Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Podsumowanie

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Streszczenie

Elektrofizjologia z użyciem dwuodsłonowej metody zaciskania napięcia (TEVC) jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu jonowego1 dla szerokiej gamy białek błonowych, w tym kanałów jonowych², pomp jonowych³ oraz transporterów⁴. Ostatnie osiągnięcia połączyły swoiste znakowanie fluoroforami z metodą TEVC, aby jednocześnie badać dynamikę konformacyjną w konkretnych resztach aminokwasowych oraz funkcję tych białek na powierzchni pojedynczych komórek.

Opiszemy metodę badania dynamiki konformacyjnej białek błonowych poprzez jednoczesne monitorowanie zmian fluorescencji i prądu z wykorzystaniem fluorometrii z zaciskiem napięcia (voltage-clamp fluorometry). Podejście to może być wykorzystane do badania ruchów molekularnych białek błonowych w konkretnych miejscach po zastąpieniu cysteiny i specyficznie ukierunkowanym znakowaniu fluoroforami^5,6. Ponadto metoda ta umożliwia wyznaczenie ograniczeń odległości między konkretnymi resztami^7,8. Osiąga się to poprzez selektywne przyłączenie fluoroforów donora i akceptora do dwóch wybranych zmutowanych reszt cysteiny.

Krótko mówiąc, eksperymenty te są przeprowadzane po funkcjonalnej ekspresji pożądanego białka na powierzchni oocytów Xenopus laevis. Duża powierzchnia tych oocytów umożliwia łatwe pomiary funkcjonalne i uzyskanie silnego sygnału fluorescencyjnego⁵. Możliwa jest również szybka zmiana warunków zewnątrzkomórkowych, takich jak pH, ligandy lub kationy/aniony, co może dostarczyć dodatkowych informacji na temat mechanizmu działania białek błonowych⁴. Wreszcie, ostatnie osiągnięcia umożliwiły manipulację wybranymi jonami wewnętrznymi po koekspresji z drugim białkiem⁹.

Nasz protokół został opisany w kilku częściach. Po pierwsze, przeprowadzono mutagenezę skanującą cysteiną, a następnie znakowanie fluoroforami reszt znajdujących się na styku domen transbłonowej i zewnątrzkomórkowej. Kolejne eksperymenty zostały zaprojektowane w celu zidentyfikowania reszt wykazujących znaczne zmiany natężenia fluorescencji (<5%)³ podczas zmiany konformacyjnej białka. Po drugie, zmiany te w natężeniu fluorescencji są porównywane z parametrami kinetycznymi białka błonowego, aby skorelować dynamikę konformacyjną z funkcją białka¹⁰. Umożliwia to rygorystyczną analizę biofizyczną ruchu molekularnego białka docelowego. Na koniec, dwie reszty holoenzymu mogą zostać znakowane fluoroforem donorem i akceptorem w celu określenia ograniczeń odległości przy użyciu metod fotodestrukcji donora. Możliwe jest również monitorowanie względnego ruchu podjednostek białka po znakowaniu fluoroforem donorem i akceptorem.

Protokół

1. Ekspresja białka

Klonuj interesujące białko błonowe do wektora odpowiedniego dla Xenopus laevis ekspresja w oocytach, taka jak pTLN¹¹ lub pSG01MX¹²Zoptymalizowane wektory zawierają zarówno 5', jak i 3' Xenopus laevis Nieprzetłumaczone regiony β-globiny^11,12, unikalna sekwencja rozpoznawania enzymu restrykcyjnego oraz miejsce wiązania promotora RNA znajdujące się przed 5'-UTR¹¹Komponenty te są odpowiednio wymagane do optymalnej ekspresji w oocytach, linearyzacji plazmidu przed syntezą mRNA oraz do samej syntezy mRNA.

