Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Podsumowanie

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Streszczenie

Precyzyjne wzorce podziału, migracji i różnicowania neuralnych komórek progenitorowych są kluczowe dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu^1,2. Aby zrozumieć zachowanie neuralnych komórek progenitorowych w złożonym środowisku in vivo, niezbędne jest obrazowanie czasu rzeczywistego (time-lapse) żywych neuralnych komórek progenitorowych w nienaruszonym mózgu. W niniejszym filmie wykorzystujemy unikalne cechy embrionów zebrafish do wizualizacji rozwoju neuralnych komórek progenitorowych przedmózgowia in vivo. Stosujemy elektroporację w celu genetycznego i rzadkiego znakowania pojedynczych neuralnych komórek progenitorowych. W skrócie, konstrukty DNA kodujące markery fluorescencyjne wstrzyknięto do komory przedmózgowia embrionów zebrafish w 22 godzinach po zapłodnieniu (hpf), a następnie natychmiast podano impulsy elektryczne. Sześć godzin później elektroporowane embriony zebrafish zamocowano w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w szalkach hodowlanych z szklanym dnem. Następnie fluorescencyjnie znakowane neuralne komórki progenitorowe obrazowano przez 36h w stałych odstępach czasu pod mikroskopem konfokalnym przy użyciu obiektywu zanurzeniowego w wodzie. Przedstawiona metoda umożliwia uzyskanie wglądu w rozwój in vivo neuralnych komórek progenitorowych przedmózgowia i może być zastosowana do innych części ośrodkowego układu nerwowego embrionu zebrafish.

Protokół

1. Przygotowanie embrionów danio pręgowanego

1. Na dwa dni przed elektroporacją przygotować klatki do krzyżowania ryb typu dzikiego, stosując przegrody oddzielające samce od samic.
2. Na jeden dzień przed elektroporacją usunąć przegrody z klatek do krzyżowania przygotowanych poprzedniego dnia.
3. Zebrać embriony i inkubować 50 zapłodnionych embrionów w 30 ml pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% fenylotiomocznika (PTU) w temperaturze 28,5°C.
4. W dniu elektroporacji, gdy embriony osiągną stadium rozwojowe 22 hpf, przeprowadzić manualną dechorionację za pomocą precyzyjnej pęsety (Inox 5, Dumont Electronic, Szwajcaria). Następnie przenieść embriony do 10 ml roztworu Ringera do elektroporacji³ (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) zawierającego 0,003% PTU.
5. Do 10 ml roztworu Ringera do elektroporacji dodać 420 μl roztworu zapasu trikainy (4 mg/ml), aby znieczulić embriony.

2. Przygotowanie do elektroporacji

1. Szklane igły do iniekcji zostały wyciągnięte z kapilar (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, z włóknem) za pomocą wyciągarki Flaming-Brown P897 (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). Końcówkę igły odłamano pęsetą, aby uzyskać ostry koniec, jak pokazano na rysunku 1D. Średnica końcówki powinna wynosić około 10 μm, a kąt zwężenia około 30 stopni.
2. Przygotować 0,8% i 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (Shelton Scientific, Inc. katalog #IB70050) w roztworze Ringera do elektroporacji. Rozdzielić roztwór agarozy do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml. Przechowywać alikwoty w bloku grzewczym w temperaturze ~37°C.
3. System Gal4/UAS jest wykorzystywany do sterowania ekspresją genów w komórkach progenitorowych neuronów w elektroporowanych embrionach. Używa się dwóch plazmidów: plazmidu EF1α-GFF-PT2KXIG, w którym Gal4FF jest sterowany przez powszechny promotor EF1α, oraz plazmidu UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Przygotować DNA plazmidowe EF1α-GFF-PT2KXIG oraz UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG, korzystając z zestawu GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
5. Następnie plazmidy są zagęszczane poprzez wytrącanie octanem sodu/etanolem do końcowego stężenia 1-2 μg/μl w 10 mM Tris·Cl (pH 8,5).
6. Zmieszać oba plazmidy i rozcieńczyć wodą H2O wolną od nukleaz do końcowego stężenia 500 ng/μl dla każdego plazmidu. W celu wizualizacji dostarczenia zaleca się dodanie do roztworu czerwieni fenolowej (rozcieńczonej 1/10 całkowitej objętości). Roztwór DNA przechowywać w lodzie.
7. Bezpośrednio przed elektroporacją napełnić igłę do iniekcji od tyłu 2 μl roztworu DNA i ustawić objętość iniekcji na 2 nl.

