Odrzucenie tła fluorescencyjnego w rezonansowej i spontanicznej mikrospektroskopii Ramana

1. Należy zachować ostrożność przy przygotowywaniu i umieszczaniu próbki Ramana w tym systemie.

1. Ze względu na to, że system zazwyczaj wykorzystuje obiektywy o bardzo dużej aperturze numerycznej i bardzo krótkich odległościach roboczych, próbki umieszcza się na szkiełku nakrywkowym. Próbki biologiczne są zwykle umieszczane na szkiełku nakrywkowym o grubości nr 1 zamontowanym w komorze komórkowej Attofluor (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Próbki cieczy, szczególnie te toksyczne dla ludzi, umieszcza się w małej szklanej butelce z szkiełkiem nakrywkowym przycementowanym do otworu za pomocą silikonowej żywicy epoksydowej. Butelka jest następnie odwracana w celu pomiaru.
3. Ponieważ nasz system zależy od precyzyjnego taktowania pompy i impulsów sygnałowych, jesteśmy zmuszeni nie korzystać z konwencjonalnej regulacji ostrości naszego mikroskopu, która przesuwa obiektyw w górę i w dół. To dodaje i odejmuje ścieżkę optyczną od naszego systemu. Zamiast tego umieszczamy nasze próbki na wtórnym stoliku zamontowanym na stoliku mikroskopowym, który ma własną niezależną kontrolę ostrości.

2. Aby pobrać bramkowane czasowo widma Ramana, wiązka wzbudzenia musi być odpowiednio przygotowana.

1. Zaczynamy od światła wydobywającego się z przestrajalnego impulsowego lasera Ti:Sapph o mocy 2,4 W (Chameleon, Coherent Systems, Santa Clara, CA). Każdy impuls w ciągu impulsów 80 MHz ma energię 30 nJ, ma szerokość czasową 140 fs i ma widmo wyśrodkowane na 808 nm z szerokością pasma widmowego ~6 nm.
2. Aby zapobiec ponownemu przedostawaniu się odbić wstecznych do wnęki lasera, światło jest przepuszczane przez izolator Faradaya. Półfalowa płytka umieszczona przed izolatorem Faradaya pozwala na ciągłe dostrajanie całkowitej mocy wysyłanej do systemu.
3. Ponieważ 6 nm jest zbyt szerokim pasmem, aby rozwiązać większość modów Ramana, wiązka jest wysyłana przez bardzo wąski (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) filtr pasmowo-przepustowy wyśrodkowany na 808 nm.
4. Światło jest następnie skupiane przez achromatyczny dublet (f = 100 mm) na 5-milimetrowym krysztale boranu β-baru (BBO) (CASIX, Fuzhou, Fujian, PR China) w celu zmniejszenia o połowę długości fali od 808 nm do 404 nm. Kryształ BBO jest umieszczony w uchwycie z regulatorami końcówki i pochylenia, a także zamontowany na stoliku translacyjnym. Aby zmaksymalizować wydajność konwersji długości fali, kryształ musi być umieszczony dokładnie symetrycznie względem ogniska dubletu, a jego oś kryształu musi być wyrównana z polaryzacją przychodzącej wiązki.
5. Ponieważ wydajność konwersji długości fali jest zależna od polaryzacji, kontrolę nad ilością światła wysyłanego do próbki można uzyskać, umieszczając drugą płytkę półfalową za izolatorem Faradaya. Obracając tę płytkę falową, intensywność światła wysyłanego do próbki można regulować niezależnie od intensywności wysyłanej w wiązce pompy (do omówienia poniżej).
6. Światło przekształcone w długość fali jest rekolimowane przez drugi dublet achromatyczny (f = 500 mm) dobrane tak, aby wiązka wychodząca była wystarczająco duża, aby wypełnić tylną aperturę obiektywu mikroskopu, i kierowane do mikroskopu odwróconego (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) za pomocą dwóch lusterek sterujących.
7. Obiektyw mikroskopu, będący elementem optycznym umieszczonym w najbardziej monolitycznym elemencie systemu, określa oś optyczną. Aby ustawić wiązkę wzbudzenia do tej osi, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Dwa zwierciadła sterujące są następnie iteracyjnie dostrajane podczas obserwacji wstecznie odbitej wiązki laserowej na krzywce CCD (μEye, IDS, Obersulm, Niemcy) podłączonej do portu obrazowania mikroskopu. Zakładając, że obraz w kamerze jest wyśrodkowany w polu widzenia mikroskopu, wiązka jest na osi, gdy ognisko jest wyśrodkowane na chipie mikroskopu, a przesunięcie obiektywu wzdłuż osi z nie zmienia punktu środkowego rozogniskowanej wiązki.
8. Gdy próbka jest umieszczana w płaszczyźnie próbki i naświetlana światłem laserowym, następuje rozpraszanie Ramana. Filtr dichroiczny umieszczony pod obiektywem mikroskopu oddziela światło rozproszone Ramana o przesuniętej długości fali (i fluorescencję) od wiązki wzbudzenia, kierując światło rozproszone Ramana do bocznego portu mikroskopu. Mikroskop został zmodyfikowany w taki sposób, aby usunąć wszelkie soczewki znajdujące się na tej ścieżce, tak aby światło sygnalizacyjne wyłaniało się ze skolimowanego mikroskopu.
9. Ponieważ wiązka sygnału wychodząca z mikroskopu jest większa niż przezroczysta apertura polaryzatorów Glana-Thompsona, do obkurczania wiązki stosuje się teleskop 0,47x zbudowany z dwóch achromatycznych dubletów (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm).
10. Światło sygnalizacyjne jest następnie polaryzowane przez polaryzator Glana-Thompsona zorientowany pod kątem 0° w stosunku do pionu w ramie laboratoryjnej i kierowane do lustra dichroicznego, gdzie jest rekombinowane z wiązką pompy.

