Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Summary

W tym artykule opisujemy prostą metodę pobierania pojedynczych komórek z pierwotnych hodowli neuronów szczurów i późniejszej analizy transkryptomu za pomocą amplifikacji aRNA. Takie podejście można uogólnić na dowolny typ komórki.

Abstract

Wiele technik analizy ekspresji genów opiera się na materiale wyizolowanym z heterogenicznych populacji komórek z homogenatów tkankowych lub komórek w hodowli. ^1,2,3 W przypadku mózgu regiony takie jak hipokamp zawierają złożony układ różnych typów komórek, z których każda ma odrębny profil mRNA. Możliwość zbierania pojedynczych komórek pozwala na bardziej dogłębne badanie różnic molekularnych między populacjami komórek i w ich obrębie. Opisujemy prostą i szybką metodę pobierania komórek do dalszej obróbki. Pipety często używane w elektrofizjologii są wykorzystywane do izolowania (za pomocą aspiracji) interesującej komórki i wygodnego umieszczania jej w probówce Eppendorfa w celu dalszego przetwarzania za pomocą dowolnej liczby technik biologii molekularnej. Nasz protokół może być modyfikowany w celu zbierania dendrytów z hodowli komórkowych, a nawet pojedynczych komórek z ostrych plastrów.

Opisujemy również metodę amplifikacji aRNA jako główne zastosowanie izolacji pojedynczych komórek. Metoda ta została opracowana wcześniej przez nasze laboratorium jako alternatywa dla innych technik analizy ekspresji genów, takich jak odwrotna transkrypcja lub reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). ^4,5,6,7,8 Technika ta zapewnia liniową amplifikację poliadenylowanego RNA, zaczynając od samych femtogramów materiału i uzyskując mikrogramowe ilości antysensownego RNA. Materiał amplifikowany liniowo zapewnia dokładniejsze oszacowanie niż wykładnicza amplifikacja PCR względnej obfitości składników transkryptomu izolowanej komórki. Podstawowa procedura składa się z dwóch rund amplifikacji. Krótko mówiąc, miejsce promotora polimerazy RNA T7 jest włączone do dwuniciowego cDNA utworzonego z transkryptów mRNA. Następnie przeprowadzana jest nocna reakcja transkrypcji in vitro (IVT), w której polimeraza RNA T7 wytwarza wiele antysensownych transkryptów z dwuniciowego cDNA. Druga runda powtarza ten proces, ale z pewnymi różnicami technicznymi, ponieważ materiałem wyjściowym jest antysensowne RNA. Standardem jest powtarzanie drugiej rundy, co skutkuje trzema rundami amplifikacji. Często trzecia runda reakcji transkrypcji in vitro jest przeprowadzana przy użyciu biotynylowanych trifosforanów nukleozydów, dzięki czemu wytworzony antysensowny RNA może zostać zhybrydyzowany i wykryty na mikromacierzy. ^7,8 pkt.

Protocol

1. Hodowla komórkowa

Nasze laboratorium wykorzystuje pierwotne hodowle neuronalne hipokampa szczurów do poniższych eksperymentów. Poniżej opisano zmodyfikowany protokół Bankera dotyczący sposobu tworzenia i utrzymywania tych kultur komórkowych. ⁹ Istnieje oczywiście wyczerpująca liczba permutacji tych technik hodowli komórkowych i każda uznana metoda dostosowana do konkretnych potrzeb konkretnego laboratorium, która zapewnia niezmiennie zdrowe zaopatrzenie w komórki, byłaby odpowiednim substytutem.

1. Pięć autoklawowanych, okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm umieszcza się w naczyniu o średnicy 35 mm i pokrywa 80 μg/ml poli-D-lizyny (MW 70-150 000) w buforze boranowym O/N, przepłukuje wodą (klasa hodowli komórkowej), a następnie pokrywa 1 μg/ml lamininy w buforze boranowym O/N, a następnie ponownie spłukuje wodą. Dodaje się pożywkę NG (MEM z solami Earle'a i GlutaMAX uzupełnioną glukozą (0,6% w/v), penicyliną (100 U/ml), streptomycyną (100 μg/ml), surowicą końską (10% v/v)) i naczynia przechowuje się w inkubatorze (5% CO₂ w temperaturze 37°C). PDL150/laminina służy jako substrat dla izolowanych neuronów, na którym rosną jako monowarstwa. Szkiełka nakrywkowe można pokrywać do dwóch tygodni przed poszyciem.
2. W dniu posiewu pierwotne neurony z hipokampa szczura w 18. dniu embrionalnym są siane w pożywce NG przez dodanie 1,5 ml zawiesiny o stężeniu 100 000 komórek/ml. Cztery do sześciu godzin po posiewie, każda szalka o średnicy 35 mm jest traktowana 0,75 μl 5 mM beta-D-arabinofuranozydu cytozyny (ara-C), aby zapobiec wzrostowi jakichkolwiek zanieczyszczających komórek glejowych. Dwadzieścia cztery godziny później pożywka galwaniczna jest zmieniana na MEM z solami Earle'a i L-glutaminą uzupełnioną 0,6% w/v glukozy, 1 mM pirogronianu sodu i B27. Komórkom pozwala się rosnąć przez co najmniej dwa tygodnie przed użyciem w jakichkolwiek eksperymentach, aby umożliwić pełny rozwój procesów.

