Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Podsumowanie

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Streszczenie

Podobnie jak Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes może przenosić obce DNA do komórek roślinnych w oparciu o autonomiczny plazmid indukujący korzenie (Ri). A. rhizogenes może powodować tworzenie się tzw. włochatych korzeni w tkankach roślinnych i formować rośliny kompozytowe po transformacji. W takich roślinach kompozytowych niektóre z regenerowanych korzeni są transgeniczne, niosąc T-DNA typu dzikiego oraz zmodyfikowany wektor binarny; natomiast pędy pozostają nietransgeniczne, służąc jako źródło energii i wsparcie dla wzrostu. Te kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami nie wytwarzają transgenicznych nasion, jednak posiadają szereg istotnych cech, które czynią je bardzo użytecznymi w badaniach nad roślinami. Po pierwsze, dzięki szerokiemu zakresowi gospodarzy, A. rhizogenes może transformować wiele gatunków roślin, zwłaszcza dwuliścienne, co umożliwia inżynierię genetyczną w wielu gatunkach. Po drugie, A. rhizogenes infekuje tkanki i eksplantaty bezpośrednio; aby uzyskać rośliny kompozytowe, nie jest konieczne prowadzenie kultur tkankowych przed transformacją, co czyni je idealnymi do transformacji gatunków roślin trudnych do modyfikacji. Co więcej, transgeniczne tkanki korzeni mogą zostać wygenerowane w ciągu zaledwie kilku tygodni. W przypadku Medicago truncatula transgeniczne korzenie można uzyskać już w trzy tygodnie, co jest szybsze niż standardowa transformacja Arabidopsis metodą floral dip. Ogólnie rzecz biorąc, technologia kompozytowych roślin z włochatymi korzeniami jest wszechstronnym i użytecznym narzędziem do badania funkcji genów oraz fenotypów związanych z korzeniami. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak kompozytowe rośliny z włochatymi korzeniami mogą być wykorzystane do badania interakcji roślina-rhizobium oraz nodulacji u trudnego do transformacji gatunku M. truncatula.

Protokół

Poniższy protokół został zastosowany do generowania kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root” u modelowego gatunku roślin strączkowych M. truncatula. Podobne protokoły zostały dostosowane dla co najmniej ośmiu gatunków roślin ^1-4. Wykorzystaliśmy kompozytowe rośliny M. truncatula z korzeniami typu „hairy root” do badania funkcji genów w rozwoju korzeni i brodawek korzeniowych. Protokół został podzielony na cztery sekcje: 1) przygotowanie materiału roślinnego; 2) generowanie kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root”; 3) infekcja symbiotyczna Rhizobia; oraz 4) identyfikacja korzeni transgenicznych. Do przesiewania korzeni transgenicznych w roślinach kompozytowych wykorzystaliśmy wektor binarny zawierający gen zielonego białka fluorescencyjnego (gfp) jako reporter ³. W porównaniu z selekcją opartą na antybiotykach, przesiewanie oparte na GFP jest szybkie, łatwe i niedrogie. W naszej konstrukcji gen gfp zoptymalizowany pod kątem ekspresji w retikulum endoplazmatycznym (ER) jest sterowany przez super-promotor ubikwityny, który wykazuje silne konstytutywne sygnały GFP w korzeniach transgenicznych, co pozwala na łatwe odróżnienie korzeni transgenicznych od nietransgenicznych.

1. Przygotowanie materiału roślinnego

1. Nasiona M. truncautla zbiera się z roślin hodowanych w szklarni (wilgotność względna 50%, cykl światło/ciemność 16/8 h, temperatura dzień/noc 22/18°C). Dojrzałe nasiona można przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Około 100 nasion poddaje się skaryfikacji w 10 ml stężonego kwasu siarkowego (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) przez 10 min, okresowo wstrząsając naczyniem.
3. Nasiona płucze się 5-7 razy sterylną wodą przy łagodnym mieszaniu.
4. Następnie nasiona namacza się w wodzie w temperaturze pokojowej przez 6 godzin, a następnie przechowuje w temperaturze 4°C przez 36-48 godzin w celu synchronizacji kiełkowania.
5. Około 20-30 nasion rozkłada się na zwilżonym papierze filtracyjnym umieszczonym w szalce Petriego. Przechowuje się je w temperaturze 22°C, przy cyklu światło/ciemność 16/8 h i natężeniu światła 40 μmol.m^-2.s^-1 przez 5-6 dni.
6. Wykiełkowane siewki przenosi się do gleby i umieszcza w szklarni na miesiąc.

