Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Podsumowanie

Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).

Streszczenie

Enterokoki są częstą przyczyną bakteriemii, przy czym dominującym gatunkiem jest E. faecalis, a następnie E. faecium. Ponieważ oporność na ampicylinę i wankomycynę u E. faecalis jest wciąż rzadka w porównaniu z opornością u E. faecium, opracowanie szybkich testów pozwalających na rozróżnienie gatunków enterokoków jest istotne dla właściwej terapii i nadzoru nad opornością. Test E. faecalis OE PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) wykorzystuje gatunkowo specyficzne sondy z kwasu nukleinowego peptydowego (PNA) w formacie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, oferując czas uzyskania wyników wynoszący 1,5 godziny oraz potencjał dostarczania istotnych informacji dla leczenia specyficznego dla danego gatunku. Przeprowadzono badania wieloośrodkowe w celu oceny skuteczności procedury E. faecalis/OE PNA FISH trwającej 1,5 godziny w porównaniu z oryginalną procedurą testową trwającą 2,5 godziny oraz standardowymi metodami bakteriologicznymi identyfikacji enterokoków bezpośrednio z dodatniego butelka z posiewem krwi.

Protokół

1. Pobieranie i przygotowanie próbek

1. Pobrać krew żylną od pacjentów z podejrzeniem sepsy i umieścić ją w dwóch butelkach do posiewów krwi BACTEC (BD, Sparks, MD) – jednej tlenowej i jednej beztlenowej – które razem tworzą jeden zestaw do posiewu krwi.
2. Umieścić butelki w urządzeniu BACTEC 9240 w temperaturze 35°C.
3. Inkubować do momentu uruchomienia alarmu przez urządzenie w wyniku wzrostu organizmów w butelce z posiewem krwi.
4. Wyjąć butelkę z urządzenia do posiewów krwi.

2. Przygotowanie odczynników przed barwieniem

1. Przygotuj roztwór do płukania, dodając 4 mL 60x Wash Solution, a następnie 240 mL świeżej wody dejonizowanej lub destylowanej bezpośrednio do kuwety do barwienia.
2. Umieść kuwetę do barwienia w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C w celu ogrzania.
3. Pozostały koncentrat przechowuj w temperaturze 2-8°C.
4. Wyjmij Medium Montażowe z lodówki i doprowadź do temperatury pokojowej.

3. Barwienie metodą Grama

1. Delikatnie zakręć butelką z posiewem krwi.
2. Za pomocą igły i strzykawki lub urządzenia do pasażowania pobierz krew (około 5 mL) z butelki i przelej do sterylnej probówki z nakrętką.
3. Za pomocą sterylnej pipety nanieś jedną dużą kroplę krwi na szkiełko przedmiotowe.
4. Wysusz szkiełko na powietrzu i utrwal w metanolu przez 10 sekund.
5. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.
6. Wykonaj barwienie metodą Grama na rozmazie krwi, aby określić morfologię organizmu rosnącego w butelce z posiewem krwi.
7. Obejrzyj szkiełko przy użyciu obiektywu imersyjnego. Obecność dodatnich koków Grama w parach i krótkich łańcuchach w barwieniu metodą Grama jest najbardziej charakterystyczna dla gatunków enterokoków.
8. Wynik barwienia metodą Grama determinuje wybór odpowiedniego zestawu sond PNA FISH do identyfikacji bakterii. Ten posiew krwi zostanie zabarwiony przy użyciu barwnika PNA FISH E. faecalis/OE.

4. Barwienie PNA FISH

1. Przed przygotowaniem rozmazu delikatnie wymieszaj zawartość probówki z krwią, obracając ją okrężnie.
2. Nanieś jedną kroplę roztworu utrwalającego (Fixation Solution) na wgłębienie szkiełka przedmiotowego do PNA FISH.
3. Przenieś 10 μL lub jedną małą kroplę z probówki z dodatnią hodowlą krwi do roztworu utrwalającego i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać emulsję.
4. Utrwal rozmazy, podgrzewając je przez 20 min w temperaturze 55°C na płycie grzejnej.

