochodzi do rozpraszania Ramanowskiego. Filtr dichroiczny umieszczony pod obiektywem mikroskopowym oddziela przesunięte w długości fali światło rozproszone Ramanowsko (oraz fluorescencję) od wiązki wzbudzenia, kierując światło rozproszone Ramanowsko do bocznego portu mikroskopu. Mikroskop został zmodyfikowany poprzez usunięcie wszystkich soczewek na tej drodze, tak aby światło sygnałowe opuszczało mikroskop w sposób skolimowany.
9. Ponieważ wiązka sygnałowa opuszczająca mikroskop jest większa niż apertura polaryzatorów Glana-Thompsona, do zwężenia wiązki stosuje się teleskop 0,47x zbudowany z dwóch dubletów achromatycznych (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm).
10. Światło sygnałowe jest następnie polaryzowane przez polaryzator Glana-Thompsona zorientowany pod kątem 0° względem pionu w układzie współrzędnych laboratorium i kierowane do lustra dichroicznego, gdzie zostaje ponownie połączone z wiązką pompowania.

3. Aby bramka optyczna działała z maksymalną wydajnością, należy również zachować należytą staranność podczas przygotowania wiązki pompowanej (wiązki Kerra).

1. Impuls pompy jest najpierw powiększany 0,35x za pomocą teleskopu zbudowanego z dwóch dubletów achromatycznych (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm), aby dopasować go do końcowego rozmiaru wiązki sygnałowej.
2. Wiązka pompy jest następnie kierowana do linii opóźniającej składającej się z pryzmatu prostokątnego umieszczonego na liniowym stole translacyjnym, który można regulować, aby zapewnić nakładanie się w czasie impulsów pompy i sygnału (regulacja zostanie omówiona poniżej).
3. Po linii opóźniającej wiązka przechodzi przez płytkę półfalową i polaryzator ustawiony pod kątem 45° względem pionu w układzie laboratoryjnym. Zapewnia to właściwy stan polaryzacji wiązki pompy w momencie dotarcia do ośrodka nieliniowego.
4. Światło jest następnie odbijane od dwóch luster kierujących, z których jedno posiada sterowanie piezoelektryczne; służą one do precyzyjnej regulacji pozycji wiązki pompy w taki sposób, aby nakładała się ona przestrzennie z wiązką sygnałową. Nakładanie się uzyskuje poprzez obserwację wiązek pompy i sygnału w dwóch punktach: jednym blisko, a drugim daleko od lustra dichroicznego, w którym wiązki są łączone. Wykorzystując pierwsze lustro kierujące do nałożenia obu wiązek w punkcie bliskim oraz lustro piezoelektryczne do nałożenia wiązek w punkcie dalekim, można sprawić, aby wiązka pompy była dokładnie współosiowa z wiązką sygnałową.
5. Po połączeniu obu wiązek, bramka Kerra oraz układ detekcji są konfigurowane w celu maksymalizacji zbieranego sygnału z bramkowaniem czasowym.

4. Po połączeniu obu wiązek, bramka Kerra oraz układ detekcji zostają skonfigurowane w celu maksymalizacji zbieranego sygnału bramkowanego w czasie.

