Wykrywanie sygnalizacyjnych kompleksów efektorowych za BMP4 za pomocą PLA in situ, testu ligacji zbliżeniowej

Summary

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA), z kombinacją przeciwciał do wizualizacji sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (BMP) w komórkach stałych. Technika ta pozwoliła nam śledzić akumulację jądrową endogennych kompleksów efektorowych aktywowanych BMP i określić ilościowo ich poziomy w czasie pod wpływem stymulacji BMP4.

Abstract

BMP są odpowiedzialne za szeroki zakres efektów rozwojowych i biologicznych. Receptory BMP aktywują (fosforylują) efektory Smad1/5/8, które następnie tworzą kompleks z Smad4 i przemieszczają się do jądra, gdzie działają jako czynniki transkrypcyjne, inicjując dalsze efekty specyficzne dla BMP ¹. Tradycyjne techniki immunofluorescencji z przeciwciałami przeciwko peptydom fosfo-Smad wykazują niską czułość, wysokie tło i oferują ogólną kwantyfikację, ponieważ opierają się na intensywności sygnału przeciwciała, szczególnie jeśli jest to światłoczuła fluorescencja. Ponadto fosfo-Smady mogą nie być w kompleksie z Smad4 i zaangażowane w aktywną transkrypcję.

In situ PLA to technologia zdolna do wykrywania interakcji białek z wysoką specyficznością i czułością ^2-4. Ta nowa technologia łączy rozpoznawanie przeciwciał z amplifikacją substytutu DNA białka. Generuje zlokalizowany, dyskretny sygnał w postaci plamek ujawniających dokładną pozycję zdarzenia rozpoznającego. Liczba sygnałów może być zliczana i porównywana, zapewniając pomiar. Zastosowaliśmy PLA in situ, przy użyciu zestawu Duolink, z kombinacją przeciwciał, która pozwala na wykrycie efektorów sygnalizacyjnych BMP phospho-Smad1/5/8 i Smad4 tylko wtedy, gdy znajdują się one w pobliżu, tj. w kompleksie, co występuje tylko przy aktywacji sygnalizacji. Pozwoliło to po raz pierwszy na wizualizację i pomiar endogennej sygnalizacji BMP o wysokiej swoistości i czułości w eksperymencie z przebiegiem czasu pod stymulacją BMP4.

Protocol

1. Posiewanie komórek i leczenie BMP

1. Hodowla komórek Neuro2a w GMEM uzupełniona o 10% FBS, 1x Aminokwasy endogenne (NEAM), 1x pirogronian sodu i 1x L-glutamina. Podziel komórki za pomocą trypsyny (0,05% -EDTA) i płytkę 15 000-20 000 komórek na dołek w 16-dołkowym szkiełku samochodowym.
   
   Hodowla HEK293T komórek lub Cos7 w DMEM uzupełnionych 10% FBS, 1x L-glutaminą i 1x penicyliną/streptomycyną. Sterylizuj szkiełka polisynowe, zanurzając je w 70% etanolu i używając pióra Immedge narysuj 1 cm² dołki. Podziel komórki za pomocą trypsyny (0,05% -EDTA) i płytka 20 000-25 000 komórek na dołek w pożywce 50 μl.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
3. Po 24 godzinach zastąp pożywkę surowicą GMEM wolną od surowicy (uzupełnioną 0,1% albuminy, 1x NEAM, 1x pirogronian sodu i 1x L-glutamina) dla Neuro2a lub z surowicą wolną od DMEM (uzupełnioną L-Glutaminą i 1x Penicyliną/Streptomycyną) dla HEK293T/Cos7 i inkubuj komórki przez 2-3 godziny. Trzymaj trzy studzienki z komórkami w normalnych warunkach hodowli (tj. 10% FBS) do wykorzystania jako kontrole.
4. Leczyć komórki dorsomorfiną (inhibitorem szlaku BMP, 2 μM) lub BMP4 (25 ng/ml) przez żądany czas (np. przez 10 min-1 h) ⁵.