2. Przygotowanie pipet

Uwaga na temat RNaz: Skóra, ślina, a nawet oddech są głównymi źródłami RNaz, enzymów degradujących RNA. Konieczne jest, aby od tego momentu w protokole przestrzegać techniki wolnej od RNaz, aby próbka nie została zanieczyszczona RNazami, a następnie uległa degradacji. Obejmuje to noszenie rękawiczek podczas obchodzenia się z próbkami i odczynnikami, nigdy nie rozmawianie o próbkach lub odczynnikach oraz używanie nowych pudełek ze sterylizowanymi końcówkami i probówkami do pipet. Często pipety, które nie są przeznaczone wyłącznie do pracy z RNA, są odkażane poprzez przetarcie ich roztworem do leczenia RNazą, takim jak RNase AWAY (Molecular Bioproducts). Jednak roztwory te będą hamować wszelkie dalsze reakcje enzymatyczne, dlatego ważne jest również, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek tymi zabiegami.

1. Autoklaw szklanych pipet o średnicy zewnętrznej 1,5 mm (OD).
2. Za pomocą ściągacza do mikropipet przeciągnij pipety do średnicy odpowiedniej do zapisów elektrofizjologicznych, która może się różnić w zależności od ściągacza, filamentu i pipet. ¹⁰ Rozmiar otworu nie jest zbyt krytyczny, ponieważ końcówka zostanie złamana przed pobraniem ogniw.
3. Ostrożnie przechowuj pipety w środowisku wolnym od kurzu, w którym końcówki pozostaną nienaruszone (najlepiej użyć słoika do przechowywania mikropipet).
4. Aby złamać końcówkę w kontrolowany sposób, przytrzymaj napiętą końcówkę kimwipe między palcami w jednej ręce i bardzo delikatnie przetrzyj końcówkę pipety po papierze 1 do 2 razy. Otwór powinien wynosić około 75-100% docelowego rozmiaru komórki. Dostosuj ten krok, aż osiągniesz pożądany rezultat.

3. Przygotowanie hodowli, probówek i mikroskopu

1. Przygotuj żądaną liczbę probówek Eppendorfa o pojemności 1,7 ml. Dodać 2 μl PBS, buforu pierwszej nici, jeśli materiał ma być użyty do amplifikacji pojedynczych komórek, lub innego roztworu do przechowywania zebranego materiału.
2. Do zbioru potrzebny będzie mikroskop świetlny z obiektywem 40x wyposażonym w mikromanipulator. Użyj uchwytu na pipety z elastycznym rurką prowadzącą od uchwytu. Przymocuj rurkę do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanemu ruchowi pipety podczas pobierania. Na końcu rurki należy włożyć igłę, aby można było podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml ze złączem Luer-Lock i wymieniać ją między użytkownikami.
3. Jeśli używasz szkiełek nakrywkowych, pracuj z jednym szkiełkiem nakrywkowym na raz. W razie potrzeby przenieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe do nowej płytki o średnicy 35 mm* zawierającej PBS lub wybrane podłoże. Im dłużej komórki są poza inkubatorem, tym bardziej stają się niezdrowe i tym bardziej ich profile mRNA będą odbiegać od profilu zdrowej komórki. Bardzo ważne jest, aby zachować zdrowie komórek na innych szkiełkach nakrywkowych poprzez trzymanie ich w inkubatorze, gdy z nimi nie pracujemy. Pracuj tak szybko, jak to możliwe, z komórkami znajdującymi się poza inkubatorem.

*Przy naszej konfiguracji konieczne jest użycie pokrywy naczynia o średnicy 35 mm, ponieważ ścianki właściwej płytki są zbyt wysokie, aby umożliwić prawidłowe przesuwanie mikropipety w kierunku szkiełka nakrywkowego.

