Eliminacja tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

Podsumowanie

Omówiono konstrukcję i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje ultraszybkie przełączanie całkowicie optyczne do izolacji sygnałów Ramanowskich od sygnałów fluorescencyjnych. Dzięki zastosowaniu tego układu możliwe jest skuteczne rozdzielenie sygnałów Ramanowskich i fluorescencyjnych przy użyciu energii impulsów oraz mocy średniej, które pozostają bezpieczne biologicznie.

Streszczenie

Spektroskopia Ramana jest często utrudniana przez silne tło fluorescencyjne, szczególnie w przypadku próbek biologicznych. Jeśli próbka jest wzbudzana serią ultrakrótkich impulsów, system zdolny do czasowej separacji sygnałów nakładających się widmowo w skali pikosekund może wyizolować szybko docierające światło rozproszone Ramanowsko od później docierającego światła fluorescencyjnego. W niniejszym opracowaniu omawiamy budowę i działanie złożonego nieliniowego układu optycznego, który wykorzystuje przełączanie całkowicie optyczne w formie niskomocowej bramki Kerra do izolacji sygnałów Ramana i fluorescencji. Pojedynczy laser 808 nm o średniej mocy 2,4 W i częstotliwości repetycji 80 MHz jest dzielony, przy czym około 200 mW światła 808 nm jest konwertowane do < 5 mW światła 404 nm kierowanego do próbki w celu wzbudzenia rozpraszania Ramanowskiego. Pozostałe niekonwertowane światło 808 nm jest następnie kierowane do ośrodka nieliniowego, gdzie pełni rolę pompy dla całkowicie optycznej migawki. Migawka otwiera się i zamyka w czasie 800 fs z maksymalną wydajnością wynoszącą około 5%. Dzięki temu systemowi jesteśmy w stanie skutecznie oddzielić sygnały Ramana i fluorescencji przy częstotliwości repetycji 80 MHz, stosując energie impulsów i średnie moce, które pozostają bezpieczne biologicznie. Ponieważ system nie posiada zapasu mocy optycznej, szczegółowo opisujemy kilka kwestii projektowych i kwestii związanych z ustawianiem, które pomagają w maksymalizacji przepustowości układu. Omawiamy również nasz protokół uzyskiwania nakładania się przestrzennego i czasowego wiązek sygnałowej oraz pompy w ośrodku Kerra, a także szczegółowy protokół akwizycji widmowej. Na koniec przedstawiamy kilka reprezentatywnych wyników widm Ramana uzyskanych w obecności silnej fluorescencji przy użyciu naszego systemu bramkowania czasowego.

Protokół

1. Należy zachować ostrożność podczas przygotowywania i umieszczania próbki do analizy Ramana w tym systemie.

1. Ponieważ system zazwyczaj wykorzystuje obiektywy o bardzo wysokiej aperturze numerycznej i bardzo krótkich odległościach roboczych, próbki umieszcza się na szkiełku nakrywkowym. Próbki biologiczne zazwyczaj umieszcza się na szkiełku nakrywkowym o grubości No. 1, zamontowanym w komorze Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Próbki w formie ciekłej, zwłaszcza te toksyczne dla ludzi, umieszcza się w małej szklanej buteleczce, w której otwór został zaklejony szkiełkiem nakrywkowym za pomocą silikonowej żywicy epoksydowej. Buteleczkę następnie odwraca się do góry dnem w celu wykonania pomiaru.
3. Z uwagi na to, że nasz system opiera się na precyzyjnym czasie trwania impulsów pompowych i sygnałowych, nie możemy korzystać z konwencjonalnej regulacji ostrości mikroskopu, która przesuwa obiektyw w górę i w dół. Powodowałoby to zmianę długości drogi optycznej w systemie. Zamiast tego próbki umieszczamy na wtórnym stoliku zamontowanym na górze stolika mikroskopowego, który posiada niezależną kontrolę ostrości.