2. Utrwalenie i przepuszczalność

1. Przygotuj utrwalacz, 4% PFA. Odważyć 4 g PFA, aby przygotować 4% roztwór w 100 ml PBS. Podgrzej roztwór w temperaturze 50°C, aż stanie się klarowny. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia. Użyj świeżego utrwalacza (nie przechowywanego dłużej niż 2 dni).
2. Odessać pożywkę ze studzienek i przemyć 1xPBS. Nie należy pipetować roztworów bezpośrednio na komórki, ponieważ może to spowodować ich oderwanie. Przed przejściem do następnego kroku, jeśli używane są szkiełka komorowe, usuń komory, ale pozostaw krzem wokół studzienek.
3. Dodać 50 μl 4% PFA i inkubować przez 10 minut, w temperaturze pokojowej, bez mieszania.
4. Myć komórki PBS przez 3 x 5 min w słoiku z kopliny, mieszając w temperaturze pokojowej stężenia.
5. Traktować komórki 0,5% Triton X-100 w PBS przez 10 minut bez mieszania w temperaturze pokojowej.
6. Myć komórki 0,05% Tween 20 w TBS (TBS-T) przez 3 x 5 min w słoiku Coplin z mieszaniem w temperaturze pokojowej stężenia.

3. Blokowanie

1. Stuknij w TBS-T. Dodaj jedną kroplę roztworu blokującego Duolink II (1x) na dołek.
2. Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

4. Przeciwciała pierwotne

1. Wymieszać i rozcieńczyć a-P-Smad1/5/8 (królik poliklonalny) w stosunku 1:100 i a-Smad4 (monoklonalny myszy) w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku przeciwciała Duolink II (1x). Przygotować również a-P-Smad1/5/8 i a-Smad4 w samych stężeniach do użycia w kontrolach.
2. Stuknij w Rozwiązanie blokujące ze slajdów. Usuń jak najwięcej roztworu blokującego, ale należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek przed dodaniem przeciwciała. Dodać 40 μl roztworów przeciwciał do studzienek. W jednym dołku dodaj tylko rozcieńczalnik przeciwciał jako dodatkową kontrolę ujemną.

5. Sondy PLA

1. Rozcieńczyć dwie sondy PLA (Duolink II anty-Mouse MINUS i Duolink II anti-Rabbit PLUS) w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał.
2. Stuknij główny roztwór przeciwciała ze szkiełek. Umyj szkiełka 2 razy po 5 minut za pomocą 1x Duolink II Wash Buffer A w słoiku Coplin z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
3. Stuknąć bufor A do płukania ze szkiełek i dodać roztwór sondy PLA (40 μl/dołek).
   Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

6. Podwiązanie

1. Odwirować bulion Duolink II Ligation (5x) i rozcieńczyć 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać. Przy obliczaniu objętości wody należy wziąć pod uwagę objętość ligazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:40 tuż przed dodaniem mieszanki do studzienek.
2. Odczep roztwór sondy PLA od szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do mycia A przez 2 razy po 5 minut w słoiku Coplin z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
3. Wyjmij Ligazę z zamrażarki za pomocą bloku zamrażającego (-20°C). Dodać ligazę do roztworu ligacji (przygotowanego w 6.1) w rozcieńczeniu 1:40 i odwirować.
4. Stuknąć bufor płuczący A ze szkiełek i dodać roztwór ligacji i ligazy do każdego dołka (40 μl/dołek). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37°C.

7. Wzmocnienie

Uwaga: Odczynniki wrażliwe na światło. Chroń szkiełka przed światłem.

1. Rozcieńczyć bulion Duolink II Amplification (5x) w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszać. Przy obliczaniu objętości wody należy wziąć pod uwagę objętość polimerazy, która zostanie dodana w końcowym rozcieńczeniu 1:80 tuż przed dodaniem mieszanki do studzienek.
2. Stuknąć roztwór ligacji-ligazy ze szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do płukania A przez 2 razy po 2 minuty w słoiku Coplin z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
3. Wyjmij polimerazę z zamrażarki za pomocą bloku zamrażającego (-20°C). Dodać polimerazę do roztworu amplifikacyjnego (przygotowanego w 7.1) w rozcieńczeniu 1:80 i wirować.
4. Stuknąć bufor płuczący A ze szkiełek i dodać roztwór polimerazy amplifikacyjnej do każdej studzienki (40 μl/studzienkę). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37°C.

