W niniejszej pracy pokazujemy, jak wykorzystać test ligacji bliskości (Proximity Ligation Assay, PLA) wraz z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (Bone Morphogenetic Protein, BMP) w utrwalonych komórkach. Technika ta pozwoliła nam śledzić nuklearną akumulację endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych przez BMP oraz ilościowo określić ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.
Artykuł metodologiczny
Wykrywanie kompleksów efektorowych szlaków sygnalizacyjnych downstream BMP4 przy użyciu in situ PLA, testu ligacji w bliskości
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Białka BMP odpowiadają za szeroki zakres efektów rozwojowych i biologicznych. Receptory BMP aktywują (fosforylują) efektory Smad1/5/8, które następnie tworzą kompleks z Smad4 i przemieszczają się do jądra komórkowego, gdzie pełnią funkcję czynników transkrypcyjnych w celu zainicjowania specyficznych efektów downstream BMP 1. Tradycyjne techniki immunofluorescencji z użyciem przeciwciał przeciwko peptydom phospho-Smad charakteryzują się niską czułością, wysokim tłem i oferują jedynie przybliżoną kwantyfikację, ponieważ opierają się na intensywności sygnału przeciwciał, szczególnie jeśli jest to fluorescencja światłoczuła. Ponadto nie wszystkie phospho-Smad muszą znajdować się w kompleksie z Smad4 i brać udział w aktywnej transkrypcji.
In situ PLA to technologia zdolna do wykrywania oddziaływań białkowych z wysoką specyficznością i czułością 2-4. Ta nowa technologia łączy rozpoznawanie przez przeciwciała z amplifikacją DNA będącego substytutem białka. Generuje ona zlokalizowany, dyskretny sygnał w formie punktów, ujawniający dokładną pozycję zdarzenia rozpoznania. Liczbę sygnałów można zliczyć i porównać, co pozwala na przeprowadzenie pomiaru. Zastosowaliśmy metodę in situ PLA, korzystając z zestawu Duolink oraz kombinacji przeciwciał umożliwiającej wykrycie efektorów sygnalizacji BMP, phospho-Smad1/5/8 i Smad4, tylko wtedy, gdy znajdują się one w bliskim sąsiedztwie, t.j. w kompleksie, co następuje jedynie podczas aktywacji sygnalizacji. Pozwoliło to po raz pierwszy na wizualizację i pomiar endogennej sygnalizacji BMP z wysoką specyficznością i czułością w eksperymencie z przebiegiem czasowym pod wpływem stymulacji BMP4.
Protokół
1. Wysiewanie komórek i traktowanie BMP
- Hodować komórki Neuro2a w pożywce GMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x nieessentialne aminokwasy (NEAM), 1x pirogronian sodu i 1x L-glutaminę. Przeszczepić komórki z użyciem trypsyny (0.05%-EDTA) i wysiać 15.000-20.000 komórek na dołek w 16-dołkowym szkiełku z komorami.
Hodować komórki HEK293T lub Cos7 w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS, 1x L-glutaminę oraz 1x penicylinę/streptomycynę. Sterylizować szkiełka z polizyną poprzez zanurzenie ich w 70% etanolu, a następnie za pomocą pisaka Immedge wyznaczyć dołki o powierzchni 1 cm2. Przeszczepić komórki z użyciem trypsyny (0.05%-EDTA) i wysiać 20.000-25.000 komórek na dołek w 50 μl pożywki. - Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.
- Po 24 h zastąpić pożywkę bezsurowiczą GMEM (uzupełnioną o 0.1% albuminy, 1x NEAM, 1x pirogronian sodu i 1x L-glutaminę) dla komórek Neuro2a lub bezsurowiczą DMEM (uzupełnioną o L-glutaminę i 1x penicylinę/streptomycynę) dla komórek HEK293T/Cos7 i inkubować komórki przez 2-3 h. Trzy dołki z komórkami pozostawić w standardowych warunkach hodowli (tj. 10% FBS), aby służyły jako kontrole.
- Potraktować komórki dorsomorfinią (inhibitor szlaku BMP, 2 μM) lub BMP4 (25 ng/ml) przez wymagany czas (np. od 10 min do 1 h) 5.
2. Fiksacja i permeabilizacja
- Przygotować utrwalacz, 4% PFA. Odważyć 4 g PFA, aby przygotować 4% roztwór w 100 ml PBS. Podgrzewać roztwór w temperaturze 50°C do momentu, aż stanie się przejrzysty. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia. Należy używać świeżego utrwalacza (przechowywanego nie dłużej niż 2 dni).