4. Zbieranie komórek

1. Zamocuj mikropipetę w uchwycie na mikropipety. Przymocuj uchwyt do mikropipet do wkładki na mikromanipulatorach. Ustaw obiektyw 40x.
2. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru. W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być względnie odizolowana od swoich sąsiadów, aby zapobiec zbieraniu otaczających komórek i/lub procesów. Populacja transkryptów mRNA między somą a procesami jest różna, więc jeśli interesują nas wyłącznie mRNA somatyczne, należy zadbać o to, aby zapobiec zanieczyszczeniu somy procesami. Umieść komórkę, którą chcesz zebrać, na środku pola widzenia.
3. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć mikropipetę w kierunku roztworu w naczyniu na ścieżkę światła. Opuść końcówkę pipety do roztworu. Od tego momentu należy wywierać nadciśnienie, lekko przedmuchując strzykawkę. Spójrz przez okular. Pipeta powinna pojawić się jako cień w polu widzenia. Znajdując się znacznie powyżej płaszczyzny komórek, wyreguluj położenie końcówki pipety, aż znajdzie się w polu view, a następnie ustaw ostrość na końcówce pipety za pomocą pokręteł zgrubnego ustawiania ostrości. W tym momencie należy ocenić, czy rozmiar otworu pipety jest za duży lub za mały. Ćwiczenie zbioru zapewni możliwość określenia, czy w tym momencie osiągnięto prawidłowy rozmiar otworu.
4. Teraz przesuń pipetę w kierunku płaszczyzny komórek. Ważne jest, aby końcówka nie była wysuwana zbyt pospiesznie, powodując jej pęknięcie w obszarze, z którego chcesz zebrać. Aby temu zapobiec, użyj zgrubnej ostrości, aby przesunąć płaszczyznę ogniskowej PRZED przesunięciem końcówki pipety w kierunku komórek za pomocą mikromanipulatorów. Gdy znajdziesz się w pobliżu komórek, użyj precyzyjnego ustawienia ostrości, aż zarówno komórki, jak i końcówka pipety będą ostre. Przestań wywierać nadciśnienie, zanim dotrzesz do płaszczyzny komórek, aby zapobiec zdmuchnięciu ich ze szkiełka nakrywkowego.
5. Użyj mikromanipulatorów, aby ustawić końcówkę pipety tak, aby dotykała somy komórkowej, którą chcesz zebrać.
6. Za pomocą strzykawki delikatnie odsysać ustami, aż komórka wejdzie do końcówki pipety. Jeśli kuweta nie wchodzi do pipety, delikatnie przesuń końcówkę bliżej kuwety i w dół, aż uniesie się ze szkiełka nakrywkowego.

5. Zapisywanie komórki

1. Za pomocą mikromanipulatora natychmiast przesunąć pipetę w górę i wyjąć ją z roztworu.
2. Wyjmij pipetę z uchwytu.
3. Trzymaj probówkę Eppendorfa o pojemności 1,7 ml w jednej ręce i delikatnie złamij końcówkę pipety z boku probówki w kierunku dołu. (Celuj w oznaczenie 0,1 ml.)
4. Trzymając złamaną końcówkę wyśrodkowaną wewnątrz probówki, włóż igłę przymocowaną do strzykawki o pojemności 1-3 ml do górnego otworu pipety. Szybko wciśnij tłok, zmuszając roztwór z pipety do rozpylenia do probówki. Komórka powinna pozostać na samej końcówce pipety i to powinno być wystarczające do prawidłowego wydalenia komórki. Należy uważać, aby nie dotknąć końcówką płynu po bokach probówki, ponieważ działanie kapilarne spowoduje, że płyn znajdzie się z powrotem w pipecie.
5. Szybko odwiruj zawartość probówki za pomocą mikrofuzy do biurka i natychmiast zamroź (przechowuj w temperaturze -80°C) lub umieść na lodzie w celu dalszej obróbki (najlepiej).