3. Aby bramka optyczna działała z maksymalną wydajnością, należy również zadbać o przygotowanie belki pompy (wiązki Kerra).

1. Impuls pompy jest najpierw powiększany 0,35x za pomocą teleskopu zbudowanego z dwóch achromatycznych dubletów (f1 = 35 mm, f2 = 100 mm), aby dopasować się do ostatecznego rozmiaru wiązki sygnałowej.
2. Wiązka pompy jest następnie wysyłana do linii opóźniającej składającej się z pryzmatu pod kątem prostym umieszczonego na liniowym stoliku translacyjnym, który można dostroić w celu zapewnienia czasowego nakładania się pompy i impulsów sygnałowych (strojenie zostanie omówione poniżej).
3. Po linii opóźniającej wiązka jest przesyłana przez płytkę półfalową i polaryzator zorientowany pod kątem 45° w stosunku do pionu w ramie laboratoryjnej. Zapewnia to prawidłowy stan polaryzacji belki pompy po dotarciu do ośrodka nieliniowego.
4. Światło jest następnie odbijane od dwóch lusterek kierowniczych, z których jedno jest wyposażone w piezoelektryczne elementy sterujące, które służą do precyzyjnej regulacji położenia belki pompy w taki sposób, aby pokrywała się przestrzennie z wiązką sygnałową. Nakładanie się uzyskuje się poprzez obserwację pompy i wiązek sygnałowych w dwóch miejscach, jednym blisko i jednym daleko od zwierciadła dichroicznego, w którym wiązki są połączone. Używając pierwszego lusterka sterującego do nakładania się dwóch wiązek w bliskim punkcie, a lustra piezoelektrycznego do nakładania się belek w odległym punkcie, wiązka pompy może być dokładnie współliniowa z wiązką sygnałową.
5. Po połączeniu dwóch wiązek bramka Kerra i system odbioru są ustawione tak, aby zmaksymalizować zebrany sygnał bramkowany czasowo.

4. Dzięki połączeniu dwóch wiązek, bramka Kerra i system zbierania są ustawione tak, aby maksymalizować zebrany sygnał bramkowany czasowo.