2. Mutacja cysteiny

1. Wykres Kyte-Doolittle jest wykorzystywany do identyfikacji domen transbłonowych docelowego białka przy użyciu sekwencji aminokwasowej białka (ProtScale, ExPASy)¹³. Dane są przedstawione jako hydrofobowość w funkcji numeru sekwencji. Reszty wykazujące wartości dodatnie najprawdopodobniej znajdują się w domenie transbłonowej. Wykres ten służy do wyznaczenia najbardziej prawdopodobnych reszt zlokalizowanych na styku domen transbłonowej i zewnątrzkomórkowej, które zostaną zmutowane na cysteinę. Ponieważ określenie styku domeny transbłonowej i regionu zewnątrzkomórkowego nie może być przewidziane z całkowitą pewnością przy użyciu wykresu Kyte-Doolittle, ważne jest zbadanie zakresu reszt, które według przewidywań znajdują się na styku. Ten region białka jest wybierany ze względu na przewidywany ruch fluoroforu. Podczas zmiany konformacyjnej fluorofor przemieszcza się między środowiskiem hydrofilowym a hydrofobowym lub między środowiskiem silniej i słabiej gaszącym wodą. Każda z tych przewidywanych zmian w środowisku spowoduje zmianę intensywności fluorescencji.
2. Zestaw QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) jest używany do generowania pojedynczych konstruktów z cysteiną dostępną zewnątrz. W skrócie: wymieszać 5 μL 10X buforu reakcyjnego, 2 μL plazmidowego DNA o stężeniu 5 ng/μL, po 1,25 μL starterów forward i reverse o stężeniu 10 ng/μL, 1 μL dNTP (10 mM) oraz 39,5 μL podwójnie destylowanej wody. Na koniec dodać 1 μL polimerazy DNA PfuTurbo (Stratagene). Startery użyte w tym kroku powinny być zaprojektowane z mutacją cysteiny w interesującej badacza reszcie zewnątrzkomórkowej.
3. Zaprogramować termocykler zgodnie z następującymi specyfikacjami: 1 cykl w 95°C przez 30 sekund, 12-18 cykli: 95°C przez 30 sekund, 5°C przez 1 minutę i 68°C przez 1 minutę na każde kb długości plazmidu. Temperatura annealingu (5°C) jest obliczana bezpośrednio z temperatury topnienia każdego startera. W ostatnim kroku można zaprogramować utrzymanie temperatury 4°C, jeśli reakcja jest prowadzona przez noc. Liczba cykli zależy od mutacji. Należy zastosować 12 cykli dla mutacji punktowych, 16 cykli dla zmiany pojedynczego aminokwasu lub 18 cykli dla wielokrotnych insercji aminokwasów.
4. Dodać 1 μL enzymu DpnI (New England Biolabs) do mieszaniny reakcyjnej, wymieszać pipetą i odwir fracciones (60 rpm) przez 1 minutę. Inkubować przez 1 godzinę w 37°C w kąpieli wodnej.
5. Rozmrozić na lodzie komórki top 10 elektrokompetentne (Invitrogen) i inkubować sterylne podłoże SOC (20 mg/ml tryptonu, 5 mg/mL ekstraktu drożdżowego, 1 mg/mL NaCl, 0,4 mg/mL KCl, 0,02 M Mg²⁺, 0,02 M glukozy, ddH2O) w 37°C do momentu użycia. Odmierzyć 20 μL komórek do probówek wirówkowych 1,5 mL i dodać do komórek 1 μL trawionego DNA.
6. Wypełnić urządzenie Cell-Porator (Life Technologies) lodowatą wodą, ustawić pojemność na 30 μF, szybkość ładowania na fast (szybka) oraz oporność Voltage-Boostera na 4 kΩ.
7. Pipetować 20 μL roztworu komórki/DNA do kuwet Cell-Poratora. Włożyć kuwety do urządzenia Cell-Porator, zamknąć pokrywę, podłączyć kabel zasilający i ustawić pokrętło na odpowiednią kuwetę. Ustawić zasilacz w tryb ładowania i trzymać przycisk „up”, aż napięcie osiągnie 430. Przekręcić pokrętło na arm i nacisnąć wyzwalacz. W przypadku usłyszenia dźwięku trzasku, powtórzyć elektroporację.
8. Pipetować komórki z kuwety i przenieść je do 1,5 mL podłoża SOC. Inkubować przez 1,5 godziny w 37°C z wytrząsaniem.
9. Przenieść 30 μL roztworu SOC/komórki na agarowe płytki LB/ampicylina (10 mg/mL tryptonu, 5 mg/mL ekstraktu drożdżowego, 10 mg/mL NaCl, 15 mg/mL agaru, ddH₂O i 10 ng/μL ampicyliny). Rozprzestrzenić komórki na płytce i inkubować płytkę w 37°C przez noc.
10. Wyizolować pojedyncze kolonie z płytek i zaszczepić w 5 mL kulturach zawierających podłoże LB/ampicylina (10 mg/mL tryptonu, 5 mg/mL ekstraktu drożdżowego, 10 mg/mL NaCl, 10 ng/μL ampicyliny, ddH₂O). Inkubować z wytrząsaniem w 37°C przez 16-20 godzin.
11. Przeprowadzić miniprep DNA przy użyciu zestawu Nucleospin Plasmid kit (Macherey-Nagel). Przeprowadzić jakościową analizę produktu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Ilościowo określić wydajność DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop 20c (Thermo Scientific).
12. Zweryfikować wprowadzenie mutacji poprzez sekwencjonowanie DNA.

