Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Podsumowanie

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Streszczenie

Wiele technik analizy ekspresji genów opiera się na materiale wyizolowanym z heterogenicznych populacji komórek z homogenatów tkankowych lub komórek w hodowli.^1,2,3 W przypadku mózgu obszary takie jak hipokamp zawierają złożoną strukturę różnych typów komórek, z których każda posiada odrębne profile mRNA. Zdolność do pozyskiwania pojedynczych komórek umożliwia bardziej szczegółowe badanie różnic molekularnych między populacjami komórek oraz w ich obrębie. Opisujemy prostą i szybką metodę pozyskiwania komórek do dalszego przetwarzania. Do izolacji (poprzez aspirację) wybranej komórki i wygodnego przeniesienia jej do probówki Eppendorf w celu dalszej obróbki za pomocą dowolnej liczby technik biologii molekularnej wykorzystuje się pipety często stosowane w elektrofizjologii. Nasz protokół można zmodyfikować w celu pozyskiwania dendrytów z hodowli komórkowych lub nawet pojedynczych komórek zacute slice'ów.

Opisujemy również metodę amplifikacji aRNA jako główną aplikację analityczną następującą po izolacji pojedynczych komórek. Metoda ta została opracowana wcześniej w naszym laboratorium jako alternatywa dla innych technik analizy ekspresji genów, takich jak transkrypcja odwrotna czy polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym (PCR).^4,5,6,7,8 Technika ta umożliwia linearną amplifikację poliaadenylowanego RNA, zaczynając od ilości materiału rzędu femtogramów, co pozwala uzyskać mikrogramowe ilości antysensownego RNA. Materiał poddany amplifikacji linearnej zapewnia dokładniejszą ocenę względnej obfitości składników transkryptomu izolowanej komórki niż wykładnicza amplifikacja metodą PCR. Podstawowa procedura składa się z dwóch rund amplifikacji. W skrócie, do dwuniciowego cDNA utworzonego z transkryptów mRNA wbudowywana jest sekwencja promotora polimerazy RNA T7. Następnie przeprowadza się nocną reakcję transkrypcji in vitro (IVT), w której polimeraza RNA T7 produkuje liczne transkrypty antysensowne z dwuniciowego cDNA. Druga runda powtarza ten proces, lecz z pewnymi różnicami technicznymi, ponieważ materiałem wyjściowym jest RNA antysensowne. Standardem jest powtórzenie drugiej rundy, co daje łącznie trzy rundy amplifikacji. Często trzecia runda reakcji transkrypcji in vitro jest przeprowadzana z użyciem biotynylowanych nukleozydotrifosforanów, dzięki czemu otrzymane RNA antysensowne może być hybrydyzowane i wykrywane na mikromacierzy.^7,8

Protokół

1. Hodowla komórkowa

W naszym laboratorium do poniższych eksperymentów wykorzystujemy pierwotne hodowle neuronów hipokampa szczura. Poniższy opis przedstawia zmodyfikowany protokół Bankera dotyczący sposobu tworzenia i utrzymywania tych hodowli komórkowych.⁹ Istnieje oczywiście ogromna liczba wariantów tych technik hodowli komórkowych i każda uznana metoda dostosowana do specyficznych potrzeb danego laboratorium, która zapewnia stałe dostawy zdrowych komórek, byłaby odpowiednim zamiennikiem.

1. Pięć autoklawowanych, okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 12 mm umieszcza się w szalce 35 mm i pokrywa 80 μg/mL Poly-D-Lysine (MW 70-150,000) w buforze boranowym przez noc (O/N), płucze wodą (klasy do hodowli komórkowych), a następnie pokrywa 1 μg/mL Laminin w buforze boranowym przez noc i ponownie płucze wodą. Dodaje się pożywkę NG (MEM z solami Earle'a i GlutaMAX uzupełnioną glukozą (0,6% w/v), penicyliną (100 U/mL), streptomycyną (100 μg/mL) oraz surowicą konia (10% v/v)), a szalki przechowuje się w inkubatorze (5% CO₂ w 37°C). PDL150/laminina służy jako podłoże do wzrostu wyizolowanych neuronów w monowarstwie. Szkiełka nakrywkowe można pokryć z wyprzedzeniem do dwóch tygodni przed wysiewaniem.
2. W dniu wysiewania pierwotne neurony z hipokampów szczurzych z 18. dnia embrionalnego wysiewa się w pożywce NG, dodając 1,5 mL zawiesiny o stężeniu 100 000 komórek/mL. Od czterech do sześciu godzin po wysiewaniu każdą szalkę 35 mm traktuje się 0,75 μL 5 mM cytozyny beta-D-arabinofuranozydem (ara-C), aby zapobiec wzrostowi ewentualnych zanieczyszczających komórek glejowych. Po dwudziestu czterech godzinach pożywkę do wysiewania zmienia się na MEM z solami Earle'a i L-glutaminą, uzupełnioną o 0,6% w/v glukozy, 1 mM pirogronianu sodu oraz B27. Komórkom pozwala się rosnąć przez co najmniej dwa tygodnie przed wykorzystaniem w eksperymentach, aby umożliwić pełny rozwój wypustek.