- Odssać medium z dołków i przemyć 1xPBS. Nie pipetować roztworów bezpośrednio na komórki, ponieważ może to spowodować ich odklejenie. Przed przejściem do kolejnego kroku, w przypadku stosowania szkiełek z komorami, należy usunąć komory, pozostawiając silikon wokół dołków.
- Dodać 50 μl 4% PFA i inkubować przez 10 min w temperaturze RT, bez mieszania.
- Przemyć komórki w PBS (3 x 5 min) w naczyniu Coplina z mieszaniem w temperaturze RT.
- Potraktować komórki roztworem 0,5% Triton X-100 w PBS przez 10 min bez mieszania w temperaturze RT.
- Przemyć komórki roztworem 0,05% Tween 20 w TBS (TBS-T) (3 x 5 min) w naczyniu Coplina z mieszaniem w temperaturze RT.
3. Blokowanie
- Odlej TBS-T. Dodaj jedną kroplę roztworu blokującego Duolink II Blocking Solution (1x) do każdej studzienki.
- Inkubuj szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 h w temperaturze 37°C.
4. Przeciwciała pierwszorzędowe
- Wymieszać i rozcieńczyć przeciwciało a-P-Smad1/5/8 (królicze poliklonalne) w stosunku 1:100 oraz przeciwciało a-Smad4 (mysie monoklonalne) w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku do przeciwciał Duolink II Antibody Diluent (1x). Przygotować również osobne roztwory a-P-Smad1/5/8 i a-Smad4 w tych samych stężeniach do wykorzystania w kontrolach.
- Odssać roztwór blokujący z preparatów. Usunąć jak najwięcej roztworu blokującego, dbając jednocześnie o to, aby komórki nie wyschły przed dodaniem przeciwciał. Do dołków dodać po 40 μl roztworów przeciwciał. W jednym dołku dodać wyłącznie Antibody Diluent jako dodatkową kontrolę negatywną.
5. Sondy PLA
- Rozcieńczyć dwie sondy PLA (Duolink II anti-Mouse MINUS oraz Duolink II anti-Rabbit PLUS) w stosunku 1:5 w Antibody Diluent.
- Usunąć roztwór przeciwciał pierwszorzędowych z prowadnic. Prowadnice płukać 2 razy po 5 min za pomocą 1x Duolink II Wash Buffer A w słoiku Coplina przy mieszaniu w RT.
- Usunąć Wash Buffer A z prowadnic i dodać roztwór sond PLA (40 μl/dołek).
Inkubować prowadnice w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 h w 37°C.
6. Ligacja
- Wymieszać roztwór Duolink II Ligation stock (5x) za pomocą vortexa, rozcieńczyć w stosunku 1:5 w wodzie wysokiej czystości i wymieszać. Obliczając objętość wody, należy uwzględnić objętość ligazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:40 bezpośrednio przed dodaniem mieszaniny do dołków.
- Odlać roztwór sond PLA z szkiełek. Płukać szkiełka w 1x Wash Buffer A dwukrotnie przez 5 min każde w naczyniu Coplina z wytrząsaniem w RT.
- Wyjąć ligazę z zamrażarki, używając bloku chłodzącego (-20°C). Dodać ligazę do roztworu ligacji (przygotowanego w punkcie 6.1) w rozcieńczeniu 1:40 i wymieszać za pomocą vortexa.
- Odlać Wash Buffer A ze szkiełek i dodać do każdego dołka roztwór ligacji z ligazą (40 μl/dołek). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 min w 37°C.
7. Amplifikacja
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
- Rozcieńczyć roztwór zapasowy Duolink II Amplification (5x) w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać. Przy obliczaniu objętości wody należy uwzględnić objętość polimerazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:80 tuż przed dodaniem mieszaniny do dołków.
- Odlać roztwór Ligation-Ligase z szkiełek. Płukać szkiełka w 1x Wash Buffer A dwukrotnie po 2 min każdorazowo w naczyniu Coplina przy mieszaniu w temperaturze pokojowej.
- Wyjąć polimerazę z zamrażarki, używając bloku chłodzącego (-20°C). Dodać polimerazę do roztworu Amplification (przygotowanego w punkcie 7.1) w rozcieńczeniu 1:80 i wymieszać w wirówce typu vortex.
- Odlać Wash Buffer A z szkiełek i dodać roztwór Amplification-Polymerase do każdego dołka (40 μl/dołek). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 min w temperaturze 37°C.
8. Przygotowanie do obrazowania
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
- Odlać roztwór Amplification-Polymerase z szkiełek i przemyć dwukrotnie po 10 min każdy w 1x Duolink II Wash Buffer B w naczyniu Coplin przy mieszaniu w RT.