5. Materiał kontroli jakości

Wraz z każdą partią preparatów do barwienia należy przetestować jeden slajd kontroli jakości dodatniej i jeden ujemnej.

1. W tym celu należy użyć slajdów kontrolnych E. faecalis/OE zakupionych w AdvanDx lub przygotować mazaki z kultur płynnych szczepów referencyjnych E. faecalis i E. faecium jako kontroli pozytywnej, albo na osobnych slajdach, albo zmieszanych na jednym slajdzie, oraz Staphylococcus spp lub Streptococcus spp jako materiału kontroli negatywnej.

Wyniki kontroli jakości powinny umożliwiać monitorowanie odpowiednich warunków testowych, w szczególności tych wpływających na rygorystyczność hybrydyzacji oraz penetrację ściany komórkowej, ponieważ metodologia PNA została zaprojektowana w celu optymalizacji penetracji ściany komórkowej

6. Hybrydyzacja

1. Do dołka na szkiełku mikroskopowym z preparatem rozmazowym dodać jedną kroplę E. faecalis/OE PNA.
2. Nałożyć szkiełko nakrywkowe, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.
3. Inkubować przez 30 ± 5 min w temperaturze 55 ± 1°C na płycie grzejnej.
4. Po inkubacji umieścić szkiełka w statywie.

7. Rygorystyczne przemywanie

1. Zanurz uchwyt do szkiełek w podgrzanym do 55°C roztworze piorącym i ostrożnie zdejmij szkiełko podstawowe. Często szkiełko podstawowe zsuwa się samo podczas delikatnego potrząsania preparatem w roztworze piorącym. Czasami konieczne jest delikatne odepchnięcie szkiełka podstawowego za pomocą pęsety.
2. Inkubuj w roztworze piorącym przez 30 ± 5 min. w temperaturze 55 ± 1°C.
3. Wyjmij szkiełka z roztworu piorącego
4. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu

8. Montowanie preparatów

1. Nanieś jedną kroplę medium montującego na każdy preparat
2. Nałóż szkiełko nakrywkowe. Unikaj pęcherzyków powietrza.
3. Zbadaj preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym w ciągu 2 godzin.
4. Nie wystawiaj preparatów na bezpośrednie działanie światła słonecznego ani innych silnych źródeł światła, ponieważ może to prowadzić do wygaszenia fluorescencji.

9. Interpretacja wyników

Mikroskop fluorescencyjny używany do badania preparatów musi być wyposażony w filtr AdvanDx Dual Band oraz obiektyw olejowy 60x lub 100x. W pierwszej kolejności należy zbadać preparaty kontroli jakości (QC), aby potwierdzić, że doszło do hybrydyzacji. E. faecalis powinny być widoczne jako jaskrawozielone fluorescencyjne przączki w wielu polach widzenia, natomiast E. faecium będą widoczne jako jaskrawoczerwone przączki. Preparat kontrolny z nie-enterokokami nie powinien wykazywać fluorescencji. Po potwierdzeniu poprawności działania systemu na kontrolach można przystąpić do badania preparatów pacjentów. Początkowo rozmaz krwi będzie wydawał się czerwony, ale jaskrawoczerwone i zielone przączki będą wyraźnie widoczne.

Rycina 1. Reprezentatywne przykłady wyników testów: dodatni wynik dla zielonej fluorescencji E. faecalis (po lewej), dodatni wynik dla czerwonej fluorescencji E. faecium (środek) oraz wynik negatywny (po prawej).

10. Reprezentatywne wyniki

Trzy instytucje zostały włączone do wieloośrodkowego badania klinicznego oceniającego to barwienie PNA FISH i porównującego protokół 2,5-godzinny ze skróconym protokołem 1,5-godzinnym, który został właśnie omówiony. W badaniach uwzględniono łącznie 152 butelki z posiewami krwi dodatnimi pod kątem rutynowych dodatnich koków Grama występujących w parach i łańcuchach (GPC). Odnotowano 100% (152/152) zgodności między wynikami zmodyfikowanej a oryginalnej procedury badania dla E. faecalis/OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 inne enterokoki oraz 78/78 inne GPC (Tabela 1). Metoda barwienia ta wykazała wyjątkową czułość i swoistość podczas tego badania klinicznego (Tabela 2).