1. Pompa i wiązki sygnałowe są najpierw przepuszczane przez filtr dichroiczny, który ma średnicę zewnętrzną 6 przy 404 nm, aby zapobiec wzbudzaniu rozpraszania Ramana w ośrodku nieliniowym przez resztkowe światło wzbudzenia.
2. Pompa i wiązka sygnałowa są następnie skupiane za pomocą achromatycznego dubletu (f = 35 mm) w kuwecie kwarcowej o długości 1 cm zawierającej materiał nieliniowy. Można tu wykorzystać każdy materiał nieliniowy o odpowiednio wysokim indeksie nieliniowym (wyższym niż CS₂) i odpowiednio krótkiej odpowiedzi czasowej (<2 ps). Do tych eksperymentów używamy dwusiarczku węgla CS₂ , który ma nieliniowy indeks n₂ = 3,1 x 10⁻¹⁸ m²/W. Światło jest następnie rekolimowane przez drugi dublet o ogniskowej identycznej z pierwszą.
3. Wiązki są następnie przepuszczane przez analizator Glana-Thompsona na obrotowym uchwycie, a następnie przez zestaw filtrów absorpcyjnych i interferencyjnych, które łącznie mają OD 10 przy 808 nm.
4. Na koniec światło sygnalizacyjne jest skupiane przez achromatyczny dublet (f = 35 mm) w światłowodzie wielomodowym 50 μm, gdzie światłowód jest montowany w stoliku umożliwiającym translację w x, y i z. Światłowód jest następnie sprzężony z komercyjnym spektrografem obrazującym z dołączoną kamerą CCD (odpowiednio SP2300i i Pixis 100B, oba produkowane przez Princeton Instruments, Trenton, NJ).
5. Aby dostosować system zbierania w celu maksymalizacji zebranego sygnału, analizator ustawia się na 0°, a próbkę testową toluenu umieszcza się w płaszczyźnie próbki. Dostosowując elementy sterujące x, y i z mocowania światłowodu, zbierany sygnał Ramana jest optymalizowany.
6. Aby zapewnić prawidłowe przestrzenne i czasowe zachodzenie na siebie wiązki pompy i sygnału, w płaszczyźnie próbki mikroskopu umieszcza się lustro. Filtr 404 nm jest usuwany z systemu. Przy analizatorze obróconym o 90° odbita wiązka o długości fali 404 nm jest wysyłana do spektrografu z intensywnością dostosowaną tak, aby nie nasycała kamery. Przy wyłączonej wiązce pompy analizator jest obracany w celu zminimalizowania przesyłanego sygnału 404 nm. Po ponownym włączeniu wiązki pompy stopień opóźniający jest powoli dostrajany, aż transmisja światła 404 nm zacznie się zwiększać. Następnie, poprzez iteracyjne dostrajanie stopnia opóźniającego, zwierciadła piezoelektrycznego oraz elementów sterujących x, y i z światłowodu, maksymalizuje się sygnał.
7. Ponieważ odbita wiązka 404 nm i rozproszone światło Ramana mogą obierać nieco inne ścieżki w systemie, ostateczne korekty są dokonywane poprzez umieszczenie silnego rozpraszacza Ramana (takiego jak toluen) na stoliku próbki i nieznaczne dostosowanie wyrównania poprzez zmianę stopnia opóźniającego, zwierciadła piezeoelektrycznego oraz elementów sterujących x, y i z światłowodu w celu optymalizacji sygnału Ramana.

5. Zbieranie pojedynczego czasowo bramkowanego widma Ramana wymaga nabycia kilku widm w celu skorygowania artefaktów systemu.