8. Przygotowanie do obrazowania

Uwaga: Odczynniki wrażliwe na światło. Chroń szkiełka przed światłem.

1. Stuknąć roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek i myć przez 2 razy po 10 minut w 1x Duolink II Wash Buffer B w słoiku Coplin z mieszaniem w temperaturze pokojowej.
2. Zanurz szkiełka w 0,1 x bufor do płukania B.
3. Całkowicie usuń silikon z 16-dołkowego szkiełka. Dodaj ~ 40 μl Duolink II Mounting Medium z DAPI na szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść go na próbkach, lekko dociskając go tak, aby pod szkiełkiem nakrywkowym nie było pęcherzyków powietrza. Przymocuj i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą lakieru do paznokci. Odczekaj co najmniej 15 minut przed przystąpieniem do obrazowania.
4. Analizuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Uzyskiwanie obrazów cyfrowych.

9. Kwantyfikacja

Uwaga: Odczynniki wrażliwe na światło. Chroń szkiełka przed światłem.

1. Użyj Duolink ImageTool, aby policzyć sygnały na obrazach w celu uzyskania pomiaru poziomu sygnalizacji.
2. Porównaj wymiary i sporządź wykres.

10. Reprezentatywne wyniki

Wynik eksperymentu in situ z PLA pokazuje się jako dyskretne plamki fluorescencyjne. Lokalizacja sygnału zależy od konkretnych badanych białek.

Rysunek 1. PLA in situ na komórkach Neuro2a po stymulacji BMP4. Komórki traktowano 2 μM dorsomorfiną (inhibitorem szlaku BMP) (A) lub 25 ng/ml BMP4 (B) przez 60 minut lub pozostawiono bez leczenia (CE). Przeciwciała przeciwko P-Smad1/5/8 i Smad4 zastosowano do wykrywania aktywnych kompleksów w A i B. Jako kontrole zastosowano przeciwciała pierwszorzędowe a-P-Smad1/5/8 same (C) i a-Smad4 same (D) lub pominięcie przeciwciał pierwszorzędowych (E). Niebieski: DAPI; Czerwony: sygnał PLA. Zdjęcia uzyskano za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SP5.

(F) Sygnały PLA zostały zliczone za pomocą oprogramowania Duolink ImageTool, a średnia liczba plamek w jądrze na komórkę jest przedstawiona na wykresie. (G) Komórki Neuro2a pozostawiono nieleczone lub leczone Dorsomorphiną (2 μM) lub BMP4 (25 ng / ml) przez 60 minut. Komórki poddano lizie, a białka poddano SDS-PAGE i przeanalizowano za pomocą immunoblottingu z a-P-Smad1/5/8 i a-PCNA jako kontroli obciążenia. (*) pasmo niespecyficzne. Należy zauważyć, że przeciwciało a-P-Smad1/5/8 nie jest w stanie rozróżnić 3 różnych białek obecnych w kompleksie z Smad4.

Discussion

Wizualizacja kompleksów białkowych in situ jest bardzo poszukiwana, szczególnie w badaniach nad sygnalizacją, w których interakcja białek i modyfikacja białek są środkami używanymi przez komórki do wysyłania sygnału z ich powierzchni do jądra. Wcześniej nie było możliwe uwidocznienie i ilościowe określenie kompleksów między dwoma endogennymi białkami in situ z immunofluorescencją. Kolokalizacja przeciwciał wykazuje niską rozdzielczość i nie może być wykorzystana do wizualizacji prawdziwej interakcji. PLA to nowa technika, którą naukowcy zaczęli stosować w różnych systemach z dużym sukcesem ^{6, 7}. W tym miejscu pokazujemy, jak używać PLA nie tylko do wizualizacji, ale także do ilościowego określania endogennych kompleksów między efektorami Smad aktywowanymi po stymulacji BMP w czasie. Aby to osiągnąć, użyliśmy różnych komórek hodowli tkankowej, w tym Neuro2a, i polegaliśmy na komercyjnych przeciwciałach wyhodowanych u różnych gatunków (mysz a-Smad4 i królik a-P-Smad1 / 5/8) (ryc. 1). Ta metoda pozwoliła nam po raz pierwszy zobaczyć aktywację kompleksów efektorowych BMP w czasie, a nie tylko obecność fosforylowanego Smad1/5/8, które nie wszystkie mogą być zaangażowane w aktywne kompleksy z Smad4. Policzyliśmy sygnały (ryc. 1F) i porównaliśmy pomiar z kwantyfikacją uzyskaną z immunoblot tych samych komórek ⁸ (ryc. 1G). Doszliśmy do wniosku, że liczba plamek zapewnia dokładny pomiar porównawczy poziomów sygnalizacji w czasie. Technikę tę zastosowano również na innych liniach komórkowych (HEK293T i Cos7) z podobnymi wynikami (dane nie pokazane).