2. Przygotowanie pipet

Uwaga dotycząca RNaz: skóra, ślina, a nawet oddech są głównymi źródłami RNaz, czyli enzymów degradujących RNA. Od tego momentu w protokole niezbędne jest stosowanie technik wolnych od RNaz, aby próbka nie została zanieczyszczona RNazami i w konsekwencji nie uległa degradacji. Obejmuje to stałe noszenie rękawiczek podczas pracy z próbkami i odczynnikami, zakaz mówienia nad próbkami lub odczynnikami oraz stosowanie nowych opakowań sterylnych końcówek do pipet i probówek. Pipety, które nie są przeznaczone wyłącznie do pracy z RNA, często odkaża się, przecierając je roztworem do usuwania RNaz, takim jak RNase AWAY (Molecular Bioproducts). Należy jednak pamiętać, że roztwory te hamują wszelkie dalsze reakcje enzymatyczne, dlatego ważne jest zapobieganie zanieczyszczeniu próbek tymi środkami.

1. Autoklawować pipety szklane o średnicy zewnętrznej (O.D.) 1,5 mm.
2. Za pomocą wyciągacza mikropipet wyciągnąć pipety do średnicy odpowiedniej dla rejestracji elektrofizjologicznych, która może się różnić w zależności od modelu wyciągacza, włókna oraz samych pipet.¹⁰ Wielkość otworu nie jest zbyt istotna, ponieważ końcówka zostanie odłamana przed pobraniem komórek.
3. Ostrożnie przechowywać pipety w środowisku wolnym od kurzu, w którym końcówki pozostaną nienaruszone (idealnie w słoiku do przechowywania mikropipet).
4. Aby w kontrolowany sposób odłamać końcówkę, napiąć chusteczkę Kimwipe między palcami jednej ręki i bardzo delikatnie przesunąć końcówkę pipety po papierze 1-2 razy. Otwór powinien stanowić około 75-100% rozmiaru docelowej komórki. Powtarzać ten krok do uzyskania pożądanego efektu.

3. Przygotowanie hodowli, probówek i mikroskopu

1. Przygotować odpowiednią liczbę probówek Eppendorf o pojemności 1,7 mL. Dodać 2 μL PBS, buforu do pierwszej nici, jeśli materiał ma zostać użyty do amplifikacji pojedynczych komórek, lub innego roztworu do przechowywania pobranego materiału.
2. Do pobierania materiału niezbędny będzie mikroskop świetlny z obiektywem 40x wyposażonym w mikromanipulator. Należy użyć uchwytu do pipety z elastycznym drenem prowadzącym od uchwytu. Przymocować dren do stabilnej powierzchni, aby zapobiec niepożądanym ruchom pipety podczas zbierania próbek. Na końcu drenu należy wstawić igłę w taki sposób, aby można było podłączyć i wymieniać między użytkownikami strzykawkę 1 mL z połączeniem Luer-Lock.
3. W przypadku użycia szkiełek nakrywkowych należy pracować z jednym szkiełkiem naraz. Jeśli jest to konieczne, przenieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe do nowej szalki 35 mm* zawierającej PBS lub wybrany rodzaj medium. Im dłużej komórki pozostają poza inkubatorem, tym bardziej tracą żywotność, a ich profile mRNA bardziej odbiegają od profilu zdrowej komórki. Kluczowe jest zachowanie żywotności komórek na pozostałych szkiełkach nakrywkowych poprzez pozostawienie ich w inkubatorze w czasie, gdy się z nimi nie pracuje. Z komórkami znajdującymi się poza inkubatorem należy pracować jak najszybciej.

*W naszej konfiguracji konieczne jest użycie pokrywki od szalki 35 mm, ponieważ ścianki właściwej szalki są zbyt wysokie, aby umożliwić prawidłowe przesunięcie mikropipety w stronę szkiełka podstawowego.