3. Synteza mRNA

1. Aby zlinearyzować DNA, poddaj 3 μg plazmidowego DNA w 50 L objętości reakcyjnej trawieniu za pomocą 5 μL odpowiedniego buforu i 1 μL enzymu restrykcyjnego przez 1 godzinę w temperaturze 37.0°C.
2. Używając zestawu High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science), dodaj 350 μL buforu wiążącego do probówki z trawionym DNA i krótko wymieszaj na wortexie. Zestaw ten jest stosowany, ponieważ zawiera izKtiocyjanian guanidyny, co zapewnia produkt o czystości odpowiedniej dla RNA.
3. Umieść kolumny wirowkowe w probówkach zbiorczych i naładuj kolumnę roztworem trawionego DNA. Wirowaj przy 18,0g przez 20 sekund i odrzuć frakcję przepuszczoną.
4. Dodaj 50 μL buforu do płukania do kolumny. Wirowaj przez 20 sekund przy 18,00g i odrzuć frakcję przepuszczoną.
5. Dodaj 20 μL buforu do płukania do kolumny. Wirowaj przez 30 sekund lub do całkowitego osuszenia kolumny przy 18,0g.
6. Umieść kolumnę wirowkową w autoklawowanej probówce wirówkowej o pojemności 1.5 mL i dodaj do kolumny 50 μL wody traktowanej DEPC. Eluuj poprzez wirowanie przez 30 sekund przy 18,0g.
7. Skoncentruj eluoowane DNA do objętości około 15 μL, co pozwoli uzyskać 0,5 μg w 3 μL roztworu.
8. Wybierz odpowiedni zestaw mMessage mMachine Kit (Ambion) zgodnie z sekwencją miejsca promotora w plazmidowym DNA (SP6, T7). Dodaj 5 μL mieszaniny 1 NTP-cap, 3 μL zlinearyzowanego DNA z poprzedniego kroku, 1 μL buforu do transkrypcji i 1 μL odpowiedniej polimerazy RNA. Inkubuj przez 1,5-2 godziny w temperaturze 37°C.
9. Dodaj 12,5 μL LiCl z zestawu, 15 μL wody DEPC, wymieszaj krótko (nie używaj wortexa), wirowaj przy 1,0g przez 10 sekund i przechowuj w temperaturze -20°C przez co najmniej 30 minut w celu wytrącenia.
10. Wstępnie schłodź wirówkę do 4°C i wirowaj przez co najmniej 15 minut z maksymalną prędkością po zakończeniu procesu wytrącania.
11. Po wirowaniu na dnie probówki powinien być widoczny brązowy osad. Ostrożnie i całkowicie usuń naddatek i dodaj 150 μL 70% etanolu o czystości odpowiedniej dla RNA, schłodzonego do -20°C. Wirowaj w temperaturze 4°C przez 5 minut z maksymalną prędkością.
12. Całkowicie usuń naddatek, krótko osusz (1-2 min) w urządzeniu Eppendorf Vacufuge Plus i rozpuść teraz biały osad w 12 μL wody DEPC. Ilościowo określ wydajność mRNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop 20c (Thermo Scientific).