Zasada działania technologii opiera się na dwóch unikalnych sondach dostarczonych z zestawem Duolink. Każda sonda PLA składa się z wtórnego przeciwciała przyłączonego do unikalnego syntetycznego oligonukleotydu, który działa jako reporter. Bliskość sond umożliwia ligację DNA dokładnie w miejscu, w którym te sondy są przymocowane w pobliżu. Odległość oligonukleotydów, która umożliwia hybrydyzację i ligację DNA, jest niewielka (<40 nm), a zatem tylko białka, które oddziałują, mogą pozwolić na ligację. Ligowane DNA można następnie amplifikować i wykryć za pomocą hybrydyzacji znakowanych oligonukleotydów amplifikowanej sekwencji. Amplifikacja jest specyficzna, ponieważ zależy od zasad hybrydyzacji DNA-DNA, a także zapewnia wysoką czułość, ponieważ zligowane DNA jest kilkakrotnie amplifikowane, co powoduje wzmocnienie początkowego zdarzenia ligacji. Amplifikowane DNA jest wykrywane przez hybrydyzację ze znakowanymi oligonukleotydami i wytwarza widoczną i dość dużą plamkę. Ponieważ miejsca mogą być zliczane, sygnał PLA dostarcza nie tylko dokładnych informacji przestrzennych (lokalizacji zdarzeń interakcji), ale także obiektywnego sposobu ilościowego określania tych zdarzeń ^2-4.

Inne techniki stosowane do wykrywania interakcji białkowych obejmują koimmunoprecypitację, immunofluorescencję i transfer energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET). Testy koimmunoprecypitacyjne są szeroko stosowane w celu umożliwienia izolacji kompleksów białkowych. Metodzie tej towarzyszy immunoblotting, co oznacza, że białka muszą ulegać ekspresji na stosunkowo wysokim poziomie, aby mogły zostać wykryte. Problemy związane z wysokim tłem lub niespecyficznym wiązaniem niektórych białek z kulkami są czasami trudne do przezwyciężenia w koimmunoprecypitacji. Ponadto testy koimmunoprecypitacji pozwalają na wykrycie białek, które mogą być częścią kompleksu białkowego, ale nie są w stanie odróżnić tych, które znajdują się w bardzo bliskiej odległości i oddziałują ze sobą fizycznie. Co więcej, koimmunoprecypitacje nie mogą dostarczyć oceny ilościowej w rozdzielczości pojedynczej komórki ani informacji na temat lokalizacji kompleksów białkowych w komórce. Wykrywanie współistnienia kompleksów białkowych w komórce lub kompartmencie komórki za pomocą immunofluorescencji opiera się na nakładaniu się sygnałów rozproszonych, a zatem ma niską rozdzielczość przestrzenną i nie może dostarczyć dokładnych informacji na temat interakcji białek. Kwantyfikacja sygnału immunofluorescencji może być przeprowadzona przez oszacowanie wizualne tylko wtedy, gdy różnica jest kilkukrotna i nie może być dokładna ani mierzalna, jak plamy PLA. FRET umożliwia wizualizację kompleksów białkowych w żywych komórkach i przezwycięża potrzebę stosowania przeciwciał oraz ekspozycji epitopu. Jednak FRET zwykle zależy od nadekspresji sztucznych połączonych białek, które mogą nie odzwierciedlać endogennych kompleksów białkowych, jak w PLA.