2. Aby uzyskać widma Ramana z bramowaniem czasowym, wiązka wzbudzająca musi zostać odpowiednio przygotowana.

1. Rozpoczynamy od światła emitowanego przez 2,4 W strojony impulsowy laser Ti:Saph (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Każdy impuls w pociągu impulsów o częstotliwości 80 MHz posiada energię 30 nJ, szerokość czasową 140 fs oraz widmo centrowane na 808 nm z szerokością widmową ~6 nm.
2. Aby zapobiec powrotowi odbić do rezonatora lasera, światło przechodzi przez izolator Faradaya. Płytka półfalowa umieszczona przed izolatorem Faradaya pozwala na ciągłe strojenie całkowitej mocy przesyłanej do układu.
3. Ponieważ szerokość pasma 6 nm jest zbyt duża, aby rozdzielić większość modów Ramana, wiązka jest kierowana przez bardzo wąski (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) filtr pasmowoprzepustowy centrowany na 808 nm.
4. Światło jest następnie ogniskowane przez achromatyczny dublet (f = 10 mm) na krystal boranu beta-baru (BBO) o grubości 5 mm (CASIX, Fuzhou, Fujian, P. R. China), aby zmniejszyć długość fali z 808 nm do 404 nm. Kryształ BBO umieszczony jest w uchwycie z regulacją kąta nachylenia i obrotu oraz zamontowany na stole pozycjonującym. Aby zmaksymalizować wydajność konwersji długości fali, kryształ musi być umieszczony precyzyjnie symetrycznie względem ogniska dubletu, a jego oś krystalograficzna musi być wyrównana z polaryzacją wiązki wejściowej.
5. Ponieważ wydajność konwersji długości fali zależy od polaryzacji, kontrolę nad ilością światła kierowanego na próbkę można uzyskać poprzez umieszczenie drugiej płytki półfalowej za izolatorem Faradaya. Poprzez obrót tej płytki można regulować natężenie światła przesyłanego do próbki niezależnie od natężenia wiązki pompującej (omówionej poniżej).
6. Światło po konwersji długości fali jest ponownie kolimowane przez drugi achromatyczny dublet (f = 500 mm), dobrany tak, aby wychodząca wiązka była wystarczająco duża, by wypełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopu, i jest kierowana do mikroskopu odwróconego (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) za pomocą dwóch luster sterujących.
7. Obiektyw mikroskopu, będący elementem optycznym znajdującym się w najbardziej monolitycznej części układu, definiuje oś optyczną. Aby wyrównać wiązkę wzbudzenia do tej osi, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Następnie iteracyjnie ustawia się dwa lustra sterujące, obserwując odbitą wiązkę laserową na kamerze CCD (μEye, IDS, Obersulm, Niemcy) podłączonej do portu obrazowania mikroskopu. Zakładając, że obraz na kamerze jest wycentrowany w polu widzenia mikroskopu, wiązka znajduje się na osi, gdy plamka ogniskowa jest wycentrowana na matrycy mikroskopu, a przesunięcie obiektywu wzdłuż osi z nie zmienia punktu centralnego rozogniskowanej wiązki.
8. Gdy próbka zostanie umieszczona w płaszczyźnie próbki i naświetlona światłem laserowym, następuje rozpraszanie Ramanowskie. Filtr dichroiczny umieszczony pod obiektywem mikroskopu oddziela przesunięte w długości fali światło rozproszone Ramanowsko (oraz fluorescencję) od wiązki wzbudzenia, kierując rozproszone światło Ramanowskie do bocznego portu mikroskopu. Mikroskop został zmodyfikowany poprzez usunięcie wszystkich soczewek z tej ścieżki, tak aby światło sygnałowe opuszczało mikroskop w formie skolimowanej.
9. Ponieważ wiązka sygnałowa wychodząca z mikroskopu jest większa niż apertura polaryzatorów Glana-Thompsona, do zmniejszenia wiązki użyto teleskopu 0,47x zbudowanego z dwóch achromatycznych dubletów (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm).
10. Światło sygnałowe jest następnie polaryzowane przez polaryzator Glana-Thompsona zorientowany pod kątem 0° względem pionu w układzie laboratoryjnym i kierowane na lustro dichroiczne, gdzie zostaje ponownie połączone z wiązką pompującą.

3. Aby bramka optyczna pracowała z maksymalną wydajnością, należy zachować szczególną staranność również podczas przygotowania wiązki pompy (wiązki Kerra).

