Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Podsumowanie

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Streszczenie

Podobnie jak Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes może przenosić obce DNA do komórek roślinnych w oparciu o autonomiczny plazmid indukujący korzenie (Ri). A. rhizogenes może powodować tworzenie się tzw. włochatych korzeni w tkankach roślinnych i formować rośliny kompozytowe po transformacji. W takich roślinach kompozytowych niektóre z regenerowanych korzeni są transgeniczne, niosąc T-DNA typu dzikiego oraz zmodyfikowany wektor binarny; natomiast pędy pozostają nietransgeniczne, służąc jako źródło energii i wsparcie dla wzrostu. Te kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami nie wytwarzają transgenicznych nasion, jednak posiadają szereg istotnych cech, które czynią je bardzo użytecznymi w badaniach nad roślinami. Po pierwsze, dzięki szerokiemu zakresowi gospodarzy, A. rhizogenes może transformować wiele gatunków roślin, zwłaszcza dwuliścienne, co umożliwia inżynierię genetyczną w wielu gatunkach. Po drugie, A. rhizogenes infekuje tkanki i eksplantaty bezpośrednio; aby uzyskać rośliny kompozytowe, nie jest konieczne prowadzenie kultur tkankowych przed transformacją, co czyni je idealnymi do transformacji gatunków roślin trudnych do modyfikacji. Co więcej, transgeniczne tkanki korzeni mogą zostać wygenerowane w ciągu zaledwie kilku tygodni. W przypadku Medicago truncatula transgeniczne korzenie można uzyskać już w trzy tygodnie, co jest szybsze niż standardowa transformacja Arabidopsis metodą floral dip. Ogólnie rzecz biorąc, technologia kompozytowych roślin z włochatymi korzeniami jest wszechstronnym i użytecznym narzędziem do badania funkcji genów oraz fenotypów związanych z korzeniami. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami mogą być wykorzystane do badania interakcji roślina-rhizobium oraz nodulacji u trudnego do transformacji gatunku M. truncatula.

Protokół

Poniższy protokół został wykorzystany do generowania roślin kompozytowych z korzeniami typu „hairy root” u modelowego gatunku roślin strączkowych M. truncatula. Podobne protokoły zaadaptowano dla co najmniej ośmiu gatunków roślin ^1-4. Wykorzystaliśmy rośliny kompozytowe M. truncatula z korzeniami typu „hairy root” do badania funkcji genów w rozwoju korzeni i grudek korzeniowych. Protokół został podzielony na cztery sekcje: 1) przygotowanie materiału roślinnego; 2) generowanie roślin kompozytowych z korzeniami typu „hairy root”; 3) infekcja symbiotycznymi Rhizobia; oraz 4) identyfikacja korzeni transgenicznych. Do przesiewania korzeni transgenicznych w roślinach kompozytowych wykorzystaliśmy wektor binarny zawierający gen zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) jako reporter ³. W porównaniu z selekcją opartą na antybiotykach, przesiewanie oparte na GFP jest szybkie, łatwe i niedrogie. W naszej konstrukcji gen gfp zoptymalizowany pod kątem ekspresji w retikulum endoplazmatycznym (ER) jest sterowany przez promotor super-ubikwityny, który zapewnia silne konstytutywne sygnały GFP w korzeniach transgenicznych, co pozwala na łatwe odróżnienie korzeni transgenicznych od nietransgenicznych.

1. Przygotowanie materiału roślinnego

1. Nasiona M. truncatula są zbierane z roślin hodowanych w szklarni (wilgotność względna 50%, cykl światła/ciemności 16/8 h, temperatura dzień/noc 22/18°C). Dojrzałe nasiona można przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Około 100 nasion poddaje się skaryfikacji w 10 ml stężonego kwasu siarkowego (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) przez 10 min, okresowo wstrząsając naczyniem.
3. Nasiona płucze się 5-7 razy sterylną wodą przy delikatnym mieszaniu.
4. Następnie nasiona moczy się w wodzie w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, a potem przechowuje w temperaturze 4°C przez 36-48 godzin w celu synchronizacji kiełkowania.
5. Około 20-30 nasion rozkłada się na zwilżonym papierze filtracyjnym umieszczonym w szalce Petriego. Przechowuje się je w temperaturze 22°C, przy cyklu światła/ciemności 16/8 h i natężeniu światła 40 μmol.m^-2.s^-1 przez 5-6 dni.
6. Wykiełkowane siewki przenosi się do gleby i umieszcza w szklarni na miesiąc.