6. Amplifikacja aRNA

1. Runda 1 Synteza pierwszej nici cDNA:
   Tworzenie hybryd mRNA/cDNA.
   1. Na każde 5 μl objętości zbiorczej pojedynczej komórki dodać 1 x poniższą ilość do probówki zbiorczej (na lodzie). Reakcję można zwiększyć w przypadku większych objętości zbioru (2x dla objętości 10 μl itp.). Utwórz mieszankę wzorcową, mnożąc następujące odczynniki przez liczbę probówek zbiorczych plus 10-20%, aby uwzględnić błąd pipetowania. Zrób to dla każdej kolejnej reakcji w procedurze ampyfikacji aRNA.
      • NA LODZE
      • 1,2 μl dNTP (2,5 mM każdy)
      • 2,4 μL 5x Bufor pierwszej nitki
      • 0,3 μl startera T7-oligo(dT) (100 ng/μL)
      • 1,2 μl naziemnej telewizji cyfrowej (100 mM)
   2. Zwiększyć objętość do 10,25 μl wodą wolną od nukleaz. Odpipetować i krótko odkręcić za pomocą mikrofuge.
   3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 70°C w celu denaturacji wszelkich drugorzędowych struktur mRNA. Natychmiast umieść na lodzie na co najmniej 5 minut.
   4. Dodaj (ponownie używając mieszanki wzorcowej):
      • 0,3 μL RNasin (40 U/μL)
      • 0,45 μL Indeks górny III (200 U/μL)
      • 1 μl wody wolnej od nukleaz
   5. Odpipetować mieszać i krótko odkręcić. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 42°C.
   6. Inkubować w temperaturze 70°C przez 15 minut, aby dezaktywować indeks górny. Przejdź do następnego kroku.
2. Runda 1 Druga nić syntezy cDNA
   Utwórz startery RNA z części mRNA hybrydy mRNA / DNA, aby pomóc w syntezie dwuniciowego cDNA.
   1. • NA LODZE
      • Do 12 μl pierwszej nitki reakcji dodać:
      • 8 μl wody wolnej od nukleaz
      • 5,6 μL 5x bufor drugiej żyły
      • 0,75 μL mieszanki dNTP (2,5 mM każdy)
      • 0,25 μL ligazy DNA (10 U/μL)
      • 1 μL polimerazy DNA I (10 U/μL)
      • 0,25 μL Rnazy H (2 U/μL)
      Dokładnie wymieszać pipetując i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16°C.
   2. Dodać: 1 μl polimerazy DNA T4 (5 U/μL). Wymieszać pipetując i krótko odwirować. Inkubować jeszcze 10 minut w temperaturze 16°C.
   3. Oczyść reakcję za pomocą zestawu Qiagen MinElute zgodnie z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami: ¹¹ Przemyć 2 razy 500 μl buforu do przemywania zamiast 1 raz 750 μL. Elute w wodzie wolnej od nukleaz.
   4. Zagęścić do 2-4 μl za pomocą Speedvac lub przez wytrącanie etanolu. Do wytrącania etanolu glikogen działa jako nośnik kwasu nukleinowego i jest używany do wytrącania niewielkich ilości DNA lub RNA. Sód z octanu sodu pomaga neutralizować ujemny ładunek szkieletu DNA, pomagając w wytrącaniu się. Nie jest konieczne sporządzanie mieszanki wzorcowej do rutynowych opadów.
      • Dodaj 40 μl wody DEPC
      • 1 μl glikogenu (3 mg/ml)
      • 1/10 objętości (3 μL) 3M octan sodu
      • 2,5 objętości (~125 μL) zimny 100% etanol
      Dobrze wymieszaj. Wytrącać się w temperaturze -80°C (30 min do O/N).
   5. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4°C.
   6. Usunąć sklarowany osad i przemyć osad 800 μl 70% etanolu. Upewnij się, że granulka została całkowicie usunięta przez pipetowanie lub wirowanie, aby pomóc w usunięciu nadmiaru soli.
   7. Wirować przez kolejne 20 minut w temperaturze 4°C. Usunąć supernatant i powietrze.
   8. Zawiesić w 4 μl wody wolnej od nukleaz. Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 °C lub przejść do następnego kroku.
3. Runda 1 Transkrypcja in vitro (IVT):
   Zsyntetyzuj antysensowne RNA z promotora T7 wbudowanego w dwuniciowy cDNA.
   1. Reakcja ta jest przeprowadzana przy użyciu zestawu Ambion MEGAscript T7 zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem reakcji skalowanej do 10 μl zamiast 20 μl. ¹² Konieczne jest przygotowanie tej reakcji w temperaturze pokojowej i utrzymywanie buforu w temperaturze pokojowej podczas montażu. Dostarczony bufor wytrąci DNA, jeśli jest lodowato zimne. Trzymaj NTP i mieszankę enzymów na lodzie, gdy nie są używane.
      • W TEMPERATURZE POKOJOWEJ
      • Przenieś zawieszone dwuniciowe cDNA do cienkościennej probówki PCR.
      • Dodaj 4 μl mieszanki NTP (po 18,75 mM)
      • 1 μL 10x bufor reakcyjny
      • 1 μL 10x mieszanka enzymów
   2. Inkubować przez 14 godzin w temperaturze 37°C w termocyklerze (preferowanym) lub inkubatorze.
   3. Reakcję tę można oczyścić za pomocą dwóch różnych metod, a następnie zagęścić próbkę za pomocą Speedvac lub wytrącania etanolu. Aby wyczyścić za pomocą zestawu, przejdź do metody A. W celu oczyszczenia za pomocą standardowej ekstrakcji fenolem/chloroformem należy przejść do metody B.
   4. Metoda A:
      1. Oczyść reakcję za pomocą zestawu AMBION Megaclear zgodnie z instrukcją producenta z pewnymi modyfikacjami¹³: Przemyć 2 razy buforem do płukania 500 μl zamiast 1 raz 750 μl. Na etapie elucji dodać 50 μl wody wolnej od nukleaz do środka kolumny, inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Wirować z prędkością 10 000 g przez 1 minutę. Powtórz w świeżej tubce. Połączyć eluaty. Zagęścić próbkę do 2-4 μl za pomocą Speedvac OR przez wytrącanie etanolu.
      2. Do wytrącania etanolu: Octan amonu jest w tym przypadku stosowany zamiast octanu sodu, ponieważ skutecznie zapobiega współwytrącaniu się wolnych nukleotydów z kwasem nukleinowym. Jest to ważne ze względu na wysokie stężenie NTP stosowanych w reakcji IVT, które mogą hamować dalsze reakcje.
         • 2 μl glikogenu (5 mg/ml)
         • 0,1 objętości (10 μL) 5M octan amonu
         • 2,5 objętości (~275 μL) zimnego etanolu
      3. Wytrącać się w temperaturze -80°C (30 min do O/N).*
      4. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4°C.
      5. Usunąć supernatant i przemyć osad 800 μl 70% etanolu (w wodzie wolnej od nukleaz). Pamiętaj, aby całkowicie usunąć granulkę, aby usunąć cały nadmiar soli.
      6. Wirować przez kolejne 20 minut w temperaturze 4°C.
      7. Usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu.
      8. Zawiesić osad w 4 μl wody wolnej od nukleaz.
   5. Metoda B:
      1. Alternatywnie, aRNA można oczyścić za pomocą standardowej ekstrakcji fenol/chloroform.
         • Dodaj 90 μl wody DEPC
         • 2 μl glikogenu (5 mg/ml)
         • 0,1 objętości (10 μL) 5M octan amonu
         • 1 objętość (100 μL) fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1 (równowaga do pH 7,8-8,0)
      2. Wir trwa 15 sekund. Wirować przez 1,5 minuty z połową maksymalnej prędkości w mikrowirówce stołowej. Przenieść górną warstwę wodną do nowej probówki zawierającej 2,5 objętości (245 μl) zimnego etanolu.
      3. Wytrącać się w temperaturze -80°C (30 min do O/N).
      4. Wirować przez 20 minut w temperaturze 4°C.
      5. Usunąć supernatant i przepłukać osad 800 μl 70% etanolu (w wodzie wolnej od nukleaz). Pamiętaj, aby całkowicie usunąć granulkę, aby usunąć cały nadmiar soli.
      6. Wirować przez kolejne 20 minut w temperaturze 4°C.
      7. Usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu.
      8. Zawiesić osad w 4 μl wodzie wolnej od nukleaz.
         