4. Zbieranie komórek

1. Zamocuj mikropipetę w uchwycie do mikropipet. Przymocuj uchwyt do insertu w mikromanipulatorach. Ustaw obiektyw 40x.
2. Umieść szalkę na stoliku mikroskopu i znajdź obszar komórek odpowiedni do zbioru. W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych komórka powinna być stosunkowo odizolowana od sąsiadujących komórek, aby zapobiec pobraniu komórek otaczających i/lub ich wypustek. Populacja transkryptów mRNA różni się między somą a wypustkami, dlatego w przypadku zainteresowania wyłącznie mRNA somatycznym należy zachować ostrożność, aby uniknąć zanieczyszczenia somy wypustkami. Umieść komórkę przeznaczoną do zbioru w centrum pola widzenia.
3. Użyj mikromanipulatora, aby przesunąć mikropipetę w stronę roztworu w szalce, w obszar drogi światła. Zانurz końcówkę pipety w roztworze. Od tego momentu zastosuj nadciśnienie, delikatnie dmuchając przez strzykawkę. Spójrz przez okular. Pipeta powinna być widoczna jako cień w polu widzenia. Znacznie powyżej płaszczyzny komórek dostosuj położenie końcówki pipety, aż znajdzie się ona w polu widzenia, a następnie ustaw ostrość na końcówkę pipety za pomocą pokręteł grubego ustawiania. W tym momencie należy ocenić, czy średnica otworu pipety nie jest zbyt duża lub zbyt mała. Praktyka w pobieraniu komórek pozwoli określić, czy na tym etapie uzyskano odpowiednią średnicę otworu.
4. Teraz przesuń pipetę w stronę płaszczyzny komórek. Ważne jest, aby nie przesuwać końcówki zbyt gwałtownie, co mogłoby spowodować jej złamanie w obszarze, z którego planujesz dokonać zbioru. Aby temu zapobiec, użyj grubego ustawiania do przesunięcia płaszczyzny ogniskowania PRZED przesunięciem końcówki pipety w stronę komórek za pomocą mikromanipulatorów. Gdy będziesz blisko komórek, użyj mikroregulacji ostrości, aż zarówno komórki, jak i końcówka pipety zostaną ustawione ostro. Przestań stosować nadciśnienie przed dotarciem do płaszczyzny komórek, aby zapobiec ich zdmuchnięciu z szkiełka nakrywkowego.
5. Użyj mikromanipulatorów, aby ustawić końcówkę pipety tak, aby dotykała ona somy komórki przeznaczonej do zbioru.
6. Używając strzykawki, zastosuj delikatne podciśnienie ustami, aż komórka zostanie wciągnięta do końcówki pipety. Jeśli komórka nie wnika do pipety, delikatnie przesuń końcówkę bliżej komórki i w dół, aż komórka oderwie się od szkiełka nakrywkowego.

5. Ratowanie komórki

1. Za pomocą mikromanipulatora natychmiast przesuń pipetę w górę i wyjmij ją z roztworu.
2. Wyjmij pipetę z uchwytu.
3. Trzymając w jednej ręce probówkę Eppendorf 1,7 mL, delikatnie odłam końcówkę pipety o ściankę probówki w kierunku jej dna. (Celuj w poziom oznaczenia 0,1 mL).
4. Kiedy odłamana końcówka znajduje się w centrum probówki, wprowadź igłę przymocowaną do strzykawki 1-3 mL do górnego otworu pipety. Szybko naciśnij tłok, aby wypchnąć roztwór z pipety do probówki w postaci strumienia. Komórka powinna pozostać w samej końcówce pipety, co powinno być wystarczające do jej właściwego wypchnięcia. Należy uważać, aby nie dotknąć końcówką żadnego płynu na ściankach probówki, ponieważ działanie kapilarne może zaciągnąć płyn z powrotem do pipety.
5. Szybko odwirowuj zawartość probówki w mikrowirówce naktowej i natychmiast zamroź (przechowuj w -80°C) lub umieść na lodzie w celu dalszego przetwarzania (zalecane).

