Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Podsumowanie

Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).

Streszczenie

Enterokoki są częstą przyczyną bakteriemii, przy czym dominującym gatunkiem jest E. faecalis, a następnie E. faecium. Ponieważ oporność na ampicylinę i wankomycynę u E. faecalis jest wciąż rzadka w porównaniu z opornością u E. faecium, opracowanie szybkich testów pozwalających na rozróżnienie gatunków enterokoków jest istotne dla właściwej terapii i nadzoru nad opornością. Test E. faecalis OE PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) wykorzystuje gatunkowo specyficzne sondy z kwasu nukleinowego peptydowego (PNA) w formacie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, oferując czas uzyskania wyników wynoszący 1,5 godziny oraz potencjał dostarczania istotnych informacji dla leczenia specyficznego dla danego gatunku. Przeprowadzono badania wieloośrodkowe w celu oceny skuteczności procedury E. faecalis/OE PNA FISH trwającej 1,5 godziny w porównaniu z oryginalną procedurą testową trwającą 2,5 godziny oraz standardowymi metodami bakteriologicznymi identyfikacji enterokoków bezpośrednio z dodatniego butelka z posiewem krwi.

Protokół

1. Pobieranie i przygotowanie próbek

1. Pobrać krew żylną od pacjentów z podejrzeniem sepsy i wprowadzić ją do dwóch butelek do hodowli krwi BACTEC (BD, Sparks, MD) – jednej tlenowej i jednej beztlenowej, które razem tworzą jeden zestaw do posiewu krwi.
2. Umieścić butelki w urządzeniu BACTEC 9240 w temperaturze 35°C.
3. Inkubować do momentu uruchomienia alarmu w urządzeniu, spowodowanego wzrostem organizmów w butelce z posiewem krwi.
4. Wyjąć butelkę z urządzenia do hodowli krwi.

2. Przygotowanie odczynników przed barwieniem

1. Przygotuj roztwór płuczący, dodając 4 mL 60x roztworu płuczącego (Wash Solution), a następnie 240 mL świeżej wody dejonizowanej lub destylowanej bezpośrednio do kuwety do barwienia.
2. Umieść kuwetę do barwienia w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C w celu ogrzania.
3. Pozostały koncentrat przechowuj w temperaturze 2-8°C.
4. Wyjmij medium montażowe z lodówki i doprowadź je do temperatury pokojowej.

3. Barwienie metodą Grama

1. Delikatnie zamieszać butelkę z posiewem krwi.
2. Za pomocą igły i strzykawki lub urządzenia do pasażowania pobrać krew (około 5 mL) z butelki i przenieść do sterylnej probówki z nakrętką.
3. Za pomocą sterylnej pipety nanieść jedną dużą kroplę krwi na szklany przedmiotowy szkiełko mikroskopowe.
4. Wysuszyć preparat na powietrzu, a następnie utrwalić w metanolu przez 10 sekund.
5. Pozostawić preparat do wyschnięcia na powietrzu.
6. Wykonać barwienie metodą Grama rozmazu krwi, aby określić morfologię organizmu rosnącego w butelce z posiewem krwi.
7. Obejrzeć preparat przy użyciu obiektywu imersyjnego. Obecność dodatnich koków Grama występujących w parach i krótkich łańcuchach w barwieniu Grama jest najbardziej charakterystyczna dla gatunków enterococcus.
8. Wynik barwienia Grama determinuje następnie wybór odpowiedniego zestawu sond PNA FISH do identyfikacji bakteryjnej. Ten posiew krwi zostanie zabarwiony przy użyciu barwnika E. faecalis/OE PNA FISH.

4. Barwienie PNA FISH

1. Przed przygotowaniem rozmazu delikatnie wymieszać krew w probówce, obracając ją okrężnie.
2. Nanieść jedną kroplę roztworu utrwalającego (Fixation Solution) do wgłębienia na szkiełku do mikroskopii PNA FISH.
3. Przenieść 10 μL lub jedną małą kroplę z probówki z dodatnim posiewem krwi do roztworu utrwalającego i delikatnie wymieszać do uzyskania emulsji.
4. Utrwalić rozmazy, podgrzewając je przez 20 min w temperaturze 55°C na płycie grzewczej.