1. Wiązki pompowania i sygnałowe są najpierw przepuszczane przez filtr dichroiczny o gęstości optycznej OD = 6 przy 404 nm, aby zapobiec wzbudzeniu rozproszenia Ramanowskiego w ośrodku nieliniowym przez resztkowe światło wzbudzenia.
2. Następnie obie wiązki, pompowania i sygnałowa, są ogniskowane przez achromatyczny dublet (f = 35 mm) do kwarcowej kuwety o długości drogi optycznej 1 cm zawierającej materiał nieliniowy. W tym celu można wykorzystać dowolny materiał nieliniowy o odpowiednio wysokim współczynniku nieliniowości (wyższym niż dla CS₂) i odpowiednio krótkim czasie odpowiedzi czasowej (<2 ps). W tych eksperymentach stosujemy dwusiarczek węgla, CS₂, który posiada współczynnik nieliniowości n₂ = 3.1 x 10⁻¹⁸ m²/W. Światło jest następnie ponownie kolimowane przez drugi dublet o ogniskowej identycznej z pierwszym.
3. Wiązki przechodzą następnie przez analizator Glana-Thompsona na obrotowym uchwycie, a następnie przez zestaw filtrów absorpcyjnych i interferencyjnych, które łącznie mają OD = 10 przy 808 nm.
4. Na koniec światło sygnałowe jest ogniskowane przez achromatyczny dublet (f = 35 mm) do 50 μm wielomodowego światłowodu, który jest zamontowany w stoliku umożliwiającym przesuwanie w osiach x, y i z. Światłowód jest następnie sprzężony z komercyjnym spektrografem obrazującym z dołączoną kamerą CCD (odpowiednio SP2300i i Pixis 100B, oba urządzenia wyprodukowane przez Princeton Instruments, Trenton, NJ).
5. W celu dopasowania układu detekcji dla maksymalizacji zbieranego sygnału, analizator ustawia się na 0°, a w płaszczyźnie próbki umieszcza się próbkę testową toluenu. Poprzez regulację sterowników x, y i z uchwytu światłowodu optymalizuje się zbierany sygnał Ramanowski.
6. Aby zapewnić prawidłowe nakładanie się w przestrzeni i czasie wiązki pompowania oraz wiązki sygnałowej, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Filtr 404 nm zostaje usunięty z układu. Przy analizatorze obróconym o 90° odbita wiązka 404 nm jest kierowana do spektrografu, a jej intensywność jest regulowana tak, aby nie nasycić kamery. Przy wyłączonej wiązce pompowania analizator jest obracany w celu zminimalizowania transmitowanego sygnału 404 nm. Po ponownym włączeniu wiązki pompowania, stopień opóźnienia jest powoli dostrajany, aż do momentu, gdy transmisja światła 404 nm zacznie wzrastać. Następnie, poprzez iteracyjne dostrajanie stopnia opóźnienia, lustra piezoelektrycznego oraz sterowników x, y i z światłowodu, maksymalizuje się sygnał.
7. Ponieważ odbita wiązka 404 nm i światło rozproszone Ramanowsko mogą przebiegać nieco innymi ścieżkami w układzie, końcowe korekty wykonuje się poprzez umieszczenie silnego rozpraszacza Ramanowskiego (takiego jak toluen) na stoliku z próbką i delikatne dostrojenie ustawień poprzez zmianę stopnia opóźnienia, lustra piezoelektrycznego oraz sterowników x, y i z światłowodu w celu optymalizacji sygnału Ramanowskiego.

5. Zebranie pojedynczego widma Ramana z bramowaniem czasowym wymaga akwizycji kilku widm w celu skorygowania artefaktów systemowych.

1. Przy analizatorze ustawionym na 0°, włączonej wiązce wzbudzającej i wyłączonej wiązce pompującej, rejestrowane jest widmo „niebramkowane” (ungated), reprezentujące widmo, które zostałoby uzyskane bez zastosowania systemu bramkowania czasowego.
2. Przy analizatorze ustawionym na 90°, przy wciąż wyłączonej wiązce wzbudzającej i wiązce pompującej, rejestrowane jest widmo tła, reprezentujące ilość światła rozproszonego przenikającego przez polaryzatory i inne elementy systemu.
3. Przy analizatorze pozostającym w ustawieniu 90° i wszystkich włączonych wiązkach, rejestrowane jest widmo „bramkowane” (gated), reprezentujące światło rozproszone Ramanowsko, które dzięki obecności wiązki pompującej przenika przez skrzyżowane polaryzatory.
4. Na koniec, przy analizatorze wciąż ustawionym na 90°, wyłączonej wiązce wzbudzającej i włączonej wiązce pompującej, rejestrowane jest drugie widmo tła, reprezentujące udział pozostałości światła o długości 808 nm wpadającego do spektrografu w widmie „bramkowanym”.
5. Dodatkowo, przy wszystkich wyłączonych laserach, rejestrowane jest widmo charakteryzujące podstawowy poziom sygnału „ciemnego” kamery i elektroniki.
6. Ponieważ widma często wymagają długich czasów integracji, konieczne jest podzielenie tego czasu na kilka części (klatek), aby umożliwić prawidłową korekcję promieniowania kosmicznego – częstego problemu podczas pozyskiwania danych w przedziałach czasowych wynoszących kilka minut.