2. Generowanie kompozytowych roślin z korzeniami owłosionymi

1. Konstrukty binarne niosące geny zainteresowania przetransformowano do A. rhizogenes zgodnie ze standardowymi protokołami. Opracowaliśmy zestaw wektorów binarnych zawierających gen gfp jako marker ułatwiający przesiewanie tkanek transgenicznych. Wektory te zawierają różne promotory i wszystkie posiadają miejsca klonowania Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu nadekspresji lub wyciszania docelowych genów ^3,5.
2. A. rhizogenes hodowano w 50ml pożywki LB z odpowiednią selekcją antybiotykową w temperaturze 28°C przez 16-24 godziny.
3. Bakterie zebrano i zawieszono ponownie do końcowej koncentracji OD₆₀₀=0.3 w bezazotowym roztworze soli mineralnych dla roślin (Tabela 1 i ⁶).
4. Aby wspomóc regenerację korzeni włochatych, wysterylizowaną matrycę podłoża („Wełna mineralna”, Hummert International, Earth City, MO) pocięto na kostki o objętości około 3 cm³. Do jednej szalki Petriego umieszczono 4 kostki.
5. W każdej kostce, na górnej powierzchni, wykonano otwór za pomocą końcówki pipety, aby ułatwić wprowadzenie eksplantatów. Do każdej kostki dodano 5 mL zawiesiny A. rhizogenes.
6. Odcięto skośnym cięciem fragment pędu z 2-3 pąkami pachwinowymi. Następnie eksplantat wprowadzono do kostki i hodowano w temperaturze 22°C przez około trzy tygodnie. Eksplantatów Medicago nie podlewano przez pierwsze 10 dni, a następnie, w razie potrzeby, podlewano je 5 ml roztworu bezazotowego. Stwierdzono, że usunięcie merystemu wierzchołkowego może zmniejszyć formowanie korzeni przybyszowych.

3. Zakażanie symbiotycznymi bakteriami z rodzaju Rhizobia (Sinorhizobium meliloti)

1. Po trzech tygodniach z wełny mineralnej wyrosną niektóre korzenie przybyszowe. Kompozytowe rośliny z włóknistymi korzeniami przenosi się do piasku lub wermikulitu (sterylnego), z wełną mineralną lub bez niej. Są one hodowane w szklarni w temperaturze 22°C, przy cyklu świetlnym 16/8 h (światło/ciemność) i natężeniu światła 300 μmol.m^-2.s^-1 przez kolejny tydzień.
2. Przed infekcją rizobiami, S. meliloti 1201 jest hodowany w 50 ml pożywki ekstrakt drożdżowy-mannitol przez 7 dni w temperaturze 30 °C (Tabela 2 oraz ^6,7).
3. Resuspendowane komórki rizobiów rozcieńcza się do końcowego stężenia OD₆₀₀=0.08 przy użyciu azotowej roztworu odżywczego. W celu indukcji tworzenia guzków do każdej rośliny kompozytowej aplikowano 10 ml świeżej zawiesiny S. meliloti.

4. Identyfikacja korzeni transgenicznych

1. Dwa tygodnie po inokulacji ryzobiami rośliny kompozytowe wyrywa się, przemywając je w wodzie. Korzenie można w ten sposób łatwo oddzielić od piasku lub perlitu.
2. Włochate korzenie umieszcza się pod mikroskopem UV (Nikon SMZ1500, wzbudzenie 460-500nm, filtr dichroiczny 505nm, filtr odcinający powyżej 510nm). Korzenie transgeniczne są GFP-dodatnie, natomiast korzenie przybyszowe są GFP-ujemne. Następnie zbiera się korzenie zgodnie z sygnałem GFP, zlicza liczbę brodawek, mierzy długość korzenia i oblicza gęstość korzeni bocznych. Korzenie GFP-ujemne służą jako kontrola.