4. Usuwanie oocytów

1. Niniejszy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) WPI.
2. Przed operacją żabę należy poddać 12-godzinnemu głodzeniu, aby zapobiec wymiotom podczas zabiegu.
3. Przygotować roztwór z 0,5–3,0 g MS-2 rozpuszczonego w wodzie. Dodawać wodorowęglan sodu do momentu uzyskania pH roztworu w zakresie 7,0–8,0. MS-2 jest stosowany jako środek znieczulający dla żaby podczas operacji. Podczas pracy z MS-2 oraz przy przygotowywaniu roztworu w dygestorium niezbędne jest stałe noszenie rękawiczek nitrylowych.
4. Zanurz żabę w roztworze MS-2, aż zwierzę utraci odruch prostowania oraz odruchy z palców. Aby sprawdzić brak reakcji, uciśnij palec żaby.
5. Umieść żabę stroną grzbietową na chłonnej stronie wilgotnej pieluchy. Zapobiega to uszkodzeniu skóry żaby. Przez cały czas trwania operacji w bezpośrednim sąsiedztwie żaby należy trzymać wilgotny ręcznik papierowy, ponieważ zwierzę musi pozostawać nawilżone. Jeśli oczy żaby są otwarte, należy je zwilżyć roztworem soli fizjologicznej. Jeśli żaba wykazuje oznaki wybudzania się, nalej na nią roztwór anestetyka i poczekaj, aż zwierzę przestanie reagować. Przed kontynuowaniem procedury wykonaj ponowne uciśnięcie palca.
6. Wykonaj niewielkie nacięcie coelomiczne po lewej lub prawej stronie linii środkowej żaby. Podczas kolejnych zabiegów nacięcia należy wykonywać naprzemiennie po obu stronach.
7. Wyprowadź jajnik na zewnątrz ciała żaby i usuń go. Unikaj kontaktu jajników ze skórą żaby. W przypadku wystąpienia krwawienia uciskaj miejsce krwawienia sterylnym patyczkiem higienicznym do momentu jego ustąpienia.
8. Zaszyj nacięcie, stosując szew przerywany z użyciem materiału szewnego Ethicon Vicryl 3.0-4.0 (Johnson & Johnson). Podczas szycia należy używać narzędzi chirurgicznych do wiązania każdego węzła pojedynczo i unikać dotykania skóry żaby. Ważne jest również, aby oddzielnie zszywać warstwy jamy ciała oraz skórę. Jest to zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi pobierania jaj i oocytów w Xenopus laevis (patrz: **Kultura i mikroiniekcje oocytów Xenopus** **Przegląd** Oocyty *Xenopus laevis* (żaby afrykańskiej) są powszechnie wykorzystywanym systemem modelowym w biologii komórki i biologii molekularnej. Są to duże, stabilne komórki, które pozwalają na łatwą manipulację i analizę procesów takich jak transport białek, sygnalizacja receptorowa oraz ekspresja genów. Dzięki swojemu rozmiarowi oocyty te umożliwiają bezpośrednią mikroiniekcję RNA, białek oraz małych cząsteczek, co czyni je idealnym narzędziem do badań nad funkcją białek w środowisku komórkowym. **Materiały i odczynniki** * Samice *Xenopus laevis* * HCG (gonadotropina kosmotropowa ludzka) * Bufor Steinberg (1/2 X): 5,36 mM KCl, 1,5 mM NaCl, 2,68 mM $\text{CaCl}_2$, 1,5 mM $\text{MgCl}_2$, pH 6,8 * Bufor ORY (Medium do hodowli oocytów): 50 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM $\text{MgCl}_2$, 2,5 mM $\text{CaCl}_2$, 5 mM HEPES, pH 7,4 * Woda dublowana (dd$\text{H}_2\text{O}$) * Sól fizjologiczna (0,9% NaCl) * Wazelina * Mikropipety szklane * Mikromanipulator * Mikroskop odwrócony **Procedura** **1. Indukcja owulacji** Samice *Xenopus laevis* są stymulowane do owulacji poprzez wstrzyknięcie HCG. 1. Zważ samicę, aby określić dawkę HCG (zazwyczaj 50–100 jednostek międzynarodowych na 10 g masy ciała). 2. Wstrzyknij roztwór HCG w okolice grzbietową, tuż pod skórę. 3. Przechowuj samicę w wodzie z dodatkiem antybiotyków i utrzymuj stałą temperaturę wody (ok. 18–20°C). 4. Oocyty są zazwyczaj dostępne do zbioru po 2–5 dniach od indukcji. **2. Zbieranie oocytów** 1. Zanurz samicę w roztworze znieczulającym (np. MS-22), aby zminimalizować stres zwierzęcia. 2. Wykonaj nacięcie w okolicy brzusznej, aby uzyskać dostęp do jam ciała. 3. Delikatnie wyciśnij oocyty z jajników do naczynia zawierającego bufor Steinberg lub roztwór soli fizjologicznej. 4. Przepłucz oocyty kilkakrotnie w buforze Steinberg, aby usunąć resztki tkanek i zanieczyszczenia. **3. Selekcja oocytów** 1. Pod mikroskopem odwróconym wybierz zdrowe oocyty. 2. Charakterystyczne cechy zdrowych oocytów to: gładka powierzchnia, jednolita struktura cytoplazmy i obecność wyraźnego jądra komórkowego. 3. Odrzuć oocyty, które są pomarszczone, mają niejednolitą strukturą lub wykazują oznaki degradacji. **4. Mikroiniekcja** 1. Umieść wybrane oocyty na szalce Petriego pokrytej cienką warstwą wazeliny, aby zapobiec ich przemieszczaniu się. 2. Użyj mikromanipulatora do precyzyjnego ustawienia szklanej mikropipety. 3. Wprowadź igłę przez błonę komórkową do wnętrza oocytu (zazwyczaj do obszaru wegetacyjnego). 4. Wstrzyknij odpowiednią objętość roztworu (np. RNA lub białka), dbając o to, aby nie uszkodzić nadmiernie komórki. 5. Powoli wycofaj igłę i przenieś oocyty do buforu ORY w celu inkubacji. **5. Inkubacja i przechowywanie** 1. Inkubuj oocyty w buforze ORY w temperaturze 18–2°C. 2. Wymieniaj pożywkę co 2–3 dni, aby utrzymać optymalne warunki wzrostu i stabilność pH. 3. Monitoruj stan oocytów pod mikroskopem; oocyty przeznaczone do analizy powinny być w stadium VI (dojrzałe). **Słowa kluczowe** *Xenopus laevis*, oocyty, mikroiniekcja, HCG, bufor Steinberg, ekspresja białek, model komórkowy).
9. Po zabiegu żaba nie może być poddawana kolejnej operacji przez co najmniej 2 miesiące. Należy również ocenić, czy żaba jest w wystarczająco dobrym stanie zdrowia, aby poddać się następnym zabiegom chirurgicznym. Na każdej żabie można wykonać maksymalnie 6 operacji z 6^th operacja ma charakter ostateczny.