5. Materiał do kontroli jakości

Przy każdej partii preparatów przeznaczonych do barwienia należy przebadać jeden pozytywny i jeden negatywny preparat kontroli jakości.

1. W tym celu należy użyć preparatów kontrolnych E. faecalis/OE zakupionych od firmy AdvanDx lub przygotować rozmazy z kultur płynnych szczepów referencyjnych E. faecalis oraz E. faecium jako kontroli dodatniej (na oddzielnych szkiełkach lub zmieszane na jednym szkiełku) oraz Staphylococcus spp. lub Streptococcus spp. jako materiału kontroli ujemnej.

Wyniki kontroli jakości powinny umożliwiać monitorowanie odpowiednich warunków testowania, w szczególności tych wpływających na rygorystyczność hybrydyzacji i przenikanie przez ścianę komórkową, ponieważ metodologia PNA została zaprojektowana w celu optymalizacji przenikania przez ścianę komórkową

6. Hybrydyzacja

1. Do dołka na szkiełku mikroskopowym z preparatem rozmazowym dodaj jedną kroplę E. faecalis/OE PNA.
2. Nałóż szkiełko nakrywkę. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.
3. Inkubuj przez 30 ± 5 min. w temperaturze 55 ± 1°C na płycie grzejnej.
4. Po inkubacji umieść szkiełka w statywie.

7. Rygorystyczne przemywanie

1. Zanurz nośnik szkiełek w podgrzanym do 55°C roztworze piorącym i ostrożnie usuń szkiełko przykrywne. Często szkiełko przykrywne odpada po delikatnym potrząsaniu szkiełkiem w roztworze piorącym. W niektórych przypadkach szkiełko przykrywne należy delikatnie odsunąć pęsetą.
2. Inkubuj w roztworze piorącym przez 30 ± 5 min. w temperaturze 55 ± 1°C.
3. Wyjmij szkiełka z roztworu piorącego
4. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu

8. Montowanie

1. Nanieś jedną kroplę medium montującego na każdy preparat
2. Nałóż szkiełko nakrywkowe, unikając powstania pęcherzyków powietrza.
3. Zbadaj preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym w ciągu 2 godzin.
4. Nie wystawiaj preparatów na bezpośrednie działanie światła słonecznego ani innych silnych źródeł światła, ponieważ może to prowadzić do gaszenia fluorescencji.

9. Interpretacja wyników

Mikroskop fluorescencyjny używany do badania preparatów musi być wyposażony w filtr AdvanDx Dual Band oraz obiektyw olejowy 60x lub 100x. W pierwszej kolejności należy zbadać preparaty kontrolne QC, aby potwierdzić, że doszło do hybrydyzacji. E. faecalis powinny być widoczne jako jasnozielone fluorescencyjne gronki w wielu polach widzenia, natomiast E. faecium będą widoczne jako jaskrawoczerwone gronki. Preparat kontrolny zawierający drobnoustroje inne niż enterokoki nie powinien wykazywać fluorescencji. Po potwierdzeniu sprawności systemu na kontrolach można przystąpić do badania preparatów pacjenta. Początkowo rozmaz krwi będzie wydawał się czerwony, jednak jaskrawoczerwone i zielone gronki będą wyraźnie widoczne.

Rysunek 1.Reprezentatywne przykłady wyników testu: zielony dodatni E. faecalis (lewo), czerwony dodatni E. faecium (środek) oraz wynik ujemny (prawo).

10. Reprezentatywne wyniki

Trzy instytucje wzięły udział w wieloośrodkowym badaniu klinicznym oceniającym to barwienie PNA FISH i porównującym 2,5-godzinny protokół z krótkszym, 1,5-godzinnym protokołem, który został właśnie omówiony. W badaniach uwzględniono łącznie 152 rutynowo dodatnie butelki z posiewami krwi zawierające Gram-dodatnie kokal w parach i łańcuchach (GPC). Odnotowano 100% (152/152) zgodności między wynikami zmodyfikowanej a oryginalnej procedury testowej dla PNA FISH E. faecalis/OE: 41/41 E. faecalis; 33/33 inne enterokoki oraz 78/78 inne GPC (Tabela 1). Ta metoda barwienia wykazała wyjątkową czułość i swoistość podczas tego badania klinicznego (Tabela 2).