5. Reprezentatywny wynik

W naszym eksperymencie nowe korzenie włoskowate zregenerowały się z eksplantów w ciągu 2-3 tygodni po inokulacji A. rhizogenes. Pod mikroskopem UV korzenie transgeniczne zawierające gen gfp wykazują silną zieloną fluorescencję (Rys. 1). Liczba zregenerowanych korzeni oraz odsetek korzeni GFP-dodatnich zależą od stanu eksplantów oraz środowiska wzrostu roślin kompozytowych. Średnio 25% wytworzonych korzeni były transgenicznymi korzeniami włoskowatymi ³. Aby zwiększyć efektywność transformacji: 1) plastikowa kopuła, pokazana na filmie, jest wystarczająca do utrzymania wilgotności w tacy hodowlanej przez pierwsze kilka dni, a rośliny wymagają wtedy niewielkiej ilości wody. Nadmierne podlewanie jest szkodliwe dla powstawania korzeni włoskowatych; 2) stężenie inokulum Agrobacterium ma kluczowe znaczenie dla transformacji. Nadmierna liczba komórek nie sprzyja formowaniu się korzeni włoskowatych ani guzków. W przypadku formowania guzków roztwór do podlewania musi być pozbawiony azotu, w przeciwnym razie powstanie niewielka liczba guzków.

Kompozytowe rośliny z włóknistymi korzeniami można generować, wykorzystując jako materiał wyjściowy liścienie lub całe siewki. Do generowania włóknistych korzeni z innych tkanek wymagane są jedynie niewielkie modyfikacje powyższego protokołu ⁸. Ważne jest to, że każdy włóknisty korzeń stanowi niezależne zdarzenie transformacji. W związku z tym fenotypy obserwowane u jednej rośliny kompozytowej są sumą kilku zdarzeń transformacji, co wymaga potwierdzenia poprzez powtórzenia na wielu roślinach kompozytowych

Rycina 1. A. Korzenie transgeniczne można oddzielić od korzeni włochatych. B. W kompozytowych roślinach z korzeniami włochatymi utworzyły się brodawki. 4-tygodniowe rośliny M. truncatula z korzeniami włochatymi umieszczono pod mikroskopem UV, co pozwoliło na łatwą identyfikację korzeni dodatnich pod kątem GFP. (Czerwona strzałka: korzeń GFP; żółta strzałka: korzeń nie-GFP)

Roztwór zapasowy	g/200ml	ml roztworu zapasowego/ litr
MgSO4.7H2O	12.3	2
CaCl2.2H2O	14.7	4
K2HPO4.3H2O	6.8	1
K2SO4	11	4
Fe Cl3.6H2O	0.49	2.5
Mikroelementy	Patrz poniżej	1

Mikroskładniki odżywcze	g na litr
H3BO3	0.142
MnSO₄4.H2O	0.077
ZnSO₄4.7H2O	0.1725
CuSO₄4.5H2O	0.037
NaMoO₄4. H2O	0.024
CoCl₂2. H2O	0.0025
NiSO₄4	0.001

Tabela 1. Pożywka bezazotowa

K2HPO4	0,5 g
NaCl	0,1 g
MgSO4·7H2O	0,2 g
Ekstrakt drożdżowy	0,4 g
Mannitol	10 g
pH=6,8

Tabela 2. pożywka z ekstraktem drożdżowym i mannitolem (na litr)

Dyskusja

Generowanie kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root” jest szybką i łatwą metodą pozyskiwania dużych ilości materiału transgenicznego dla wielu gatunków roślin dwuliściennych. Choć metoda ta nie pozwala na uzyskanie nasion transgenicznych, umożliwia otrzymanie materiałów transgenicznych w ciągu kilku tygodni. Jest ona szczególnie odpowiednia dla roślin, w przypadku których trudno jest ustanowić kultury tkankowe lub wygenerować stabilne transformanty. Na przestrzeni lat wykorzystywaliśmy tę technologię do badania funkcji genów, funkcji promotorów, mikroRNA, rozwoju korzeni oraz korzeni bocznych, odpowiedzi obronnych i reakcji na stres abiotyczny, nodulacji i innych procesów symbiotycznych, odpowiedzi hormonalnych, profilowania metabolicznego, profilowania genów, analiz proteomicznych oraz innych procesów biologicznych. Protokół ten jest niezawodny i powtarzalny.