5. Defokulacja oocytów i wstrzykiwanie mRNA

1. Wyizolowany płat jajnika należy podzielić nożyczkami na mniejsze części. Fragmenty przenosi się do roztworu Ringera + Ca²⁺ z kolagenazą (8,6 g/L NaCl, 0,3 g/L KCl i 0,3 g/L CaCl₂).
2. Roztwór trawienny należy delikatnie wstrząsać przez 2 h w temperaturze 18°C. Jeśli większość oocytów ulegnie rozdzieleniu, należy je przemyć roztworem Ringera – Ca²⁺ (8,6 g/L NaCl i 0,3 g/L KCl). Oocyty inkubuje się przez dziesięć minut w roztworze Ringera – Ca²⁺.
3. Oocyty przenosi się do roztworu Ringera + Ca²⁺.
4. Do oocytów wstrzykuje się 25 ng mRNA w końcowej objętości 50 nL za pomocą wtryskiwacza Nanoject II Auto-Nanoliter Injector (Drummond) z użyciem kapilar Drummond o długości 3,5". Uwaga: Ilość mRNA różni się w zależności od białka docelowego.
5. Po wstrzyknięciu oocyty inkubuje się przez 3–7 dni w roztworze Ringera (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl₂, pH 7,4) z dodatkiem 1 mg/mL gentamyciny w temperaturze 18°C w ciemności⁸.

6. Specyficzne znakowanie fluorescencyjne w określonym miejscu

1. Przed pomiarem inkubować oocyty przez 45 min w buforze do ładowania (10 mM NaCl, 2,5 mM cytrynianu sodu oraz 10 mM MOPS/Tris przy pH 7,4), a następnie przez 45 min w buforze po ładowaniu (10 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂ oraz 10 mM MOPS/Tris przy pH 7,4), aby zwiększyć wewnątrzkomórkowe stężenie Na⁺¹⁴.
2. W przypadku pomiarów fluorescencji inkubować oocyty przez 5–10 minut w buforze po ładowaniu zawierającym 5 μM odpowiedniego fluoroforu [np. tetrametylorodaminy-6-maleimidu (TMRM) lub fluoresceiny-5-maleimidu (FM)]. Po znakowaniu fluoroforem dokładnie przemyć oocyty buforem po ładowaniu bez barwnika³.