6. Amplifikacja aRNA

1. Runda 1: Synteza pierwszej nici cDNA:
   Tworzenie hybryd mRNA/cDNA.
   1. Na każde 5 μL objętości zebranych pojedynczych komórek dodać do probówki z materiałem (na lodzie) 1x następujących odczynników. Reakcję można przeskalować dla większych objętości materiału (2x dla 10 μL, itd.). Należy przygotować master mix, mnożąc ilość odczynników przez liczbę probówek, dodając 10-20% zapasu na błędy pipetowania. Postępować tak samo przy każdej kolejnej reakcji w procedurze amplifikacji aRNA.
      • NA LODZIE
      • 1.2 μL dNTP (po 2.5 mM każdego)
      • 2.4 μL 5x bufor do pierwszej nici
      • 0.3 μL starter T7-oligo(dT) (100 ng/μL)
      • 1.2 μL DTT (100 mM)
   2. Uzupełnić objętość do 10.25 μL wodą wolną od nukleaz. Wymieszać pipetą i krótko wirować w mikrowirówce.
   3. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 70°C, aby zdenaturować struktury drugorzędowe mRNA. Natychmiast przenieść na lód na co najmniej 5 minut.
   4. Dodać (ponownie korzystając z master mixu):
      • 0.3 μL RNasin (40 U/μL)
      • 0.45 μL Superscript III (200 U/μL)
      • 1 μL woda wolna od nukleaz
   5. Wymieszać pipetą i krótko wirować. Inkubować przez 1 godzinę w 42°C.
   6. Inkubować w 70°C przez 15 minut, aby inaktywować enzym Superscript. Przejść do następnego kroku.
2. Runda 1: Synteza drugiej nici cDNA
   Tworzenie starterów RNA z części mRNA hybrydy mRNA/DNA w celu wspomagania syntezy dwuniciowego cDNA.
   1. • NA LODZIE
      • Do 12 μL reakcji syntezy pierwszej nici dodać:
      • 8 μL woda wolna od nukleaz
      • 5.6 μL 5x bufor do drugiej nici
      • 0.75 μL mieszanina dNTP (po 2.5 mM każdego)
      • 0.25 μL ligaza DNA (10 U/μL)
      • 1 μL polimeraza DNA I (10 U/μL)
      • 0.25 μL RNaza H (2 U/μL)
      Dokładnie wymieszać pipetą i krótko wirować. Inkubować przez 2 godziny w 16°C.
   2. Dodać: 1 μL polimerazy DNA T4 (5 U/μL). Wymieszać pipetą i krótko wirować. Inkubować przez kolejne 10 minut w 16°C.
   3. Oczyścić reakcję za pomocą zestawu Qiagen MinElute zgodnie z instrukcją producenta z niewielkimi modyfikacjami: ¹¹ przemyć 2 razy 500 μL buforem do przemywania zamiast 1 raz 750 μL. Eluować wodą wolną od nukleaz.
   4. Skoncentrować do 2-4 μL za pomocą Speedvac lub poprzez precypitację etanolem. Podczas precypitacji etanolem glikogen pełni rolę nośnika kwasów nukleinowych i jest stosowany przy wytrącaniu niewielkich ilości DNA lub RNA. Sód z octanu sodu pomaga zneutralizować ładunek ujemny szkieletu DNA, wspomagając precypitację. Przy rutynowych precypitacjach nie jest konieczne przygotowywanie master mixu.
      • Dodać 40 μL wody z DEPC
      • 1 μL glikogenu (3 mg/mL)
      • 1/10 objętości (3 μL) 3M octanu sodu
      • 2.5 objętości (~125 μL) zimnego 100% etanolu
      Dobrze wymieszać. Wytrącać w -80°C (od 30 min do całej nocy).
   5. Wirować przez 20 minut w 4°C.
   6. Usunąć nadsącz i przemyć osad 800 μL 70% etanolu. Należy całkowicie odczepić osad za pomocą pipety lub wortexowania, aby ułatwić usunięcie nadmiaru soli.
   7. Wirować przez kolejne 20 minut w 4°C. Usunąć nadsącz i wysuszyć na powietrzu.
   8. Resuspendować w 4 μL wody wolnej od nukleaz. Przechowywać w -20 lub -80 °C lub przejść do następnego kroku.
3. Runda 1: Transkrypcja in vitro (IVT):
   Synteza antysensownego RNA z promotora T7 wbudowanego w dwuniciowe cDNA.