	Metody rutynowe	E. faecalis / Standardowa procedura PNA FISH OE	E. faecalis/ Skrócona procedura PNA FISH OE
E. faecalis	41	41 (Dodatni zielony)	41 (Dodatni zielony)
E. faecium	27	27 (Dodatni czerwony)	27 (Dodatni czerwony)
E. casseliflavus	2	2 (Dodatni czerwony)	2 (Dodatni czerwony)
E. gallinarum	2	2 (Dodatni czerwony)	2 (Dodatni czerwony)
Inne Enterococcus spp.	2	2 (Dodatni czerwony)	2 (Dodatni czerwony)
S. pneumoniae	17	17 (Ujemny)	17 (Ujemny)
S. viridans	33	33 (Ujemny)	33 (Ujemny)
S. mitis	1	1 (Ujemny)	1 (Ujemny)
S. pyogenes	3	3 (Ujemny)	3 (Ujemny)
S. bovis	2	2 (Ujemny)	2 (Ujemny)
S. salivarius	1	1 (Ujemny)	1 (Ujemny)
S. sanguinis	2	2 (Ujemny)	2 (Ujemny)
S. agalagtae	7	7 (Ujemny)	7 (Ujemny)
Inne Streptococcus spp.	7	7 (Ujemny)	7 (Ujemny)
Abiotrophia spp.	3	3 (Ujemny)	3 (Ujemny)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (Ujemny)	2 (Ujemny)
Suma	152	152/152 100% zgodności	152/152 100% zgodności

Tabela 1. Lista bakterii przetestowanych przy użyciu standardowego (2,5 h) oraz szybkiego (1,5 h) protokołu.

Czułość *E. faecalis*	Czułość Inne Enterococcus spp.	Specyficzność
100% (41/41) 95% CI (93,0-100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91,3-100)	100% (78/78) 95% CI (96,2-100)

Tabela 2. Czułość i swoistość 1,5-godzinnego protokołu PNA FISH.

Dyskusja

Test PNA FISH E. faecalis/OE w kierunku enterokoków pozwala na identyfikację patogenu o 2-3 dni szybciej niż standardowe metody hodowlane. Skrócona procedura testu (1,5 godziny) zapewnia szybką identyfikację, która może zostać wykorzystana do lepszego doboru terapii przeciwdrobnoustrojowej i poprawy rokowań pacjenta. Badanie potwierdzające tę tezę zostało przeprowadzone przez Forrest et al. (6). Przez dwa kolejne lata, poczynając od 2005 roku, laboratorium mikrobiologiczne identyfikowało za pomocą konwencjonalnych metod mikrobiologicznych dodatnie Gramem kokusy występujące w parach i łańcuchach, rosnące w butelkach do posiewów krwi, a w 2006 roku wdrożono dodatkowo test PNA FISH E. faecalis/OE. Ponadto opracowano algorytm leczenia stworzony przez instytucjonalny zespół przeciwdrobnoustrojowy (AMT), aby w odpowiednim czasie efektywnie wykorzystać dane z testu PNA FISH generowane przez laboratorium. Głównym ocenianym punktem końcowym był czas od pobrania krwi do wdrożenia skutecznej terapii przeciwdrobnoustrojowej przed i po wprowadzeniu PNA FISH do workflow laboratorium. Mierzono również ciężkość choroby, miejsce pobytu pacjenta oraz empiryczną terapię przeciwdrobnoustrojową. Oceniono łącznie 224 pacjentów z bakterymią enterokokową nabytą w szpitalu, z czego 129 w okresie przed interwencją i 95 w okresie stosowania PNA FISH. Test PNA FISH zidentyfikował E. faecalis o 3 dni szybciej niż konwencjonalne posiewy (1,1 vs. 4,1 dnia, p<0,001). PNA FISH zidentyfikował E. faecium medianowo o 2,3 dnia szybciej (1,1 vs. 3,4 dnia, p<0,001) i wiązało się to ze statystycznie istotnym skróceniem czasu do rozpoczęcia skutecznej terapii (1,3 vs. 3,1 dnia, p<0,001) oraz zmniejszeniem śmiertelności w ciągu 30 dni (26% vs. 45%, p=0,04). Grupa badawcza wyciągnęła wniosek, że test PNA FISH E. faecalis/OE w połączeniu z algorytmem leczenia AMT doprowadził do wcześniejszego wdrożenia odpowiedniej empirycznej terapii przeciwdrobnoustrojowej u pacjentów z bakterymią E. faecium nabytą w szpitalu.