1. Impuls pompy jest najpierw powiększany 0,35x za pomocą teleskopu zbudowanego z dwóch dubletów achromatycznych (f1 = 35 mm, f2 = 10 mm), aby dopasować go do końcowego rozmiaru wiązki sygnałowej.
2. Wiązka pompy jest następnie kierowana do linii opóźniającej składającej się z pryzmatu prawokątnego umieszczonego na liniowym stole przesuwnym, który można regulować, aby zapewnić czasowe nakładanie się impulsów pompy i sygnału (regulacja zostanie omówiona poniżej).
3. Po linii opóźniającej wiązka przechodzi przez płytkę półfalową i polaryzator zorientowany pod kątem 45° względem pionu w układzie współrzędnych laboratorium. Zapewnia to odpowiedni stan polaryzacji wiązki pompy w momencie dotarcia do ośrodka nieliniowego.
4. Światło jest następnie odbijane od dwóch luster kierujących, z czego jedno posiada sterowanie piezoelektryczne; służą one do precyzyjnej regulacji położenia wiązki pompy w taki sposób, aby nakładała się ona przestrzennie z wiązką sygnałową. Nakładanie się uzyskuje poprzez obserwację wiązek pompy i sygnału w dwóch punktach: jednym blisko i jednym daleko od lustra dichroicznego, w którym wiązki są łączone. Wykorzystując pierwsze lustro kierujące do zgrania obu wiązek w punkcie bliskim oraz lustro piezoelektryczne do zgrania wiązek w punkcie dalekim, można uzyskać dokładną kolinearność wiązki pompy z wiązką sygnałową.
5. Po połączeniu obu wiązek, bramka Kerra oraz system detekcji są konfigurowane tak, aby zmaksymalizować zbierany sygnał bramkowany w czasie.

4. Po połączeniu obu wiązek, bramka Kerra oraz system detekcji są ustawiane w celu maksymalizacji zebranego sygnału z bramowaniem czasowym.

1. Wiązki pompy i sygnału przechodzą najpierw przez filtr dichroiczny o gęstości optycznej OD = 6 przy 400 nm, aby zapobiec wzbudzaniu rozpraszania Ramanowskiego w ośrodku nieliniowym przez resztkowe światło wzbudzenia.
2. Następnie obie wiązki, pompa i sygnał, są ogniskowane przez dublet achromatyczny (f = 35 mm) do kwarcowej kuwety o długości drogi optycznej 1 cm, zawierającej materiał nieliniowy. W tym celu można wykorzystać dowolny materiał nieliniowy o odpowiednio wysokim współczynniku nieliniowości (wyższym niż w przypadku CS₂) i odpowiednio krótkim czasie odpowiedzi czasowej (<2 ps). W tych eksperymentach stosujemy dwusiarczek węgla, CS₂, który posiada współczynnik nieliniowości n₂ = 3.1 x 10⁻¹⁸ m²/W. Światło jest następnie rekolimowane przez drugi dublet o długości ogniskowej identycznej z pierwszym.
3. Wiązki przechodzą następnie przez analizator Glana-Thompsona na obrotowym uchwycie, a potem przez zestaw filtrów absorpcyjnych i interferencyjnych, które łącznie mają gęstość optyczną OD = 10 przy 808 nm.
4. Na koniec światło sygnału jest ogniskowane przez dublet achromatyczny (f = 35 mm) do wielomodowego światłowodu o średnicy 50 μm, przy czym światłowód jest zamontowany w uchwycie umożliwiającym przesunięcia w osiach x, y i z. Światłowód jest następnie sprzęgany z komercyjnym spektrografem obrazującym z dołączoną kamerą CCD (odpowiednio SP230i oraz Pixis 10B, oba urządzenia wyprodukowane przez Princeton Instruments, Trenton, NJ).
5. Aby dostroić układ detekcji w celu maksymalizacji zbieranego sygnału, analizator ustawia się pod kątem 0° i w płaszczyźnie próbki umieszcza się próbkę testową toluenu. Poprzez regulację osi x, y i z uchwytu światłowodu optymalizuje się zbierany sygnał Ramanowski.
6. Aby zapewnić prawidłowe nakładanie się przestrzenne i czasowe wiązek pompy oraz sygnału, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Z układu usuwa się filtr 404 nm. Przy analizatorze obróconym do 90° odbita wiązka 404 nm jest kierowana do spektrografu, a jej intensywność jest tak dostosowana, aby nie nasycać kamery. Przy wyłączonej wiązce pompy analizator jest obracany w celu zminimalizowania transmitowanego sygnału 404 nm. Po ponownym włączeniu wiązki pompy powoli reguluje się stopień opóźnienia, aż do momentu, gdy transmisja światła 404 nm zaczyna wzrastać. Następnie, poprzez iteracyjną regulację stopnia opóźnienia, lustra piezoelektrycznego oraz osi x, y i z światłowodu, maksymalizuje się sygnał.
7. Ponieważ odbita wiązka 404 nm i rozproszone światło Ramanowskie mogą przebiegać nieco różnymi drogami w układzie, końcowe korekty wykonuje się, umieszczając silny rozpraszacz Ramanowski (np. toluen) na stoliku z próbką i delikatnie korygując ustawienia poprzez zmianę stopnia opóźnienia, lustra piezoelektrycznego oraz osi x, y i z światłowodu w celu optymalizacji sygnału Ramanowskiego.