- Zanurzyć szkiełka w 0.1 x Wash Buffer B.
- Całkowicie usunąć silikon ze szkiełka 16-dołkowego. Nanieść ~ 40μl Duolink II Mounting Medium z DAPI na szkiełko zakrywowe i delikatnie umieścić je nad próbkami, lekko dociskając, aby pod szkiełkiem zakrywowym nie pozostały pęcherzyki powietrza. Przymocować i uszczelnić szkiełko zakrywowe na szkiełku przedmiotowym za pomocą lakieru do paznokci. Odczekać co najmniej 15 min przed przystąpieniem do obrazowania.
- Przeanalizować próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Wykonać zdjęcia cyfrowe.
9. Ilościowe oznaczenie
Uwaga: Odczynniki światłoczułe. Przechowywać preparaty w warunkach chroniących przed światłem.
- Użyj programu Duolink ImageTool, aby zliczyć sygnały na obrazach i uzyskać pomiar poziomu sygnalizacji.
- Porównaj pomiary i sporządź wykres.
10. Reprezentatywne wyniki
Wynik eksperymentu PLA in situ przejawia się w postaci oddzielnych fluorescencyjnych punktów. Lokalizacja sygnału zależy od badanych konkretnych białek.
Rycina 1. In situ PLA na komórkach Neuro2a po stymulacji BMP4. Komórki traktowano 2 μM dorsomorfiny (inhibitora szlaku BMP) (A) lub 25 ng/ml BMP4 (B) przez 60 min lub pozostawiono nieleczone (C-E). Do wykrywania aktywnych kompleksów w A i B użyto przeciwciał przeciwko P-Smad1/5/8 oraz Smad4. Jako kontrole zastosowano przeciwciała pierwotne a-P-Smad1/5/8 samodzielnie (C), a-Smad4 samodzielnie (D) lub pominięto przeciwciała pierwotne (E). Niebieski: DAPI; Czerwony: sygnał PLA. Zdjęcia wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica SP5.
(F) Sygnały PLA policzono za pomocą oprogramowania Duolink ImageTool, a średnią liczbę plamek w jądrze na komórkę przedstawiono na wykresie. (G) Komórki Neuro2a pozostawiono bez inkubacji lub poddano działaniu dorsomorfiny (2 μM) bądź BMP4 (25 ng/ml) przez 60 min. Komórki poddano lizie, a białka rozdzielono metodą SDS-PAGE i przeanalizowano za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciał a-P-Smad1/5/8 oraz a-PCNA jako kontroli załadunku. (*) prążek nieswoisty. Należy zauważyć, że przeciwciało a-P-Smad1/5/8 nie odróżnia 3 różnych białek obecnych w kompleksie z Smad4.
Dyskusja
Wizualizacja kompleksów białkowych in situ jest bardzo pożądana, szczególnie w badaniach nad sygnalizacją, gdzie oddziaływania białek i ich modyfikacje są mechanizmami wykorzystywanymi przez komórki do przesyłania sygnałów z powierzchni do jądra. Dotychczas nie było możliwości wizualizacji i kwantyfikacji kompleksów dwóch białek endogennych in situ za pomocą immunofluorescencji. Kolokalizacja przeciwciał charakteryzuje się niską rozdzielczością i nie może być stosowana do obrazowania rzeczywistych oddziaływań. PLA to nowa technika, którą badacze zaczęli z dużym sukcesem stosować w różnych systemach 6, 7. W niniejszej pracy demonstrujemy, jak wykorzystać PLA nie tylko do wizualizacji, ale także do kwantyfikacji endogennych kompleksów efektorów Smad aktywowanych w odpowiedzi na stymulację BMP w funkcji czasu. W tym celu wykorzystaliśmy różne linie komórkowe hodowle tkankowych, w tym Neuro2a, oraz opieraliśmy się na komercyjnych przeciwciałach wytworzonych w różnych gatunkach (mysie przeciw Smad4 i królicze przeciw P-Smad1/5/8) (ryc. 1). Metoda ta pozwoliła nam po raz pierwszy zaobserwować aktywację kompleksów efektorowych BMP w czasie, a nie tylko obecność fosforylowanych Smad1/5/8, z których nie wszystkie mogą być zaangażowane w aktywne kompleksy z Smad4. Policzyliśmy sygnały (ryc. 1F) i porównaliśmy ten pomiar z kwantyfikacją uzyskaną z immunoblottingu tych samych komórek 8 (rycina 1G). Wyciągnęliśmy wniosek, że liczba punktów stanowi dokładny pomiar porównawczy poziomów sygnalizacji w czasie. Technikę tę zastosowano również w innych liniach komórkowych (HEK293T i Cos7), uzyskując podobne wyniki (dane nie przedstawiono).