   1. Reakcję tę przeprowadza się przy użyciu zestawu Ambion MEGAscript T7 zgodnie z instrukcją producenta, z wyjątkiem przeskalowania reakcji do 10 μL zamiast 20 μL.¹² Jest kluczowe, aby przygotować tę reakcję w temperaturze pokojowej i utrzymywać bufor w temperaturze pokojowej podczas przygotowania. Dostarczony bufor spowoduje precypitację DNA, jeśli będzie bardzo zimny. Mieszaninę NTP i enzymów przechowywać na lodzie, gdy nie są używane.
      • W TEMPERATURZE POKOJOJOWEJ
      • Przenieść resuspendowane dwuniciowe cDNA do cienkościennej probówki PCR.
      • Dodać 4 μL mieszaniny NTP (po 18.75 mM każdego)
      • 1 μL 10x bufor reakcyjny
      • 1 μL 10x mieszanina enzymów
   2. Inkubować przez 14 godzin w 37°C w termocyklerze (preferowane) lub inkubatorze.
   3. Reakcję tę można oczyścić dwiema różnymi metodami, a następnie skoncentrować próbkę za pomocą Speedvac lub precypitacji etanolem. Aby oczyścić za pomocą zestawu, przejść do Metody A. W przypadku standardowej ekstrakcji fenol/chloroform, przejść do Metody B.
   4. Metoda A:
      1. Oczyścić reakcję za pomocą zestawu AMBION Megaclear zgodnie z instrukcją producenta z pewnymi modyfikacjami¹³: przemyć 2 razy 500 μL buforem do przemywania zamiast 1 raz 750 μL. W kroku eluowania dodać 50 μL wody wolnej od nukleaz do środka kolumny, inkubować w 70 °C przez 10 minut. Wirować przy 10 000g przez 1 min. Powtórzyć w nowej probówce. Połączyć eluaty. Skoncentrować próbkę do 2-4 μL za pomocą Speedvac LUB poprzez precypitację etanolem.
      2. W przypadku precypitacji etanolem: w tym przypadku zamiast octanu sodu stosuje się octan amonu, ponieważ skutecznie zapobiega on współwytrącaniu wolnych nukleotydów wraz z kwasem nukleinowym. Jest to istotne ze względu na wysokie stężenie NTP użytych w reakcji IVT, które mogą hamować dalsze reakcje.
         • 2 μL glikogenu (5 mg/mL)
         • 0.1 objętości (10 μL) 5M octanu amonu
         • 2.5 objętości (~275 μL) zimnego etanolu
      3. Wytrącać w -80°C (od 30 min do całej nocy).*
      4. Wirować przez 20 minut w 4°C.
      5. Usunąć nadsącz i przemyć osad 800 μL 70% etanolu (w wodzie wolnej od nukleaz). Należy całkowicie odczepić osad, aby usunąć cały nadmiar soli.
      6. Wirować przez kolejne 20 minut w 4°C.
      7. Usunąć nadsącz i wysuszyć na powietrzu.
      8. Resuspendować osad w 4 μL wody wolnej od nukleaz.
   5. Metoda B:
      1. Alternatywnie aRNA można oczyścić za pomocą standardowej ekstrakcji fenol/chloroform.
         • Dodać 90 μL wody z DEPC
         • 2 μL glikogenu (5 mg/mL)
         • 0.1 objętości (10 μL) 5M octanu amonu
         • 1 objętość (100 μL) fenol:chloroform:alkohol izoamylowy 25:24:1 (zrównoważony do pH 7.8-8.0)
      2. Wortexować przez 15 sekund. Wirować przez 1.5 minuty przy połowie maksymalnej prędkości w stołowej mikrowirówce. Przenieść górną warstwę wodną do nowej probówki zawierającej 2.5 objętości (245 μL) zimnego etanolu.
      3. Wytrącać w -80°C (od 30 min do całej nocy).
      4. Wirować przez 20 minut w 4°C.
      5. Usunąć nadsącz i przemyć osad 800 μL 70% etanolu (w wodzie wolnej od nukleaz). Należy całkowicie odczepić osad, aby usunąć cały nadmiar soli.
      6. Wirować przez kolejne 20 minut w 4°C.
      7. Usunąć nadsącz i wysuszyć na powietrzu.
      8. Resuspendować osad w 4 μL wody wolnej od nukleaz.
         