         *Próbka może zamarznąć w tej temperaturze podczas inkubacji przez noc. Wykazano, że może to faktycznie zwiększyć wydajność kwasów nukleinowych.

4. Runda 2 Synteza pierwszej nici cDNA
   1. • NA LODZE
      • Dodać 1 μl losowych starterów (0,05 mg/ml)*
   2. Podgrzewać w temperaturze 70°C przez 10 minut. Natychmiast umieść na lodzie na co najmniej 5 minut.
   3. • Dodaj 2 μL 5x Bufor pierwszej nici
      • 1 μl naziemnej telewizji cyfrowej (100 mM)
      • 0,5 μl dNTP (2,5 mM każdy)
      • 0,5 μL RNasin (40 U/μL)
      • 1 μL Indeks górny III (200 U/μL)
   4. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko odwirować. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. Ten krok jest wymagany, aby umożliwić rozszerzenie krótkich losowych starterów przed przeprowadzeniem reakcji odwrotnej transkrypcji.
   5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42°C.
   6. Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95°C, aby zdenaturować RNA w hybrydach DNA/RNA. Umieść na lodzie na co najmniej 5 minut. Przechowywać w temperaturze -20°C lub -80°C lub natychmiast przejść do następnego kroku.
      
      *Stężenie starterów losowych jest ważne. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, produkt będzie coraz bardziej skracany z każdą rundą amplifikacji.
5. Runda 2 Synteza drugiej nici cDNA
   1. • NA LODZE
      • Dodać 2 μl startera T7-oligo(dT) (10 ng/μL)*
   2. Podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 70°C. Natychmiast umieścić na lodzie na co najmniej 5 minut. Zakręć krótko.
   3. • Dodać 43,5 μl wody wolnej od nukleaz
      • 15 μL 5x bufor drugiej nici
      • 1,5 μl mieszanki dNTP (2,5 mM każdy)
      • 2 μL polimerazy DNA I (10 U/μL)
   4. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko odwirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16°C.
   5. Dodać 2 μl polimerazy DNA T4 (5 U/μL)
   6. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko odwirować. Inkubować jeszcze 10 minut w temperaturze 16°C.
   7. Oczyść reakcję za pomocą zestawu Qiagen Minelute, jak w sekcji 6.2.3.
   8. Stężyć do 2-4 μl za pomocą Speedvac lub wytrącania etanolu, jak w sekcjach 6.2.4 do 6.2.8.
      
      *Należy zwrócić uwagę na różne stężenie podstawowe startera T7-oligo(dT) w porównaniu z syntezą cDNA pierwszej rundy drugiej nici.
6. Runda 2 Transkrypcja in vitro
   Postępować jak w punkcie 6.3.
   1. Powtórz sekcje od 6.4 do 6.6 żądaną liczbę razy. Należy zauważyć, że każda kolejna runda amplifikacji skutkuje krótszymi produktami aRNA. Z tego powodu liczba rund amplifikacji powinna być ograniczona. Zwykle dwie do trzech rund amplifikacji wystarczają do amplifikacji materiału zebranego z pojedynczej komórki w celu przeprowadzenia analizy mikromacierzy. W przypadku analizy mikromacierzy, trzecia runda reakcji IVT jest wykonywana przy użyciu zestawu do amplifikacji RNA Illumina TotalPrep zgodnie z instrukcją producenta. Procedura ta włącza UTP znakowany biotyną do aRNA, który jest następnie wykorzystywany do wykrywania na chipie mikromacierzy.
   2. Zmierz stężenie aRNA trzeciej rundy za pomocą bioanalizatora Nanodrop lub Agilent z zestawem Nano RNA.