	Metody rutynowe	E. faecalis Standardowa procedura OE PNA FISH	E. faecalisKrótka procedura PNA FISH w OE
E. faecalis	41	41 (Pozytywny zielony)	41 (dodatni zielony)
*E. faecium*	27	27 (Czerwony Pozytywny)	27 (czerwony pozytywny)
*E. casseliflavus*	2	2 (Czerwony Pozytywny)	2 (Czerwony Pozytywny)
*E. gallinarum*	2	2 (Czerwony dodatni)	2 (czerwony pozytywny)
Inne Enterococcus spp.	2	2 (dodatni czerwony)	2 (czerwony pozytywny)
S. pneumoniae	17	17 (Negatywna)	17 (Negatywna)
S. viridans	33	33 (Wynik negatywny)	33 (Negatywny)
S. mitis	1	1 (Negatywna)	1 (Negatywna)
S. pyogenes	3	3 (Negatywna)	3 (negatywna)
S. bovis	2	2 (Negatywna)	2 (Negatywna)
S. salivarius	1	1 (negatywna)	1 (Negatywna)
*S. sanguinis*	2	2 (negatywna)	2 (negatywna)
S. agalagiae	7	7 (ujemna)	7 (negatywna)
Inne Streptococcus spp.	7	7 (Negatywna)	7 (negatywny)
Abiotrophia spp.	3	3 (negatywna)	3 (negatywna)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (negatywna)	2 (negatywna)
Suma	152	152/152 100% zgodność	152/152 100% zgodności

Tabela 1. Wykaz bakterii przebadanych przy użyciu zarówno standardowego (2,5 h), jak i szybkiego (1,5 h) protokołu.

Czułość E.faecalis	Czułość inne Enterococcus spp.	Swoistość
100% (41/41) 95% CI (93.0-100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100)	100% (78/78) 95% CI (96.2-100)

Tabela 2. Czułość i swoistość 1,5-godzinnego protokołu PNA FISH.

Dyskusja

Test PNA FISH E. faecalis/OE w kierunku enterokoków pozwala na identyfikację patogenu o 2-3 dni szybciej niż standardowe metody hodowlane. Skrócona procedura testu (1,5 godziny) zapewnia szybką identyfikację, która może zostać wykorzystana do lepszego doboru terapii przeciwdrobnoustrojowej i poprawy rokowań pacjenta. Badanie potwierdzające tę tezę zostało przeprowadzone przez Forrest et al. (6). Przez dwa kolejne lata, poczynając od 2005 roku, laboratorium mikrobiologiczne identyfikowało za pomocą konwencjonalnych metod mikrobiologicznych dodatnie Gramem kokusy występujące w parach i łańcuchach, rosnące w butelkach do posiewów krwi, a w 2006 roku wdrożono dodatkowo test PNA FISH E. faecalis/OE. Ponadto opracowano algorytm leczenia stworzony przez instytucjonalny zespół przeciwdrobnoustrojowy (AMT), aby w odpowiednim czasie efektywnie wykorzystać dane z testu PNA FISH generowane przez laboratorium. Głównym ocenianym punktem końcowym był czas od pobrania krwi do wdrożenia skutecznej terapii przeciwdrobnoustrojowej przed i po wprowadzeniu PNA FISH do workflow laboratorium. Mierzono również ciężkość choroby, miejsce pobytu pacjenta oraz empiryczną terapię przeciwdrobnoustrojową. Oceniono łącznie 224 pacjentów z bakterymią enterokokową nabytą w szpitalu, z czego 129 w okresie przed interwencją i 95 w okresie stosowania PNA FISH. Test PNA FISH zidentyfikował E. faecalis o 3 dni szybciej niż konwencjonalne posiewy (1,1 vs. 4,1 dnia, p<0,001). PNA FISH zidentyfikował E. faecium medianowo o 2,3 dnia szybciej (1,1 vs. 3,4 dnia, p<0,001) i wiązało się to ze statystycznie istotnym skróceniem czasu do rozpoczęcia skutecznej terapii (1,3 vs. 3,1 dnia, p<0,001) oraz zmniejszeniem śmiertelności w ciągu 30 dni (26% vs. 45%, p=0,04). Grupa badawcza wyciągnęła wniosek, że test PNA FISH E. faecalis/OE w połączeniu z algorytmem leczenia AMT doprowadził do wcześniejszego wdrożenia odpowiedniej empirycznej terapii przeciwdrobnoustrojowej u pacjentów z bakterymią E. faecium nabytą w szpitalu.