         *Próbka może zamarznąć w tej temperaturze podczas inkubacji przez noc. Wykazano, że może to w rzeczywistości zwiększyć wydajność kwasów nukleinowych.

4. Runda 2: Synteza pierwszej nici cDNA
   1. • W LODZIE
      • Dodać 1 μL starterów Random primers (0.05 mg/mL)*
   2. Ogrzewać w temperaturze 70°C przez 10 minut. Natychmiast umieścić w lodzie na co najmniej 5 minut.
   3. • Dodać 2 μL 5x First strand buffer
      • 1 μL DTT (100 mM)
      • 0.5 μL dNTP's (po 2.5 mM każdy)
      • 0.5 μL RNasin (40 U/μL)
      • 1 μL Superscript III (200 U/μL)
   4. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko wirować. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut. Ten krok jest niezbędny, aby umożliwić wydłużenie krótkich starterów randomowych przed przeprowadzeniem reakcji odwrotnej transkrypcji.
   5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 42°C.
   6. Ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 95°C, aby zdenaturować RNA w hybrydach DNA/RNA. Umieścić w lodzie na co najmniej 5 minut. Przechowywać w temperaturze -20°C lub -80°C lub natychmiast przejść do następnego kroku.
      
      *Stężenie starterów randomowych jest istotne. Jeśli stężenie będzie zbyt wysokie, produkt będzie bardziej skrócony w każdej rundzie amplifikacji.
5. Runda 2: Synteza drugiej nici cDNA
   1. • W LODZIE
      • Dodać 2 μL starteru T7-oligo(dT) (10 ng/μL)*
   2. Ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 70°C. Natychmiast umieścić w lodzie na co najmniej 5 minut. Krótko wirować.
   3. • Dodać 43.5 μL wody wolnej od nukleaz
      • 15 μL 5x Second strand buffer
      • 1.5 μL mieszaniny dNTP (po 2.5 mM każdy)
      • 2 μL polimerazy DNA I (10 U/μL)
   4. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko wirować. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16°C.
   5. Dodać 2 μL polimerazy DNA T4 (5 U/μL)
   6. Dokładnie wymieszać pipetując i krótko wirować. Inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 16°C.
   7. Oczyścić produkt reakcji za pomocą zestawu Qiagen Minelute zgodnie z opisem w sekcji 6.2.3.
   8. Skoncentrować do objętości 2-4 μL za pomocą Speedvac lub poprzez precypitację etanolem zgodnie z sekcjami 6.2.4 do 6.2.8.
      
      *Należy zwrócić uwagę na inne stężenie roztworu podstawowego starteru T7-oligo(dT) w porównaniu do syntezy drugiej nici cDNA w pierwszej rundzie.
6. Runda 2: Transkrypcja In vitro
   Przeprowadzić zgodnie z opisem w sekcji 6.3.
   1. Powtórzyć sekcje 6.4 do 6.6 żądaną liczbę razy. Należy pamiętać, że każda kolejna runda amplifikacji prowadzi do powstania krótszych produktów aRNA. Z tego powodu liczba rund amplifikacji powinna być ograniczona. Zazwyczaj dwie do trzech rund amplifikacji są wystarczające, aby namnożyć materiał pobrany z pojedynczej komórki do analizy mikromacierzy. W przypadku analizy mikromacierzy, trzecią rundę reakcji IVT przeprowadza się przy użyciu zestawu Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Procedura ta wprowadza znakowane biotyną UTP do aRNA, które jest następnie wykorzystywane do detekcji na chipie mikromacierzy.
   2. Zmierzyć stężenie aRNA z trzeciej rundy za pomocą Nanodrop lub Agilent Bioanalyzer z zestawem Nano RNA.

7. Reprezentatywne wyniki

Pomyślne wyizolowanie pojedynczej komórki z pierwotnych kultur neuronowych może zostać przeprowadzone w czasie krótszym niż 2 minuty, w zależności od wprawy (patrz Rycina 1). Czas izolacji będzie się jednak różnić w zależności od systemu oraz przeprowadzonych manipulacji eksperymentalnych. Poddanie pojedynczej komórki procedurze aRNA (patrz Ryciny 4A i 4B) skutkuje uzyskaniem mikrogramowych ilości całkowitego amplifikowanego aRNA i daje charakterystyczny szeroki pik podczas analizy bioanalizatorem (patrz Rycina 3). Trzy rundy można ukończyć w minimum trzy dni, co umożliwia szybką analizę ekspresji genów w pojedynczej komórce.

Rysunek 1. Przedstawiono przykład pomyślnego pobrania izolowanego neuronu. Wybrano obszar o stosunkowo niskiej gęstości (A) i przesunięto końcówkę pipety w stronę pożądanej komórki (B). Trzeci obraz (C) przedstawia pole widzenia po pobraniu komórki. Należy zauważyć, że otaczające wypustki pozostały na szkiełku podstawowym.