7. Reprezentatywne wyniki

Pomyślne zebranie pojedynczej komórki z pierwotnych kultur neuronalnych może być zakończone w czasie krótszym niż 2 minuty, w zależności od umiejętności (patrz Rysunek 1). Jednak czas zbiorów będzie się różnił w zależności od systemu i od czasu manipulacji eksperymentalnej. Poddanie pojedynczej komórki procedurze aRNA (patrz ryc. 4A i 4B) powoduje uzyskanie mikrogramowych ilości całkowitego amplifikowanego aRNA i wytwarza charakterystyczny szeroki pik podczas analizy za pomocą bioanalizatora (patrz ryc. 3). Trzy rundy można wykonać w ciągu co najmniej trzech dni, co pozwala na szybką analizę ekspresji genów w pojedynczej komórce.

Rysunek 1. Pokazany jest przykład udanego pobrania izolowanego neuronu. Wybraliśmy obszar o stosunkowo niskiej gęstości (A) i przesunęliśmy końcówkę pipety w kierunku żądanej komórki (B). Trzeci obraz (C) pokazuje pole widzenia po pobraniu komórki. Należy pamiętać, że otaczające procesy pozostają na szkiełku nakrywkowym.

Rysunek 2. Pokazano dwa zdjęcia końcówek pipet, które mają nieodpowiedni rozmiar do efektywnego zbioru. Te wskazówki doprowadzą odpowiednio do niepełnych zbiorów (A) i zbiorów otaczających mil (B).

Rysunek 3. Po zbiorach i amplifikacji zaleca się analizę przy użyciu bioanalizatora w celu zbadania rozmieszczenia i ilości amplifikowanego RNA. Udana amplifikacja z materiału jednokomórkowego da całkowite ilości w niskich mikrogramach i będzie miała gładką i szeroką dystrybucję.

Rysunki 4. Przedstawiono schematy pierwszej rundy (A) i drugiej rundy (B) procedury aRNA.

Discussion

Uwagi i rozwiązywanie problemów

• Możesz zrobić zdjęcia przed i po pokazujące, że komórka docelowa została odizolowana, a pozostały półcień pozostał nietknięty.
• Jeśli podczas zbioru do pipety dostanie się zbyt dużo roztworu, można użyć 3-drożnych złączek Luer-Lock i tłoka do strzykawki, aby utrzymać nadciśnienie w przewodach. Pożądana objętość będzie się różnić w zależności od rodzaju przetwarzania, ale do 5 μl powinno wystarczyć w większości zastosowań.

Ogólne wskazówki dotyczące technik biologii molekularnej

• Zwiruj wszystkie standardowe rurki i odkręć je przed dodaniem do reakcji. NIGDY nie wiruj enzymów.
• Dokładnie wymieszaj reakcje przed dodaniem enzymu, aby upewnić się, że bufor ma odpowiednie stężenie.
• Jeśli to możliwe, utrzymuj zapasy enzymów w temperaturze -20°C, używając chłodnicy warstwowej. W przeciwnym razie usuń bezpośrednio przed użyciem, trzymaj na lodzie i natychmiast wróć do -20°C.
• Przygotowując więcej niż jedną reakcję, należy zawsze sporządzać mieszanki wzorcowe, aby zmniejszyć liczbę błędów pipetowania. Oblicz wymaganą objętość na podstawie liczby próbek i dodaj 10-20%.
• Przechowuj RNA w temperaturze -80°C, aby opóźnić degradację. RNA jest najbardziej stabilny przechowywany w buforze, aby opóźnić aurację RNA, która zachodzi w warunkach kwaśnych.

Ogólny zarys procedury aRNA

Rysunek 4A ilustruje pierwszą rundę procedury aRNA. W reakcji pierwszej nici część poli-T startera T7-oligo(dT) selekcjonuje gatunki mRNA (długi biały prostokąt) poprzez wiązanie się z ogonami poliA. Niektóre mikroRNA są również poliadenylowane i zostaną wychwycone przez tę procedurę. Co jednak ważniejsze, najliczniejsze RNA w komórce, rybosomalne RNA, nie będą. Ten oligo działa jako starter dla odwrotnej transkryptazy do syntezy komplementarnej nici cDNA (długiego szarego prostokąta) przy użyciu mRNA jako matrycy. Część T7 startera T7-oligo(dT) zawiera promotor polimerazy RNA T7 w ramce z antysensem sekwencji do wyjściowego mRNA. Jest to wykorzystywane później w reakcji transkrypcji in vitro.

Następnie mRNA w hybrydzie mRNA/DNA utworzonej w poprzednim kroku jest częściowo hydrolizowane przez Rnazę H, tworząc "startery" RNA (małe białe prostokąty) podobne do fragmentów Okazaki powstałych w syntezie opóźnionej nici DNA. Polimeraza DNA I wykorzystuje fragmenty RNA do syntezy DNA przy użyciu DNA komplementarnego do mRNA jako matrycy. Kiedy dociera do następnego fragmentu RNA, jego aktywność nukleazy od 5' do 3' usuwa rybonukleotydy i zastępuje je dezoksyrybonukleotydami. Ligaza DNA jest dodawana w celu podwiązania wszelkich nici, w których wymiana nici wiodącej nie jest zakończona. Polimeraza DNA T4 jest dodawana w celu wypełnienia obszarów, w których fragmenty RNA służyły jako początkowe startery dla polimerazy DNA I, tworząc tępo zakończone dwuniciowe cDNA, które jest następnie oczyszczane przed przeprowadzeniem reakcji IVT.