1. Odczynników nie należy stosować po dacie ważności podanej na etykietach; nie powinny być one w żaden sposób modyfikowane. Gdy nie są używane, powinny być przechowywane w lodówce, aby nie straciły swojej aktywności.
2. Butelki z posiewem krwi należy wymieszać przed pobraniem próbek.
3. Należy uważać, aby końcówka buteleczki z zakraplaczem nie dotknęła rozmazu krwi, ponieważ może to spowodować kontaminację krzyżową materiału między slajdami lub zanieczyszczenie odczynnika.
4. Należy upewnić się, że kąpiel wodna oraz blok grzejny są utrzymywane w stałej temperaturze 55°C.
5. Nie należy używać innych filtrów niż filtr dwupasmowy (Dual Band Filter), w przeciwnym razie kolory nie będą wyraźnie rozróżnialne.
6. Nie należy używać innych szkiełek przedmiotowych niż dedykowane Microscope Slides, w przeciwnym razie nie dojdzie do hybrydyzacji.
7. Kluczowe jest, aby mikroskop funkcjonował prawidłowo. Należy upewnić się, że liczba godzin pracy żarówki mikroskopu mieści się w dopuszczalnym limicie.

• Niektóre rzadko występujące gatunki Enterococcus nie są wykrywane przez sondę PNA hybrydyzującą z innymi gatunkami Enterococcus, takimi jak E. asinii, E. dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius i E. sulfurous.
• E. moraviensis jest identyfikowany jako E. faecalis ze względu na podobieństwo sekwencji.
• Niektóre szczepy Streptococcus anginosus wykazują fałszywie dodatnią zieloną fluorescencję ze względu na podobieństwo sekwencji.
• Butelki do posiewów krwi VersaTREK nie zostały poddane ocenie podczas badań klinicznych. Wydajność wykrywania E. faecalis oraz innych gatunków Enterococcus spp. przy użyciu butelek VersaTREK jest nieznana.
• Może wystąpić fałszywie dodatnia zielona autofluorescencja w przypadku użycia standardowego filtra FITC zamiast filtra dwupasmowego (Dual Band Filter).
• Fałszywie ujemne wyniki mogą sporadycznie występować z powodu mieszanego wzrostu drobnoustrojów lub błędów w technice przeprowadzania testu.
• Typ i stan wykorzystanego instrumentarium wpływają na wizualny aspekt uzyskanego obrazu. Intensywność fluorescencji może się różnić w zależności od rodzaju użytego mikroskopu, źródła światła oraz poziomu rRNA w komórkach.
• Izolacja na podłożach stałych jest niezbędna do odróżnienia wzrostu mieszanego z innymi organizmami oraz do identyfikacji dodatnich posiewów krwi, które dały wynik ujemny.
• Produkt nie został zwalidowany dla materiałów innych niż posiewy krwi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki *E. faecalis*/– Zestaw PNA FISH składa się z następujących komponentów: Roztwór utrwalający Roztwór utrwalający 3 mL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym z detergentem. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– 1,5 ml sond PNA w roztworze do hybrydyzacji. Zawiera 30% formamidu. Roztwór płuczący 60x Roztwór płuczący 60x 50 mL Tris-buforowana sól fizjologiczna z detergentem Medium montażowe Medium montażowe 3 ml inhibitor fotoblaknięcia w glicerolu Preparaty do kontroli jakości AdvanDX