1. Odczynników nie należy stosować po dacie ważności podanej na etykietach; nie powinny być one w żaden sposób modyfikowane. Gdy nie są używane, powinny być przechowywane w lodówce, aby nie straciły swojej aktywności.
2. Butelki z posiewem krwi należy wymieszać przed pobraniem próbek.
3. Należy uważać, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotknęła rozmazu krwi, ponieważ może to spowodować kontaminację krzyżową materiału między slajdami lub zanieczyszczenie odczynnika.
4. Należy upewnić się, że kąpiel wodna oraz blok grzejny są utrzymywane w stałej temperaturze 55°C.
5. Nie należy używać innych filtrów niż filtr dwupasmowy (Dual Band Filter), w przeciwnym razie kolory nie będą wyraźnie rozróżnialne.
6. Nie należy używać innych szkiełek przedmiotowych niż dedykowane Microscope Slides, w przeciwnym razie nie dojdzie do hybrydyzacji.
7. Kluczowe jest, aby mikroskop funkcjonował prawidłowo. Należy upewnić się, że liczba godzin pracy żarówki mikroskopu mieści się w dopuszczalnym limicie.

• Niektóre rzadko występujące gatunki Enterococcus nie są wykrywane przez sondę PNA hybrydyzującą z innymi gatunkami Enterococcus, takimi jak E. asinii, E. dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius i E. sulfurous.
• E. moraviensis jest identyfikowany jako E. faecalis ze względu na podobieństwo sekwencji.
• Niektóre szczepy Streptococcus anginosus wykazują fałszywie dodatnią zieloną fluorescencję ze względu na podobieństwo sekwencji.
• Butelki do posiewów krwi VersaTREK nie zostały poddane ocenie podczas badań klinicznych. Wydajność wykrywania E. faecalis oraz innych gatunków Enterococcus spp. przy użyciu butelek VersaTREK jest nieznana.
• Może wystąpić fałszywie dodatnia zielona autofluorescencja w przypadku użycia standardowego filtra FITC zamiast filtra dwupasmowego (Dual Band Filter).
• Fałszywie ujemne wyniki mogą sporadycznie występować z powodu mieszanego wzrostu drobnoustrojów lub błędów w technice przeprowadzania testu.
• Typ i stan wykorzystanego instrumentarium wpływają na wizualny aspekt uzyskanego obrazu. Intensywność fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju użytego mikroskopu, źródła światła oraz poziomu rRNA w komórkach.
• Izolacja na podłożach stałych jest niezbędna do odróżnienia wzrostu mieszanego z innymi organizmami oraz do identyfikacji dodatnich posiewów krwi, które dały wynik ujemny.
• Produkt nie został zwalidowany dla materiałów innych niż posiewy krwi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki *E. faecalis*/– Zestaw PNA FISH składa się z następujących komponentów: Roztwór utrwalający Roztwór utrwalający 3 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym z detergentem. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– 1,5 ml sond PNA w roztworze do hybrydyzacji. Zawiera 30% formamidu. Roztwór płuczący 60x Roztwór płuczący 60x 50 mL Tris-buforowana sól fizjologiczna z detergentem Medium montażowe Medium montażowe 3 ml inhibitor fotoblaknięcia w glicerolu Preparaty do kontroli jakości AdvanDX