W reakcji IVT polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7 wbudowanym w dwuniciowy cDNA i syntetyzuje cząsteczki antysensownego RNA (długie czarne prostokąty) przy użyciu nici sensownej jako matrycy. Służy to jako etap amplifikacji, w którym z każdej dwuniciowej cząsteczki cDNA wytwarzane są tysiące antysensownych cząsteczek RNA (ryc. 4A).

Druga runda, jak pokazano na rysunku 4B, rozpoczyna się reakcją odwrotnej transkrypcji, która różni się nieco od reakcji pierwszej rundy, ponieważ początkowy RNA jest antysensowny (solidny prostokąt) i nie ma poliadenylowanego ogona, który był celem startera T7-oligo(dT) w pierwszej rundzie. Dlatego reakcja ta jest zaszczepiana losowymi starterami (małymi szarymi prostokątami), a następnie RNA ulega denaturacji. Reakcja drugiej nici jest następnie zagruntowana starterem T7-oligo(dT), który wiąże się z sekwencją poli-A na końcu 3' sensownego RNA utworzonego w poprzedniej reakcji odwrotnej transkrypcji. Kolejną reakcję IVT przeprowadza się w taki sam sposób, jak w pierwszej rundzie. Ta druga runda jest zwykle powtarzana co najmniej raz, aby uzyskać trzy rundy amplifikacji z jednej komórki.

Aplikacji

Techniki, które przedstawiliśmy w tym artykule, można przełożyć na dużą liczbę zastosowań. Protokół izolacji pojedynczej komórki może być zmodyfikowany do stosowania w ostrych plasterkach. ¹⁴ Chociaż jest to rozwiązanie trudniejsze z technicznego punktu widzenia, w przypadku tego alternatywnego przygotowania obowiązują te same zasady. Dodatkowo, jeśli rozmiar pipety zostanie nieznacznie dostosowany, można dokonać zapisów fizjologii komórek przed pobraniem, co pozwala na dobrze kontrolowane badanie mechanizmów molekularnych stojących za wynikami fizjologicznymi. Kolejną niewielką modyfikacją jest wyizolowanie procesów z somy komórki. ¹⁵ W tym zastosowaniu należy zebrać ciała komórek za pomocą jednej pipety, a następnie wrócić ze świeżą pipetą i zebrać 100-300 zidentyfikowanych dendrytów lub aksonów w probówce zbiorczej. ¹⁶

Po pobraniu komórek można dokonać porównań obfitości i składu mRNA między różnymi, a nawet w obrębie tych samych populacji komórek. Włączenie biotynylowanego-UTP do trzeciej rundy aRNA pozwala na analizę mikromacierzy w celu określenia tej względnej obfitości mRNA. Skład pierwotnej populacji mRNA można również określić po procedurze aRNA przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Amplifikowane aRNA może być również wykorzystane do potwierdzenia badań konwersji fenotypu komórkowego, w których pełny zestaw mRNA z jednego typu komórki jest transfekowany do innego typu komórki w celu wywołania przejścia fenotypu drugiego typu komórki do pierwszego typu komórki, procedura opracowana przez laboratorium i znana jako TIPeR. ¹⁷ Badania te są szczególnie przydatne do badania stanów chorobowych i fenotypów komórek, a takie badania są obecnie prowadzone w laboratorium. RT-PCR lub qPCR można przeprowadzić na amplifikowanym materiale w celu potwierdzenia ekspresji genów specyficznych dla komórki. Dodatkowo oceny skuteczności transfekcji lub transdukcji można dokonywać na poziomie pojedynczej komórki.

Zalety i ograniczenia

Jak stwierdzono w streszczeniu, izolacja pojedynczych komórek do analizy eliminuje efekty uśredniania obserwowane podczas analizy heterogenicznych populacji komórek. Te efekty uśredniania błędnie przedstawiają obfitość mRNA w pojedynczej komórce, nadreprezentując obfite transkrypty oraz uśredniając i zapobiegając wykrywaniu wielu transkryptów o niskiej obfitości. Cytometria przepływowa może być stosowana do sortowania pojedynczych komórek, ale ta metoda wymaga wiedzy na temat markerów specyficznych dla komórek i drogiego sprzętu. ¹⁸ Mikrodysekcja wychwytywania laserowego za pomocą systemów mikrodysekcji wychwytywania laserowego UV lub IR pozwala na wychwytywanie pojedynczych komórek, a nawet subkomórek, ale wymaga, aby komórki będące przedmiotem zainteresowania znajdowały się na powierzchni bardzo cienkich odcinków. ¹⁹ Podobnie jak cytometria przepływowa, mikrodysekcja laserowa również wymaga drogiego sprzętu.