Zasada działania tej technologii opiera się na dwóch unikalnych sondach dostarczanych w zestawie Duolink. Każda sonda PLA składa się z przeciwciała wtórnego sprzężonego z unikalnym syntetycznym oligonukleotydem, który pełni rolę reportera. Bliskość sond umożliwia ligację DNA dokładnie w miejscu, w którym sondy te są przytwierdzone w bezpośrednim sąsiedztwie. Odległość między oligonukleotydami, która pozwala na hybrydyzację i ligację DNA, jest niewielka (<40nm), w związku z czym tylko oddziałujące ze sobą białka mogą doprowadzić do ligacji. Zligowane DNA może być następnie amplifikowane i wykrywane poprzez hybrydyzację z oznakowanymi oligonukleotydami komplementarnymi do amplifikowanej sekwencji. Amplifikacja jest specyficzna, ponieważ opiera się na zasadach hybrydyzacji DNA-DNA, a także zapewnia wysoką czułość, gdyż zligowane DNA jest powielane wielokrotnie, co prowadzi do wzmocnienia sygnału z początkowego zdarzenia ligacji. Amplifikowane DNA jest wykrywane poprzez hybrydyzację z oznakowanymi oligonukleotydami, co daje widoczny i stosunkowo duży punkt (spot). Ponieważ punkty te można zliczać, sygnał PLA dostarcza nie tylko dokładnych informacji przestrzennych (lokalizacji zdarzeń oddziaływania), ale także obiektywnej metody ilościowej oceny tych zdarzeń 2-4.
Inne techniki stosowane do wykrywania oddziaływań białkowych obejmują ko-immunoprecypitację, immunofluorescencję oraz transfer energii rezonansowej fluorescencji (FRET). Testy ko-immunoprecypitacji są szeroko stosowane, umożliwiając izolację kompleksów białkowych. Metodzie tej towarzyszy immunoblotting, co oznacza, że białka muszą być wyrażane na stosunkowo wysokim poziomie, aby mogły zostać wykryte. W ko-immunoprecypitacji czasami trudno jest wyeliminować problemy związane z wysokim tłem lub niespecyficznym wiązaniem niektórych białek do kulek. Ponadto testy ko-immunoprecypitacji pozwalają na wykrycie białek, które mogą być częścią kompleksu białkowego, ale nie potrafią odróżnić tych, które znajdują się w bardzo bliskiej odległości i oddziałują fizycznie ze sobą. Co więcej, ko-immunoprecypitacje nie zapewniają kwantyfikacji z rozdzielczością pojedynczych komórek ani informacji o lokalizacji kompleksów białkowych w komórce. Wykrywanie współistnienia kompleksów białkowych w komórce lub przedziale komórkowym za pomocą immunofluorescencji opiera się na nakładaniu się rozproszonych sygnałów, a zatem charakteryzuje się niską rozdzielczością przestrzenną i nie może dostarczyć dokładnych informacji o oddziaływaniach białek. Kwantyfikacja sygnału immunofluorescencyjnego może być przeprowadzona metodą szacunkową jedynie w przypadku, gdy różnica jest kilkukrotna, i nie może być tak dokładna ani mierzalna jak plamki PLA. FRET umożliwia wizualizację kompleksów białkowych w żywych komórkach i eliminuje konieczność stosowania przeciwciał oraz odsłaniania epitopu. Jednakże FRET zazwyczaj opiera się na nadekspresji sztucznie połączonych białek, co może nie odzwierciedlać endogennych kompleksów białkowych w taki sposób, jak ma to miejsce w PLA.
Warunki blokowania w protokole PLA są krytyczne, ponieważ może dojść do agregacji przeciwciał, co zwiększa tło. Alternatywne warunki blokowania można znaleźć w kartach produktów przeciwciał. Odpowiednie kontrole z pominięciem przeciwciał pierwotnych i wtórnych dostarczają informacji o potencjalnych błędach i muszą być one zawsze uwzględniane. Ważne jest przetestowanie różnych przeciwciał w celu wybrania tych, które dają najniższe tło podczas stosowania pojedynczo oraz najlepszy sygnał przy jednoczesnym użyciu. Fixacja komórek jest kluczowa, ponieważ nadmierne utrwalenie może spowodować całkowitą denaturację i degradację kompleksów białkowych, natomiast niewystarczająca fixacja może prowadzić do utraty kompleksów białkowych podczas poszczególnych etapów procedury. Można to kontrolować poprzez obniżenie stężenia utrwalacza do 3% lub ograniczenie czasu fixacji. Jednakże fixacja zależy również od tego, czy przeciwciała pierwotne rozpoznają białka zdenaturowane. Ponieważ technika PLA jest bardzo czuła, należy zachować szczególną staranność, aby czasy inkubacji i mikro warunki były jednakowe dla wszystkich próbek.