Rycina 2. Przedstawiono dwa obrazy końcówek pipet, których rozmiar jest niewłaściwy do efektywnego zbioru. Końcówki te doprowadzą odpowiednio do niepełnego zbioru (A) oraz zbioru otaczającego środowiska (B).

Rycina 3. Po zbiorze i amplifikacji zaleca się przeprowadzenie analizy za pomocą bioanalizatora w celu zbadania rozkładu i ilości amplifikowanego RNA. Pomyślna amplifikacja z materiału pojedynczej komórki pozwoli uzyskać całkowite ilości rzędu kilku mikrogramów, a rozkład będzie gładki i szeroki.

Rycina 4. Przedstawiono schematy pierwszej rundy (A) i drugiej rundy (B) procedury aRNA.

Dyskusja

Uwagi i rozwiązywanie problemów

• Warto wykonać zdjęcia przed i po zabiegu, aby wykazać, że komórka docelowa została wyizolowana, a pozostała półcień pozostał nienaruszony.
• Jeśli podczas pobierania do pipety dostaje się zbyt dużo roztworu, można zastosować trójdrożne złączki Luer-Lock oraz tłok strzykawki, aby utrzymać dodatnie ciśnienie w cewce. Wymagana objętość zależy od rodzaju przetwarzania, ale dla większości zastosowań wartość do 5 μl powinna być wystarczająca.

Ogólne wskazówki dotyczące technik biologii molekularnej

• Wszystkie probówki ze stokami należy wymieszać na wirówce laboratoryjnej (vortex) i odwirować przed dodaniem do reakcji. NIGDY nie należy mieszać enzymów na vortexie.
• Przed dodaniem enzymu należy dokładnie wymieszać składniki reakcji, aby upewnić się, że bufor ma odpowiednie stężenie.
• Jeśli to możliwe, należy przechowywać stoki enzymów w temperaturze -20°C, korzystając z chłodziarek typu stratacooler. W przeciwnym razie należy je wyjąć bezpośrednio przed użyciem, przechowywać w lodzie i niezwłocznie zwrócić do -20°C.
• Przy przygotowywaniu więcej niż jednej reakcji zawsze należy sporządzać mieszaniny główne (master mixes), aby zminimalizować błędy pipetowania. Obliczyć wymaganą objętość na podstawie liczby próbek i dodać 10-20% zapasu.
• RNA należy przechowywać w temperaturze -80°C, aby opóźnić degradację. RNA jest najstabilniejsze w buforze, co zapobiega apurynacji RNA zachodzącej w warunkach kwasowych.

Ogólny zarys procedury aRNA

Rysunek 4A przedstawia pierwszy etap procedury aRNA. W reakcji syntezy pierwszej nici fragment poly-T primera T7-oligo(dT) selekcjonuje gatunki mRNA (długi biały prostokąt) poprzez wiązanie się z ogonami polyA. Niektóre mikroRNA są również poliadenylowane i zostaną wychwycone w tej procedurze. Co ważniejsze jednak, najliczniejsze RNA w komórce, czyli RNA rybosomalne, nie zostaną tak wychwycone. Oligonukleotyd ten służy jako primer dla odwrotnej transkryptazy do syntezy komplementarnej nici cDNA (długi szary prostokąt), wykorzystując mRNA jako matrycę. Fragment T7 primera T7-oligo(dT) wprowadza promotor polimerazy RNA T7 w ramce odczytu z sekwencją antysensowną względem wyjściowego mRNA. Jest on wykorzystywany później w reakcji transkrypcji in vitro.

Następnie mRNA w hybrydzie mRNA/DNA utworzonej w poprzednim kroku jest częściowo hydrolizowane przez RNazę H, co prowadzi do powstania „starterów” RNA (małe białe prostokąty) podobnych do fragmentów Okazaki powstających podczas syntezy DNA na nici opóźnionej. Polimeraza DNA I wykorzystuje fragmenty RNA do inicjacji syntezy DNA, używając jako matrycy DNA komplementarnego do mRNA. Po dotarciu do kolejnego fragmentu RNA, jej aktywność nukleazowa 5' do 3' usuwa rybonukleotydy i zastępuje je deoksyrybonukleotydami. Dodaje się ligazę DNA w celu połączenia wszystkich nici, w których zastąpienie nici prowadzącej nie zostało zakończone. Dodaje się polimerazę DNA T4, aby wypełnić obszary, w których fragmenty RNA służyły jako pierwotne startery dla polimerazy DNA I, tworząc w ten sposóbtęmpo-końcowe dwuniciowe cDNA, które następnie jest oczyszczane przed przeprowadzeniem reakcji IVT.