1. Gdy analizator jest ustawiony na 0°, wiązka wzbudzenia jest włączona, a wiązka pompy wyłączona, pobierane jest widmo "niezawężone", reprezentujące widmo, które zostałoby uzyskane bez korzystania z systemu bramkowania czasowego.
2. Gdy analizator jest ustawiony na 90°, wiązka wzbudzająca i wiązka pompy są nadal wyłączone, pobierane jest widmo tła, reprezentujące ilość światła rozproszonego przeciekającego przez polaryzatory i inne elementy systemu.
3. Gdy analizator pozostaje pod kątem 90° i wszystkie wiązki są włączone, pobierane jest "bramkowane" widmo, reprezentujące rozproszone światło Ramana przepuszczane przez skrzyżowane polaryzatory przez obecność wiązki pompy.
4. W końcu, gdy analizator nadal znajduje się pod kątem 90°, wiązka wzbudzenia jest wyłączona, a wiązka pompy włączona, pobierane jest drugie widmo tła, reprezentujące udział w widmie "bramkowanym" szczątkowych ilości światła o długości fali 808 nm wchodzących do spektrografu.
5. Dodatkowo pobierane jest widmo przy wyłączonych wszystkich laserach, charakteryzujące podstawowy poziom "ciemnego" sygnału kamery i elektroniki.
6. Ponieważ widma często wymagają długich czasów integracji, konieczne jest podzielenie tego czasu integracji na kilka części (ramek), aby umożliwić właściwą korekcję promieniowania kosmicznego - częsty problem podczas pozyskiwania danych w ciągu kilku minut.

6. Po ich pozyskaniu, kilka etapów przetwarzania jest pomocnych w poprawie jakości i wyglądu danych.

1. Po pierwsze, wszystkie widma są korygowane w ciemności poprzez odjęcie od "ciemnego" widma.
2. Aby skorygować promieniowanie kosmiczne, kilka klatek składających się na jedno akwizycję jest porównywanych ze sobą piksel po pikselu. Dla każdego piksela w dowolnej klatce, który wykracza poza 2 mediany odchyleń od mediany wartości dla tego piksela we wszystkich klatkach, wartość tego piksela jest zastępowana wartością mediany we wszystkich klatkach.
3. Klatki z korekcją promieniowania kosmicznego są następnie uśredniane i wygładzane przez filtr Savitzky'ego-Golaya ¹.
4. Aby wyodrębnić "prawdziwe" widmo bramkowane, odejmujemy widma "tylko wzbudzenie" i "tylko pompa" od zmierzonego widma bramkowanego.
5. Na koniec widma bramkowane i niebramkowane są następnie korygowane przez odjęcie wielomianu^5-tego rzędu, wyznaczonego metodą Liebera i Mahadevana-Jansena ².

7. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schemat ideowy systemu bramkowania Kerra. Ścieżka wiązki pompy jest pokazana na czerwono, a ścieżka SHG jest pokazana na niebiesko. Ścieżka, na której Raman i fluorescencja nakładają się na siebie, jest pokazana na zielono, podczas gdy ścieżka, na której fluorescencja została czasowo odfiltrowana, jest pokazana na żółto. Skróty w następujący sposób: BPF, filtr pasmowo-przepustowy; CCD, urządzenie sprzężone z ładunkiem; DCM, zwierciadło dichroiczne; FI, izolator Faradaya; λ/2, płyta półfalowa; LPF, filtr długoprzepustowy; NLM, ośrodek nieliniowy; P, polaryzator; SHG, kryształ drugiej generacji harmonicznej.

Rysunek 2. Góra: Surowe widma kumaryny rozpuszczonej w olejku immersyjnym. Czerwona krzywa pokazuje widmo pobrane przy otwartej bramce (analizator ustawiony na maksymalną transmisję). krzywa pokazuje widmo pobrane z analizatorem ustawionym na minimalną transmisję i zastosowaną wiązką pompy (widmo bramkowane). Niebieska krzywa pokazuje widmo pobrane z analizatorem ustawionym na minimalną transmisję i bez zastosowanej wiązki pompy (bramka utrzymywana w pozycji zamkniętej). Zielona krzywa pokazuje widmo pobrane tylko przy zastosowanej wiązce pompy. Przerywane karmazynowe linie wskazują obszar widmowy pokazany w panelu poniżej. Wszystkie widma zostały wygładzone 11-punktowym filtrem Savitzky'ego-Golaya 3 rzędu. Na dole: Widma kumaryny rozpuszczonej w olejku immersyjnym po odjęciu tła fluorescencyjnego. Czerwona krzywa to widmo z otwartą bramą, a niebieska krzywa to bramkowane widmo. Bramkowane widmo wyraźnie pokazuje zawiły pik o wysokiej liczbie falowej charakterystyczny dla olejów.

Nie stwierdzono konfliktu interesów.