Próbki w żadnym przypadku nie powinny wyschnąć przed ostatnim etapem. Wyschnięcie próbek może prowadzić do zwiększenia tła. Całkowite usunięcie roztworu blokującego jest również krytyczne, aby uniknąć tła. Bufory do płukania powinny zawsze zostać doprowadzone do temperatury pokojowej przed użyciem, ponieważ niska temperatura spowalnia reakcje enzymatyczne. W celu dalszego rozwiązywania problemów należy zapoznać się z instrukcją do zestawu.
W celu ustalenia subkomórkowej lokalizacji sygnału PLA warto zastosować barwienia (np. DAPI, aktyny itp.). W tym przypadku wykorzystano DAPI (w medium montującym) do zabarwienia jąder komórkowych. Metoda PLA jest kompatybilna z immunofluorescencją z użyciem przeciwciał w celu określenia typu komórek lub przedziału komórkowego (nie pokazano tutaj). Dokładną kwantyfikację można przeprowadzić poprzez zliczanie sygnałów przy użyciu specjalistycznego oprogramowania (Duolink Image Tool, Olink Biosience).
Podsumowując, zademonstrowaliśmy sposób wykorzystania metody in situ PLA z użyciem zestawu Duolink do wykrywania sygnalizacji BMP w utrwalonych komórkach i przedstawiliśmy jej zalety: łatwość użycia, wysoką czułość, brak tła oraz unikalną zdolność do ilościowego określania aktywnej sygnalizacji BMP in situ.
Ograniczeniem w zastosowaniu tej techniki do badania różnych oddziaływań białkowych jest dostępność i jakość przeciwciał pierwszorzędowych rozpoznających badane białka.
Oświadczenia
Produkcja tego artykułu wideo była sponsorowana przez firmę OLINK, która wytwarza odczynnik stosowany w procedurze testu ligacji w pobliżu (proximity ligation assay).
Podziękowania
Badania te są finansowane z grantów MRC i BBSRC. Dziękujemy Agacie Ziebie i Katerinie Pardalis z laboratorium Ulfa Landegrena na Uniwersytecie w Uppsali za pomoc w przygotowaniu techniki oraz za pomocne rady. Dziękujemy firmie Olink Bioscience za pomoc techniczną i prezentację.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| GMEM | Invitrogen | 21710025 | |
| DMEM | Invitrogen | 21063029 | |
| FBS | AutogenBioclear | 7.01 | |
| Niezbędne aminokwasy | Invitrogen | 11149068 | |
| Pirowinian sodu | Invitrogen | 11360070 | |
| Penicylina / Streptomycyna | Invitrogen | 15140122 | |
| L-glutamina | Invitrogen | 25030-054 | |
| Trypsyna, 0.05% (1X) z EDTA 4Na, płyn | Invitrogen | 25300-054 | |
| Szkiełka komorowe 16-dołkowe | Lab-Tek | 178599 | |
| Polizyna | VWR international | 631-0107 | |
| Szkiełko zakrywkowe | VWR international | 631-0138 | |
| a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling Technology | 9511 | |
| a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-7966 | |
| Dorsomorfina | Merck & Co., Inc. | 171260-10MG | |
| Rekombinowany BMP-4 mysi | R&D Systems | 5020-BP-010 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween-20 | Promega Corp. | H5151 | |
| Odczynniki detekcyjne Duolink II (Orange) | Olink Bioscience | 92007-0100 | |
| Sonda PLA Duolink II anty-mysia MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | |
| Sonda PLA Duolink II anty-krolicza PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | |
| Medium montażowe Duolink II z DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | |
| Bufory płuczące Duolink II do fluorescencji | Olink Bioscience | 82049 |
Bibliografia
- Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. one morphogenetic protein receptors and signal transduction. J Biochem. 147, 35-51 (2010).
- Gustafsdottir, S. M. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).
- Soderberg, O. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).
- Soderberg, O. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45, 227-232 (2008).
- Yu, P. B. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).
- Baan, B. In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo. Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 Forthcoming.
- Massinen, S. Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia. Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).
- Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids. Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).
Przedruki i uprawnienia