Warunki blokowania w protokole PLA są krytyczne, ponieważ może dojść do agregacji przeciwciał i zwiększyć tło. Alternatywne warunki blokowania można znaleźć w kartach produktów z przeciwciałami. Odpowiednie kontrole z pominięciem przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych dostarczają informacji o tym, co mogło pójść nie tak i zawsze muszą być uwzględnione. Ważne jest, aby przebadać różne przeciwciała, które dadzą najmniej tła, gdy są stosowane samodzielnie, i najlepszy sygnał, gdy są razem. Utrwalenie komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierne wiązanie może spowodować pełną denaturację i degradację kompleksów białkowych, podczas gdy niewystarczające utrwalenie może prowadzić do utraty kompleksów białkowych na etapach procedury. Można to kontrolować, obniżając stężenie utrwalacza do 3% lub ograniczając czas utrwalania. Jednak fiksacja zależy również od tego, czy przeciwciała pierwszorzędowe rozpoznają zdenaturowane białka, czy nie. Ponieważ technika PLA jest bardzo czuła, należy zachować szczególną ostrożność, aby czasy inkubacji i warunki mikro były równe dla różnych próbek.

W żadnym wypadku nie należy pozostawiać próbek do wyschnięcia przed ostatnim etapem. Suszenie próbek może prowadzić do zwiększenia tła. Całkowite usunięcie rozwiązania blokującego ma również kluczowe znaczenie dla uniknięcia tła. do płukania należy zawsze doprowadzić do temperatury pokojowej przed użyciem, ponieważ niska temperatura spowalnia reakcje enzymatyczne. Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów, zapoznaj się z instrukcją obsługi zestawu.

Przydatne jest stosowanie barwników w celu ustalenia subkomórkowej lokalizacji sygnału PLA (np. DAPI, aktyna itp.). Tutaj użyliśmy DAPI (w podłożu montażowym) do barwienia jąder. PLA jest kompatybilny z zastosowaniem immunofluorescencji z przeciwciałami w celu określenia typu komórki lub przedziału komórkowego (nie pokazano tutaj). Dokładna kwantyfikacja może być przeprowadzona poprzez zliczanie sygnałów i użycie specjalnego oprogramowania (Duolink Image Tool, Olink Biosience).

Podsumowując, pokazaliśmy, jak używać PLA in situ , używając zestawu Duolink do wykrywania sygnalizacji BMP w stałych komórkach i przedstawiliśmy jego zalety: łatwość użycia, wysoka czułość, brak tła i unikalna zdolność do ilościowego określania aktywnej sygnalizacji BMP in situ.

Ograniczenie zastosowania tej techniki do badania różnych interakcji białkowych zależy od dostępności i jakości pierwszorzędowych przeciwciał, które rozpoznają badane białka.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMEM	Invitrogen	21710025
DMEM	Invitrogen	21063029
FBS	AutogenBioclear	7.01
Aminokwasy endogenne	Invitrogen	11149068
Pirogronian sodu	Invitrogen	11360070
Penicylina / Streptomycyna	Invitrogen	15140122
L-glutamina	Invitrogen	25030-054
Trypsyna, 0,05% (1X) z EDTA 4Na, płyn	Invitrogen	25300-054
Szkiełka 16-dołkowe	Lab-Tek	178599
Polisyna	VWR international	631-0107
Szkło nakrywkowe	VWR international	631-0138
a-pSmad1/5/8	Technologia sygnalizacji komórkowej	9511
A-SMAD4 (B8)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7966
Dorsomorphin	Merck & Co., Inc.	171260-10MG
Mysz rekombinowana BMP-4	R& D Systems	5020-BP-010
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Promega Corp.	H5151
Odczynniki do wykrywania Duolink II (pomarańczowe)	Olink Bioscience	92007-0100
Sonda PLA Duolink II anty-Rabbit PLUS	Olink Bioscience	92002-0100
Duolink II Wash Buffers Fluorescence	Olink Bioscience	82049