3. Elektroporacja

1. Stereomikroskop sekcyjny (Zeiss Stemi 2000 z maksymalnym powiększeniem 50x), injektor pneumatyczny (mikroinjektor Narishige IM 300), dwa mikromanipulatory (WPI M3301R, World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) oraz stymulator elektryczny (stymulator impulsów prostokątnych SD9, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) zostają ustawione zgodnie z rysunkiem 1A.
2. Aby zamontować zarodki, zanurz 2 zarodki w 1% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie niezwłocznie wyjmij zarodki z agarozy za pomocą szklanej pipety.
3. Umieść zarodki na odwróconej plastikowej pokrywce szalki Petriego w oddzielnych kroplach agarozy. Przed zastygnięciem agarozy delikatnie ustaw zarodki za pomocą sondy światłowodowej w pozycji grzbietem do góry, tak aby przedmózgowie było dostępne dla elektrod i igły do mikroiniekcji (rysunek 1B). Zarodki muszą być zamocowane w oddzielnych kroplach agarozy.
4. Manipuluj elektrodami za pomocą lewego mikromanipulatora. Wprowadź elektrody do agarozy, jak pokazano na rysunku 1B. Do elektroporacji używa się specjalnie wykonanych równoległych elektrod bipolarnych z platyny i irydu o średnicy 125 μm i odstępie 500 μm (FHC, nr katalogowy #PBSA0575).
5. Wprowadź igłę do mikroiniekcji do komory przedmózgowia i wstrzyknij 4nl mieszanki DNA, obserwując przepływ czerwonego płynu oraz pęcznienie komory.
6. Następnie ręcznie przyłóż jeden impuls o napięciu 28.5 V trwający 1 milisekundę. Potem zmień polaryzację i przyłóż kolejny impuls 28.5 V trwający 1 milisekundę. Doprowadzi to do bilateralnego mozaikowego znakowania komórek progenitorowych przedmózgowia.
7. Po elektroporacji 10 zarodków dodaj 5ml pożywki embrionalnej, aby przykryć zarodki, a następnie odklej agarozę mikronóżem chirurgicznym, aby uwolnić zarodki.
8. Przenieś elektroporowane zarodki do nowej szalki zawierającej 30 ml pożywki embrionalnej z 0.003% PTU i inkubuj w temperaturze 28.5°C.

4. Montowanie i obrazowanie live w trybie time-lapse

1. Około 4 godziny po elektroporacji sygnał EGFP jest widoczny pod mikroskopem stereotypowym z epifluorescencją.
2. Pięć godzin po elektroporacji należy wybrać zarodki z silną, choć wysoce mozaikową ekspresją EGFP w obszarze przedmózgowia.
3. Wybrane zarodki należy przenieść do 10 ml pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% PTU.
4. Do 10 ml pożywki embrionalnej należy dodać 420 μl roztworu tricainy (4 mg/ml) w celu znieczulenia zarodków.
5. Aby zamocować zarodki, należy zanurzyć jeden zarodek w 0,8% agarozie o niskiej temperaturze topnienia. Następnie należy niezwłocznie wyjąć zarodek z agarozy za pomocą szklanej pipety i umieścić go w centrum szklanej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm (MatTek corporation, Part# P35GC-1.5-10-C, www.glass-bottom-dishes.com).
6. Przed zastygnięciem agarozy należy delikatnie ustawić zarodki w pozycji grzbietem do góry za pomocą sondy światłowodowej.
7. Szalkę należy odpowiednio umieścić na stoliku mikroskopu konfokalnego z kontrolą temperatury, jak pokazano na rysunku 1C (stosujemy spektralny mikroskop konfokalny Nikon C1 z obiektywami pionowymi). Temperaturę należy ustawić na 28,5°C.
8. Należy dodać 3 ml podgrzanej do 28,5°C pożywki embrionalnej zawierającej 0,003% PTU, aby przykryć zarodek. Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania.
9. Należy przeprowadzić obrazowanie żywych tkanek w trybie time-lapse z ustalonym odstępem czasu, używając obiektywu zanurzeniowego.

5. Reprezentatywne wyniki

Na Rysunku 2 przedstawiono wybrane klatki z obrazowania konfokalnego na żywo w trybie poklatkowym zarodka poddanego elektroporacji EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP w 22 hpf.

Rysunek 1. Układ aparatury. (A) Zestaw urządzeń do elektroporacji: stymulator impulsów prostokątnych Grass SD9 (i), lewy mikromanipulator (ii), elektrody (iii), stereomikroskop Zeiss (iv), igła do iniekcji (v), prawy mikromanipulator (vi) oraz mikroinjektor Narishige IM 300 (vii). (B) Położenie względne elektrod (i), komory mózgu przedniego (ii) i igły do iniekcji (iii). Zauważmy, że do komory mózgu przedniego wstrzyknięto czerwony roztwór DNA. (C) Zestaw do obrazowania żywych tkanek na mikroskopie konfokalnym Nikon C1: kontroler temperatury (i), obiektyw z zanurzeniem w wodzie (ii) oraz poddany elektroporacji embrion zatopiony w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w naczyniu hodowlanym z szklanym dnem (iii). (D) Obraz dociągniętej i odciętej igły do mikroiniekcji DNA.

Rycina 2. Wybrane klatki z 18-godzinnego obrazowania konfokalnego na żywo (time-lapse) zarodka poddanego elektroporacji EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP w 22 hpf. Powierzchnia komory znajduje się w dolnej części każdej klatki obrazu. Pasek skali odpowiada 10 μm.

Dyskusja

W niniejszym filmie prezentujemy metodę obrazowania live w trybie time-lapse komórek progenitorowych neuronów na poziomie klonalnym w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. Przetestowaliśmy i zmodyfikowaliśmy istniejące protokoły elektroporacji^4-6, aby genetycznie i fluorescencyjnie znakować pojedyncze komórki progenitorowe neuronów. Możliwe jest stworzenie drzewa linii komórkowej składającego się z klonalnie powiązanych komórek potomnych, ponieważ tylko nieliczne komórki zostały rzadko oznakowane p...