Jedną z głównych zalet opisanej powyżej techniki pobierania danych opartej na elektrodach jest to, że cenne dane elektrofizjologiczne można uzyskać z komórki będącej przedmiotem zainteresowania przed pobraniem, co pozwala na przeprowadzenie analizy funkcjonalnej i transkryptomu na tej samej komórce. ²⁰ Wadą naszej techniki jest to, że wymaga ona doświadczenia w posługiwaniu się mikromanipulatorami. Badacze zaznajomieni z mikromanipulatorami uznają tę technikę za bardzo intuicyjną; Jednak osoby bez takiego doświadczenia będą musiały poczuć się komfortowo z wymaganymi delikatnymi ruchami.

Nieodłącznym elementem każdej techniki amplifikacji jest preferencyjna amplifikacja niektórych transkryptów w oparciu o rozmiar i skład nukleotydów. ^4,6,7 Techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i szybka amplifikacja końców cDNA (RACE), powodują wykładniczą amplifikację transkryptów, podczas gdy procedura amplifikacji aRNA powoduje amplifikację liniową. Tak więc jedną z głównych zalet procedury aRNA jest jej zdolność do lepszego zachowania względnej obfitości transkryptów mRNA poprzez tylko liniowe wzmacnianie wszelkich błędów lub odchyleń, które występują w procesie amplifikacji, w przeciwieństwie do wykładniczego wzmacniania tych błędów i odchyleń.

Procedura aRNA w połączeniu z analizą mikromacierzy pozwala na porównanie obfitości mRNA między pojedynczymi komórkami o podobnej lub różnej morfologii, leczonymi lub nieleczonymi. Dodatkowo amplifikowany materiał może być przesyłany do sekwencjonowania nowej generacji. ^5,8 Należy jednak zachować ostrożność w takich analizach, ponieważ, w przeciwieństwie do stosowania losowych starterów w procedurze, opisana powyżej procedura primedT uprzedza amplifikację końców 3' mRNA i generalnie powoduje nieznaczne skrócenie kolejnego amplifikowanego materiału z każdą rundą. Należy zachować ostrożność podczas analizowania wyników mikromacierzy za pomocą standardowych metod, ponieważ niektóre fałszywe nieobecne wywołania mogą wynikać z nieznacznie skróconego wzmocnionego materiału. Ponadto, podczas gdy wyniki sekwencjonowania rzeczywiście dostarczą pełnej sekwencji 5' większości oryginalnego mRNA, sekwencje 5' niektórych mRNA mogą zostać pominięte. Z tych powodów liczba rund amplifikacji powinna być ograniczona.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka nakrywkowe Spiegelgas	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm szalki hodowlane	Fisher Scientific	12-565-90
Woda do hodowli komórkowych	Lonza Inc.	17-724Q	Do wytwarzania roztworów stosowanych do hodowli komórkowych i płukania szkiełek nakrywkowych
Poli-D-Lizyna MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultraczysta	BD Biosciences	354239
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	B0252
MEM z Earle' s sole i glutamax	Invitrogen	41090-101	Do posiewu komórek
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8769
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Surowica końska	Invitrogen	16050
Cytozyna beta-D-arabinofuranozyd	Sigma-Aldrich	C1768
MEM z Earle' s sole i L-glutamina	Invitrogen	11095-098	Do hodowli komórek
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P2256
B27 suplement bez surowicy	Invitrogen	17504-044
Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego (1,5 mm OD, 100 mm długości)	Kimble Chase	34500 99	Każda pipeta ze szkła borokrzemianowego będzie działać, o ile zostanie osiągnięty odpowiedni rozmiar otworu.
HBSS	Invitrogen	14175	Każde rozwiązanie będzie działać, o ile komponenty będą działać" t zakłócać jakiegokolwiek przyszłego przetwarzania (tj. brak Ca2+ lub Mg2+)1ml
strzykawka	BD Biosciences	309628
Igła	BD Biosciences		Miernik zależy od średnicy pipet
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second Strand bufor (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Dostarczany z buforem drugiej nici
Ligazy DNA E.coli	Invitrogen	100002324
polimerazy DNA I	Invitrogen	100004926
Rnazy H	Invitrogen	18021-071
Zestaw Megascript T7	Ambion	AM1334
Losowe startery	BMB	11034731001
Indeks górny III Odwrotna transkryptaza	Invitrogen	56575	w zestawie (18080-044) w zestawie z buforem pierwszej nici (Y02321) i DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute	Qiagen	28206
T4 Polimeraza DNA	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Zestaw do amplifikacji RNA Illumina TotalPrep	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter ma wiele innych modeli, wiele z nich omówiono w książce kucharskiej
Mikromanipulator	Olympus Corporation		Wiele innych mikromanipulatorów będzie działać, takich jak nowsze modele Eppendorf
Uchwyt na pipety	Warner Instruments	MP-S15A	Będzie się różnić z mikromanipulatorem i pipetą OD.
Bioanalizator RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511