7. Elektrofizjologia

1. Wykonaj mikroelektrody poprzez wyciąganie kapilar borokrzemianowych (1B150F-4, World Precision Instruments) przy użyciu wyciągarki do mikropipet (Model PC-10, Narishige). Napełnij elektrody 3 M KCl i sprawdź ich oporność. Oporność powinna wynosić od 0,5-1,5 MΩ¹⁵.
2. Wyposaż mikroskop fluorescencyjny (Carl Zeiss, Axio Examiner Fluorescence Microscope) w filtr wzbudzenia 535DF50, filtr emisji 565 EFLP oraz lustro dichroiczne 570DRLP (Omega Optical) do eksperymentów z mapowaniem cystein.
3. Umieść oocyt w komorze RC-10 (Warner Instruments) na stole mikroskopu fluorescencyjnego i ostrożnie wprowadź wykonane elektrody do oocytu. Używając wzmacniacza Turbo Tec-05X (NPI Electronics), utrzymuj potencjał błonowy na stałym poziomie i mierz strumień jonowy przez błonę po wymianie roztworu lub poprzez zmianę potencjału błonowego. Do jednoczesnych pomiarów fluorescencji użyj wolframowego źródła światła o mocy 10 W do wzbudzenia fluoroforu donora oraz fotodiody PIN-02A (United Detector Technologies) do detekcji zmian natężenia fluorescencji. Zarówno wzmacniacz, jak i fotodioda są połączone, za pośrednictwem systemu akwizycji danych Digidata 140A (Axon Instruments), z komputerem wykorzystującym oprogramowanie pCLAMP10 (Axon Instruments) do zbierania i rejestrowania danych.
4. W przypadku mapowania cystein mierz zmianę natężenia fluorescencji przy prądzie stacjonarnym, stosując skoki napięcia kontrolowane przez oprogramowanie pCLAMP 10 (Molecular Devices). W zależności od badanego białka błonowego, roztwór zewnątrzkomórkowy jest tak dobrany, aby zapewnić prąd stacjonarny.
5. Powiąż zmiany natężenia fluorescencji z pomiarami funkcjonalnymi badanego białka.