6. Po pozyskaniu danych warto przeprowadzić kilka etapów przetwarzania w celu poprawy ich jakości i wyglądu.

1. W pierwszej kolejności wszystkie widma są korygowane o prąd ciemny poprzez odjęcie widma „ciemnego”.
2. Aby skorygować wpływ promieniowania kosmicznego, kilka klatek stanowiących jedną akwizycję jest porównywanych ze sobą piksel po pikselu. Jeśli wartość dowolnego piksela w dowolnej klatce wykracza poza zakres 2 odchyleń medianowych od wartości mediany dla tego piksela we wszystkich klatkach, wartość tego piksela zostaje zastąpiona wartością mediany obliczoną dla wszystkich klatek.
3. Klatki skorygowane o promieniowanie kosmiczne są następnie uśredniane i wygładzane za pomocą filtra Savitzky'ego-Golaya ¹.
4. Aby wyodrębnić „prawdziwe” widmo bramkowane, od zmierzonego widma bramkowanego odejmuje się widma „wyłącznie wzbudzenia” oraz „wyłącznie pompy”.
5. Na koniec widma bramkowane i niebramkowane są korygowane o tło poprzez odjęcie wielomianu 5^go stopnia, wyznaczonego metodą Liebera i Mahadevan-Jansen ².

7. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Schemat systemu bramkowania Kerra. Ścieżka wiązki pompującej zaznaczona jest kolorem czerwonym, natomiast ścieżka SHG kolorem niebieskim. Ścieżka, na której nakładają się sygnały Ramana i fluorescencji, zaznaczona jest kolorem zielonym, a ścieżka, na której fluorescencja została odfiltrowana czasowo, kolorem żółtym. Skróty: BPF, filtr pasmowy; CCD, urządzenie sprzężonych ładunków; DCM, lustro dichroiczne; FI, izolator Faradaya; λ/2, płytka półfalowa; LPF, filtr długoprzepustowy; NLM, ośrodek nieliniowy; P, polaryzator; SHG, kryształ generowania drugiej harmonicznej.

Rysunek 2. Góra: Surowe widma kumaryny rozpuszczonej w oleju immersyjnym. Czerwona krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy otwartej bramce (analizator ustawiony na maksymalną transmisję). Czarna krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy analizatorze ustawionym na minimalną transmisję i zastosowaniu wiązki pompującej (widmo bramkowane). Niebieska krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy analizatorze ustawionym na minimalną transmisję bez zastosowania wiązki pompującej (bramka zamknięta). Zielona krzywa przedstawia widmo zarejestrowane przy zastosowaniu wyłącznie wiązki pompującej. Magenta przerywane linie wskazują obszar widmowy przedstawiony na panelu poniżej. Wszystkie widma zostały wygładzone za pomocą 11-punktowego filtra Savitzky'ego-Golaya 3. rzędu. Dół: Widma kumaryny rozpuszczonej w oleju immersyjnym po odjęciu tła fluorescencyjnego. Czerwona krzywa to widmo przy otwartej bramce, a niebieska krzywa to widmo bramkowane. Widmo bramkowane wyraźnie pokazuje splotowy pik przy wysokich liczbach falowych charakterystyczny dla olejów.

Dyskusja

Dziedzina biomedycznej spektroskopii Ramanowskiej wzbudza coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat dzięki wykazanemu potencjałowi w rozwiązywaniu wielu trudnych problemów w diagnostyce biologicznej. Na przykład wykazano, że widma Ramanowskie mają wartość diagnostyczną w wykrywaniu nowotworów ^{3, 4, 5, 6}. Spektroskopia Ramanowska była również wykorzystywana do oznaczania ilości bakterii ^{7, 8} oraz badania odpowiedzi bakterii na leki ⁹. Znalazła ona zastosowanie w szerokim za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Soczewki	Thorlabs Inc.	Różne	Wszystkie soczewki powlekane w celu uzyskania maksymalnych strat transmisji na poziomie 1% każda
Strojalny laser Ti:Szafir	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
Obiektyw imersyjny 40X	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
Mikroskop odwrócony	Olympus Corporation	IX-71	Zmodyfikowany poprzez usunięcie wszystkich soczewek w porcie bocznym
Płytka półfalowa	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
Polaryzator Glana-Thompsona	Thorlabs Inc.	GTH10M	∼10% straty transmisji
Spektrometr	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
Oprogramowanie matematyczne	Mathworks	MATLAB	wersja 2008a
Izolator Faradaya	EOT	BB8-5I
Lustro piezoelektryczne	Newport Corp.	AG-M100
Kryształ BBO	CASIX	na zamówienie	grubość 1 mm
Filtr pasmowy 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Lustro dichroiczne	Semrock	FF662-FDI01	krawędź pasma przy 662 nm
Filtr długoprzepustowy	Semrock	BLP01-405R	krawędź pasma przy 417 nm
Filtr pasmowy 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS2	Sigma-Aldrich	335266	czystość 99%
Kumaryna 30	Sigma-Aldrich	546127	czystość 99%
Olej imersyjny	Cargill Labs	16242	Typ DF