5. Pozyskanie pojedynczego widma Ramana z bramowaniem czasowym wymaga zarejestrowania kilku widm w celu skorygowania artefaktów systemowych.

1. Przy ustawieniu analizatora na 0°, włączonej wiązce wzbudzającej i wyłączonej wiązce pompowącej, rejestrowane jest widmo „bez bramkowania” (ungated), reprezentujące widmo, które uzyskano by bez zastosowania systemu bramkowania czasowego.
2. Przy ustawieniu analizatora na 90°, przy wciąż wyłączonej wiązce wzbudzającej i wiązce pompowącej, rejestrowane jest widmo tła, reprezentujące ilość światła rozproszonego przedostającego się przez polaryzatory i inne elementy układu.
3. Przy analizatorze pozostającym w pozycji 90° i wszystkich włączonych wiązkach, rejestrowane jest widmo „bramkowane” (gated), reprezentujące światło rozproszone Ramanowsko, które przeniknęło przez skrzyżowane polaryzatory dzięki obecności wiązki pompowącej.
4. Na koniec, przy analizatorze wciąż ustawionym na 90°, wyłączonej wiązce wzbudzającej i włączonej wiązce pompowącej, rejestrowane jest drugie widmo tła, reprezentujące udział resztkowych ilości światła o długości 808 nm wnikającego do spektrografu w widmie „bramkowanym”.
5. Dodatkowo, przy wszystkich wyłączonych laserach, rejestrowane jest widmo charakteryzujące podstawowy poziom sygnału „ciemnego” kamery i elektroniki.
6. Ponieważ widma często wymagają długich czasów całkowania, niezbędne jest podzielenie tego czasu na kilka fragmentów (klatek), aby umożliwić właściwą korekcję promieniowania kosmicznego – częstego problemu podczas akwizycji danych trwającej kilka minut.

6. Po pozyskaniu danych pomocne jest przeprowadzenie kilku kroków przetwarzania w celu poprawy ich jakości i wyglądu.

1. W pierwszej kolejności wszystkie widma poddaje się korekcji ciemnej poprzez odjęcie widma „ciemnego”.
2. Aby skorygować wpływ promieniowania kosmicznego, kilka klatek tworzących jedną akwizycję jest porównywanych ze sobą w odniesieniu do każdego piksela. W przypadku każdego piksela w dowolnej klatce, którego wartość wykracza poza zakres dwóch odchyleń medianowych od wartości mediany dla tego piksela we wszystkich klatkach, wartość ta zostaje zastąpiona wartością mediany obliczoną dla wszystkich klatek.
3. Klatki po korekcie promieniowania kosmicznego są następnie uśredniane i wygładzane za pomocą filtra Savitzky’ego-Golaya. ¹.
4. Aby wyodrębnić „prawdziwe” widmo bramkowane, od zmierzonego widma bramkowanego odejmujemy widma „tylko wzbudzenia” oraz „tylko pompowania”.
5. Wreszcie, widma z bramkowaniem i bez bramkowania poddaje się korekcji tła poprzez odjęcie 5^th-rząd wielomianu, wyznaczony metodą Liebera i Mahadevana-Jansena ².

7. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1Schematyczny rysunek układu bramkowania Kerra. Droga wiązki pompowanej zaznaczona jest kolorem czerwonym, natomiast droga SHG kolorem niebieskim. Ścieżka, w której sygnały Ramana i fluorescencja nakładają się na siebie, zaznaczona jest kolorem zielonym, a ścieżka, w której fluorescencja została odfiltrowana czasowo, zaznaczona jest kolorem żółtym. Skróty oznaczają następująco: BPF, filtr pasmowy; CCD, urządzenie ładunkowo-sprzężone; DCM, lustro dichroiczne; FI, izolator Faradaya; λ/2, płytka półfalowa; LPF, filtr długoprzepustowy; NLM, ośrodek nieliniowy; P, polaryzator; SHG, kryształ generowania drugiej harmonicznej.

Rycina 2. Góra: Surowe widma kumaryny rozpuszczonej w oleju imersyjnym. Krzywa czerwona przedstawia widmo uzyskane przy otwartej bramce (analizator ustawiony na maksymalną transmisję). Krzywa czarna przedstawia widmo uzyskane przy analizatorze ustawionym na minimalną transmisję i zastosowaniu wiązki pompowania (widmo bramkowane). Krzywa niebieska przedstawia widmo uzyskane przy analizatorze ustawionym na minimalną transmisję i bez zastosowania wiązki pompowania (bramka zamknięta). Krzywa zielona przedstawia widmo uzyskane przy zastosowaniu wyłącznie wiązki pompowania. Przerywane linie purpurowe wskazują obszar widmowy przedstawiony na panelu poniżej. Wszystkie widma zostały wygładzone za pomocą 1-punktowego filtra Savitzky’ego-Golaya 3. rzędu. Dół: Widma kumaryny rozpuszczonej w oleju imersyjnym po odjęciu tła fluorescencyjnego. Krzywa czerwona to widmo z otwartą bramką, a krzywa niebieska to widmo bramkowane. Widmo bramkowane wyraźnie wykazuje splotowy pik przy wysokich liczbach falowych, charakterystyczny dla olejów.

Dyskusja

Dziedzina biomedycznej spektroskopii Ramanowskiej wzbudza coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatnich kilku lat dzięki wykazanemu potencjałowi w rozwiązywaniu wielu trudnych problemów w diagnostyce biologicznej. Na przykład wykazano, że widma Ramanowskie mają wartość diagnostyczną w wykrywaniu nowotworów ^{3, 4, 5, 6}. Spektroskopia Ramanowska była również wykorzystywana do oznaczania ilości bakterii ^{7, 8} oraz badania odpowiedzi bakterii na leki ⁹. Znalazła ona zastosowanie w szerokim za...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Soczewki	Thorlabs Inc.	Różne	Wszystkie soczewki powlekane w celu uzyskania maksymalnych strat transmisji na poziomie 1% każda
Strojalny laser Ti:Szafir	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
Obiektyw imersyjny 40X	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
Mikroskop odwrócony	Olympus Corporation	IX-71	Zmodyfikowany poprzez usunięcie wszystkich soczewek w porcie bocznym
Płytka półfalowa	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
Polaryzator Glana-Thompsona	Thorlabs Inc.	GTH10M	∼10% straty transmisji
Spektrometr	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
Oprogramowanie matematyczne	Mathworks	MATLAB	wersja 2008a
Izolator Faradaya	EOT	BB8-5I
Lustro piezoelektryczne	Newport Corp.	AG-M100
Kryształ BBO	CASIX	na zamówienie	grubość 1 mm
Filtr pasmowy 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Lustro dichroiczne	Semrock	FF662-FDI01	krawędź pasma przy 662 nm
Filtr długoprzepustowy	Semrock	BLP01-405R	krawędź pasma przy 417 nm
Filtr pasmowy 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS2	Sigma-Aldrich	335266	czystość 99%
Kumaryna 30	Sigma-Aldrich	546127	czystość 99%
Olej imersyjny	Cargill Labs	16242	Typ DF