8. Pomiary anizotropii i wyznaczanie ograniczeń odległości.

1. Pomiary anizotropii należy przeprowadzać równocześnie z pomiarami odległości.⁸ aby obliczyć zakres κ² wartości. Anizotropia mierzy względną mobilność fluoroforu wynikającą z rotacji¹⁶Przy użyciu filtrów polaryzacyjnych (Linos Photonics Inc.) zmierzono natężenie światła emitowanego równolegle i prostopadle przez FM lub TMRM po wzbudzeniu światłem spolaryzowanym w obszarze zainteresowania pozostałości aminokwasowych. Pomiary przeprowadzono w warunkach wymiany roztworu.⁸ or stałego potencjału błonowego w celu określenia mobilności fluoroforów.
2. Anizotropia jest określana wzorem r = (I_||-I_⊥)/(I_|| + 2I_⊥) gdzie I_|| emitowane jest światło równoległe i I_⊥ czy emitowane jest światło prostopadłe¹⁶Aby obliczyć błąd pomiarów odległości, κ²_maksymalny = 2/3(1 + F_rd + F_ra + 3F_rd * F_ra) oraz κ²_min = 2/3(1-(F_rd + F_ra)/2) gdzie F_{Badania i rozwój} = (r_d/r_o)^0.5 oraz F_ra = (r_a/r_o)^0.5; r_a anizotropia TMRM, r_d jest anizotropia FM i r_o jest fundamentalna anizotropia każdego fluoroforu⁸.
3. Aby zmierzyć ograniczenia odległości, należy użyć holoenzymu posiadającego dwie dostępne pozakomórkowe reszty cysteiny. Ponieważ oocyty będą utrzymywane przy stałym potencjale błonowym, a tym samym stałej odległości podczas pomiarów, zmiana fluorescencji w zależności od stanu konformacyjnego białka nie jest wymagana. Inkubować oocyty w buforze po ładowaniu zawierającym 1 μM FM (fluorofor akceptor) i 4 μM TMRM (fluorofor donora) przez 30 minut na lodzie w ciemności, lub tylko 1 μM FM. Pozwala to na wykonywanie pomiarów holoenzymów znakowanych z użyciem akceptorowego fluoroforu oraz bez niego.⁸Wyposażyć mikroskop w filtr wzbudzenia 475DF40, filtr emisyjny 530DF30 oraz lustro dichroiczne 505DRLP.
4. Zmierz zależność czasu od wybielania donora w obecności i przy braku fluoroforu akceptora. Podczas tych pomiarów przepływ roztworu powinien być ciągły; w przeciwnym razie z czasem może zostać zaobserwowany wzrost fluorescencji wywołany ciepłem. Różnica w fotodestrukcji z dodatkiem fluoroforu akceptora i bez niego jest wykorzystywana do obliczenia odległości między dwiema resztami. Holoenzymy zawierające tylko fluorofor donor wykazują szybsze tempo fotodestrukcji niż holoenzymy z fluoroforem akceptorem. Holoenzymy zawierające zarówno fluorofor donor, jak i akceptor, wykazują wolniejsze tempo fotodestrukcji, gdy znajdują się one w bliskim sąsiedztwie.⁸.
5. Korzystając z funkcji Clampex w programie pClamp10, oblicz średnią wyników fotodestrukcji fluoroforu donora dla co najmniej czterech pomiarów z oocytów.
6. Po uśrednieniu wyników należy zastosować funkcję wykładniczą (jedno- lub dwuwykładniczą), aby uzyskać krzywą dopasowania. Krzywą dopasowania można wykorzystać do wyznaczenia stałej czasowej fotodestrukcji fluoroforu donora w obecności i pod nieobecność akceptora.
7. Wyznacz efektywność transferu energii zgodnie z równaniem E = 1-Γ_DA/Γ_D¹⁷, gdzie GDA oznacza stałą czasową dla pary fluoroforów donora/akceptora, a Γ_D odnosi się do stałej czasowej wyłącznie dla fluoroforu donora.
8. Korzystając z równania Förstera17, E = 1/(1+R⁶/R_o⁶), można wyznaczyć odległość między znakowanymi resztami cysteiny; E to wydajność FRET, R to odległość między fluoroforem donorem a akceptorem, a R_o czy jest to odległość dla 50% wydajności parowania donora i akceptora¹⁷R_o jest opisany równaniem R_o = (9,7x10³ JΦ_Dn^-4 κ²) gdzie J jest znormalizowanym nakładaniem się widm emisyjnego donora i absorpcyjnego akceptora, Φ_D jest wydajnością kwantową emisji donora bez fluoroforu akceptora, n to współczynnik załamania światła, a κ² jest czynnikiem orientacyjnym dla oddziaływań dipol-dipol⁸.

9. Względny ruch podjednostek białkowych

1. Należy użyć konstruktów z podwójną cysteiną, znakowanych fluoroforami akceptorowymi i donorowymi. W tych eksperymentach mierzona będzie zmiana odległości między dwiema resztami cysteiny. W związku z tym natężenie fluorescencji po znakowaniu każdej z reszt powinno być niezależne od stanu konformacyjnego białka⁸. Zatem każda zmiana w transferze energii rezonansowej fluorescencji będzie wynikiem zmiany odległości między fluoroforem donorowym a akceptorowym.
2. Mikroskop należy wyposażyć w filtr wzbudzenia 475AF40, filtr emisyjny 595AF60 oraz lustro dichroiczne 505DRLP. W tych eksperymentach wzbudzany jest donor i mierzona jest fluorescencja fluoroforu akceptorowego. Należy zastosować odpowiednią metodę (napięcie, ligand, wymiana roztworu), aby aktywować białko błonowe i jednocześnie zmierzyć zmianę natężenia fluorescencji. Wzrost natężenia fluorescencji będzie wskazywać, że dwa fluorofory, a tym samym dwie reszty, zbliżają się do siebie. Spadek natężenia fluorescencji będzie wskazywać, że dwa fluorofory, a tym samym dwie reszty, oddalają się od siebie. Brak zmiany natężenia fluorescencji będzie oznaczał, że dwa fluorofory, a tym samym dwie reszty, pozostają w tej samej odległości przy zmianie konformacji białka.

10. Reprezentatywne wyniki

Znakowanie pozakomórkowych reszt cysteiny specyficznymi fluoroforami umożliwia badanie ruchu białek błonowych podczas zmian konformacyjnych. Typowy zapis fluorometrii z zaciskiem napięciowym przedstawiono na Rysunku 1. Zmiana intensywności fluorescencji (dolny zapis), która wynika z przemieszczenia się fluoroforu z środowiska bardziej hydrofilowego do bardziej hydrofobowego lub ze środowiska silniej wygaszanego przez wodę do słabiej wygaszanego, jest efektem zmiany konformacyjnej białka po wymianie roztworu (górny zapis).