2. Generowanie roślin kompozytowych z korzeniami typu hairy root

1. Konstrukcje binarne zawierające geny zainteresowania przetransformowano do A. rhizogenes zgodnie ze standardowymi protokołami. Opracowaliśmy zestaw wektorów binarnych zawierających gen gfp jako marker ułatwiający selekcję tkanek transgenicznych. Wektory te zawierają różne promotory i wszystkie posiadają miejsca klonowania Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu nadekspresji lub wyciszenia docelowych genów ^3,5.
2. A. rhizogenes hoduje się w 50 ml pożywki LB z odpowiednią selekcją antybiotykową w temperaturze 28°C przez 16-24 godziny.
3. Bakterie są zbierane i resuspendowane do końcowego stężenia OD₆₀₀=0.3 w pozbawionym azotu roztworze soli mineralnych dla roślin (Tabela 1 i ⁶).
4. Aby wspomóc regenerację korzeni włochatych, wysterylizowaną matrycę wspierającą („Rock Wool”, Hummert International, Earth City, MO) tnie się na kostki o objętości około 3 cm³. W jednej szalce Petri umieszczamy 4 kostki.
5. Na górze każdej kostki za pomocą końcówki pipety wykonuje się otwór, aby ułatwić wprowadzenie eksplantatów. Do każdej kostki dodaje się A. rhizogenes (5 mL).
6. Za pomocą cięcia skośnego wycina się fragment pędu z 2-3 pąkami pachymerystycznymi. Następnie eksplantat wprowadza się do kostki i inkubuje w temperaturze 22°C przez około trzy tygodnie. Przez pierwsze 10 dni eksplantaty Medicago pozostawiamy bez podlewania, a następnie w razie potrzeby podlewamy je 5 ml roztworu pozbawionego azotu. Stwierdzono, że usunięcie merystemu wierzchołkowego może zmniejszyć tworzenie się korzeni przybyszowych.

3. Infekcja symbiotycznymi ryzobiami (Sinorhizobium Meliloti)

1. Po trzech tygodniach z wełny mineralnej wyrosną niektóre korzenie przybyszowe. Kompozytowe rośliny z korzeniami włóknistymi przenosi się do piasku lub wermikulitu (sterylizowanego), z wełną mineralną lub bez niej. Są one hodowane w szklarni w temperaturze 22°C, w cyklu światła/ciemności 16/8 h i przy natężeniu światła 300 μmol.m^-2.s^-1 przez kolejny tydzień.
2. Przed infekcją ryzobiami, S. meliloti 1201 jest hodowany w 50 ml pożywki ekstrakt drożdżowy-mannitol przez 7 dni w temperaturze 30 °C (Tabela 2 oraz ^6,7).
3. Resuspendowane komórki ryzobiów rozcieńcza się do końcowego stężenia OD₆₀₀=0.08 przy użyciu bezoazotowej roztworu odżywczego. 10 ml świeżej zawiesiny S. meliloti naniesiono na każdą roślinę kompozytową w celu indukowania tworzenia brodawek.

4. Identyfikacja korzeni transgenicznych

1. Dwa tygodnie po inokulacji ryzobiami rośliny kompozytowe są wyrywane poprzez przemywanie w wodzie. Korzenie można łatwo oddzielić od piasku lub perlitu w wodzie.
2. Korzenie włochate umieszczamy pod mikroskopem UV (Nikon SMZ1500, wzbudzenie 460-500nm, filtr dichroiczny 505nm, filtr barierowy powyżej 510nm). Korzenie transgeniczne są GFP dodatnie, a korzenie przybyszowe są GFP ujemne. Następnie zbieramy korzenie zgodnie z sygnałem GFP, zliczamy liczbę brodawek, mierzymy długość korzeni i obliczamy gęstość korzeni bocznych. Korzenie GFP ujemne służą jako kontrola.