Tę technikę można rozszerzyć w celu wyznaczenia ograniczeń odległości między dwiema resztami. Takie wyniki eksperymentalne przedstawiono na Ryc. 2. W obecności fluoroforu akceptora (czerwony) fotowybielanie zachodzi wolniej niż bez fluoroforu akceptora (czarny). Szybkość fotowybielania jest bezpośrednio powiązana z odległością między dwoma fluoroforami zgodnie z równaniem Förstera¹⁷. Takie wyniki można powiązać z różnymi stanami konformacyjnymi białka, co zostało potwierdzone w eksperymentach z dwuelektrodową metodą clampy napięciowej przeprowadzonych tandemowo.

Rysunek 1. Reprezentatywny zapis transportu jonów i zmian intensywności fluorescencji. Góra: pomiary w trybie current clamp w obecności Na+⁺ roztwór próbny i K⁺ roztwór testowy w obecności 10 μM oraz 10 mM ouabainy. Na dole zmiany intensywności fluorescencji mierzone równocześnie z pomiarami w trybie clamp prądowy^3,8,19.

Rycina 2. Zależność fotoblaknięcia od czasu. Fotodestrukcję donora zmierzono w obecności (kolor czerwony) oraz w nieobecności (kolor czarny) fluoroforu akceptora. Każka krzywa stanowi średnią z 4 pomiarów wykonanych na oocytach.

Dyskusja

Opisane przez nas podejście eksperymentalne łączy specyficzne dla danej lokalizacji znakowanie fluoroforem oraz metodę clampowania napięcia z użyciem dwóch elektrod, aby zbadać związek między strukturą a funkcją białek błonowych. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania informacji o rozdzielczości czasowej na temat dynamiki konformacyjnej białek błonowych podczas transportu jonów. Co więcej, podejście to można dostosować do pracy z różnymi białkami, takimi jak pompy jonowe, kanały jonowe i transportery.

Oprócz badania dynamiki konformacyjnej w konkretnym residuum, możliwe jest również wykorzystanie transferu energii rezonansowej fluorescencji do określenia ograniczeń odległości w obrębie holoenzymu. Wyznaczanie odległości między residuami, a także pomiar względnego ruchu między podjednostkami, może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań dotyczących mechanizmów bramkowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Źródło światła wolframowego 100W	Carl Zeiss, Inc.
1B150F-4	World Precision Instruments, Inc.
3.0-4.0 Ethicon Vicryl	Johnson & Johnson
Filtr wzbudzenia 475AF40	Omega Optical
Lustro dichroiczne 505DRLP	Omega Optical
Macherey-Nagel	Omega Optical
Filtr wzbudzenia 535DF50	Omega Optical
Lustro dichroiczne 560DRLP	Omega Optical
Filtr emisji 565ALP	Omega Optical
Filtr emisji 565EFLP	Omega Optical
Lustro dichroiczne 570DRLP	Omega Optical
Linos Phtonics Inc.	Omega Optical
Mikroskop fluorescencyjny Axio Examiner	Carl Zeiss, Inc.
Warner Instruments	Life Technologies
System akwizycji danych Digidata 1440A	Axon Instruments
Dpn I	New England Biolabs
fluoresceina-5-maleimid	Invitrogen
Zestaw do ekstrakcji PCR High-Pure	Roche Group
Zestaw mMessage mMachine	Ambion
MS-222	Sigma-Aldrich
Zestaw do izolacji plazmidów Nucleospin	Macherey-Nagel
Spektrofotometr Nanodrop 2000c	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Wytwornica mikropipet PC-10	Narishige International
Oprogramowanie pCLAMP 10	Axon Instruments
Polimeraza DNA PfuTurbo	Stratagene, Agilent Technologies
Fotodioda PIN-022A	United Detector Technologies
Filtry polaryzacyjne	Linos Phtonics Inc.
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej QuickChange	Stratagene, Agilent Technologies
Komora fluorescencyjna RC-10	Warner Instruments
tetrametylorodamina-6-maleimid	Invitrogen
Komórki elektrokompetentne TOP10	Invitrogen
Wzmacniacz Turbo Tec-05X	npi electronic