5. Reprezentatywny wynik

W naszym doświadczeniu nowe korzenie włoskowate zregenerowały się z eksplantów w ciągu 2-3 tygodni po inokulacji A. rhizogenes. Pod mikroskopem UV korzenie transgeniczne niosące gen gfp wykazują silną zieloną fluorescencję (Ryc. 1). Liczba zregenerowanych korzeni oraz odsetek korzeni dodatnich pod kątem GFP zależą od stanu eksplantów i środowiska wzrostu roślin kompozytowych. Średnio 25% wytworzonych korzeni stanowiły transgeniczne korzenie włoskowate ³. Aby zwiększyć wydajność transformacji: 1) plastikowa kopuła osłonowa, przedstawiona na filmie, jest wystarczająca do utrzymania wilgotności w tacy hodowlanej przez pierwsze kilka dni, a rośliny wymagają wtedy niewielkiej ilości wody. Nadmierne podlewanie jest niekorzystne dla formowania się korzeni włoskowatych; 2) stężenie inokulum Agrobacterium jest istotne dla transformacji. Nadmierna liczba komórek nie sprzyja formowaniu się korzeni włoskowatych ani grudek bakteryjnych. W przypadku formowania grudek roztwór do podlewania musi być pozbawiony azotu, w przeciwnym razie utworzy się niewiele grudek.

Kompozytowe rośliny z korzeniami typu hairy root można wytworzyć, wykorzystując jako materiał wyjściowy liścienie lub całe siewki. W celu generowania korzeni typu hairy root z innych tkanek konieczne są jedynie niewielkie modyfikacje powyższego protokołu ⁸. Co istotne, każdy korzeń typu hairy root stanowi niezależne zdarzenie transformacji. W związku z tym fenotypy obserwowane w jednej roślinie kompozytowej są sumą kilku zdarzeń transformacji, które wymagają potwierdzenia poprzez powtórzenia na wielu roślinach kompozytowych.

Rysunek 1. A. Korzenie transgeniczne można wyodrębnić z korzeni włochatych. B. W kompozytowych roślinach z korzeniami włochatymi utworzyły się brodawki. 4-tygodniowe rośliny M. truncatula z korzeniami włochatymi umieszczono pod mikroskopem UV, co pozwoliło na łatwą identyfikację korzeni wykazujących ekspresję GFP. (Czerwona strzałka: korzeń GFP; żółta strzałka: korzeń bez GFP)

Roztwór zapasowy	g/200ml	ml roztworu zapasowego/litr
MgSO4.7H2O	12.3	2
CaCl2.2H2O	14.7	4
K2HPO4.3H2O	6.8	1
K2SO4	11	4
Fe Cl3.6H2O	0.49	2.5
Mikroskładniki	Patrz poniżej	1

Mikroskładniki odżywcze	g na litr
H3BO3	0.142
MnSO₄4.H2O	0.077
ZnSO44.7H2O	0.1725
CuSO₄4.5H2O	0.037
NaMoO4. H2O	0.024
CoCl2. H2O	0.0025
NiSO44	0.001

Tabela 1. Bezozotowy roztwór odżywczy

K2HPO4	0,5 g
NaCl	0,1 g
MgSO₄4·7H2O	0,2 g
Ekstrakt drożdżowy	0,4 g
Mannitol	10 g
pH=6,8

Tabela 2. pożywka z ekstraktem drożdżowym i mannitolem (na litr)

Dyskusja

Generowanie kompozytowych roślin z korzeniami typu „hairy root” jest szybką i łatwą metodą pozyskiwania dużych ilości materiału transgenicznego dla wielu gatunków roślin dwuliściennych. Choć metoda ta nie pozwala na uzyskanie nasion transgenicznych, umożliwia otrzymanie materiałów transgenicznych w ciągu kilku tygodni. Jest ona szczególnie odpowiednia dla roślin, w przypadku których trudno jest ustanowić kultury tkankowe lub wygenerować stabilne transformanty. Na przestrzeni lat wykorzystywaliśmy tę technologię do badania funkcji genów, funkcji promotorów, mikroRNA, rozwoju korzeni oraz korzeni bocznych, odpowiedzi obronnych i reakcji na stres abiotyczny, nodulacji i innych procesów symbiotycznych, odpowiedzi hormonalnych, profilowania metabolicznego, profilowania genów, analiz proteomicznych oraz innych procesów biologicznych. Protokół ten jest niezawodny i powtarzalny.