W reakcji IVT polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7 wbudowanym w dwuniciowe cDNA i syntetyzuje cząsteczki RNA antysensownego (długie czarne prostokąty), wykorzystując nić sensowną jako matrycę. Służy to jako etap amplifikacji, w którym z każdej dwuniciowej cząsteczki cDNA powstają tysiące cząsteczek RNA antysensownego (Rysunek 4A).

Druga runda, przedstawiona na rysunku 4B, rozpoczyna się od reakcji odwrotnej transkrypcji, która nieco różni się od tej z pierwszej rundy, ponieważ startowym RNA jest RNA antysensowne (czarny pełny prostokąt), któremu brakuje ogona poliadenylowanego, będącego celem startera T7-oligo(dT) w pierwszej rundzie. W związku z tym reakcja ta jest inicjowana za pomocą starterów losowych (małe szare prostokąty), a następnie RNA zostaje zdenaturowane. Reakcja syntezy drugiej nici jest inicjowana przez starter T7-oligo(dT), który wiąże się z sekwencją poli-A na końcu 3' sensownego RNA powstałego w poprzedniej reakcji odwrotnej transkrypcji. Następnie przeprowadza się kolejną reakcję IVT w taki sam sposób, jak w pierwszej rundzie. Tę drugą rundę zazwyczaj powtarza się co najmniej raz, aby uzyskać trzy rundy amplifikacji z pojedynczej komórki.

Zastosowania

Techniki przedstawione w niniejszym artykule mogą zostać zastosowane w szerokim zakresie aplikacji. Protokół izolacji pojedynczych komórek można zmodyfikować do użytku w świeżych skrawkach tkanki.¹⁴ Choć jest to technicznie trudniejsze, w tym alternatywnym przygotowaniu obowiązują te same zasady. Ponadto, po niewielkiej korekcie rozmiaru pipety, można przeprowadzić pomiary fizjologiczne komórek przed ich pobraniem, co pozwala na ściśle kontrolowane badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi fizjologicznych. Inną niewielką modyfikacją jest izolacja wypustek z somy komórki.¹⁵ W tym zastosowaniu ciała komórek należy pobrać jedną pipetą, a następnie, używając nowej pipety, zebrać od 100-300 zidentyfikowanych dendrytów lub aksonów do każdej probówki.¹⁶

Po zebraniu komórek można przeprowadzić porównania zawartości i składu mRNA pomiędzy różnymi, a nawet w obrębie tej samej populacji komórek. Włączenie biotynylowanego UTP w trzeciej rundzie syntezy aRNA umożliwia analizę mikromacierzy w celu określenia względnej zawartości mRNA. Skład pierwotnej populacji mRNA może być również określony po procedurze aRNA przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Amplifikowane aRNA może być także wykorzystane do potwierdzenia badań konwersji fenotypu komórkowego, w których pełny zestaw mRNA z jednego typu komórek jest transfekowany do innego typu komórek w celu wywołania przejścia fenotypu tego drugiego typu w fenotyp pierwszego; procedura ta została opracowana w tym laboratorium i jest znana jako TIPeR.¹⁷ Badania te są szczególnie użyteczne w analizie stanów chorobowych i fenotypów komórkowych i są obecnie prowadzone w laboratorium. Na materiale amplifikowanym można wykonać RT-PCR lub qPCR, aby potwierdzić ekspresję genów specyficznych dla danej komórki. Dodatkowo, oceny wydajności transfekcji lub transdukcji można przeprowadzić na poziomie pojedynczej komórki.

Zalety i ograniczenia

Jak stwierdzono w streszczeniu, izolacja pojedynczych komórek do analizy eliminuje efekty uśredniania obserwowane podczas analizy heterogenicznych populacji komórkowych. Efekty uśredniania te zniekształcają obraz zawartości mRNA w pojedynczej komórce poprzez nadmierne reprezentowanie obfitych transkryptów oraz uśrednianie, co uniemożliwia wykrycie wielu transkryptów o niskiej liczności. Do sortowania poszczególnych komórek można wykorzystać cytometrię przepływową, jednak metoda ta wymaga znajomości markerów specyficznych dla komórek oraz kosztownego sprzętu.¹⁸ Laserowa mikrodysekcja z wykorzystaniem systemów przechwytywania laserowego UV lub IR umożliwia wyizolowanie pojedynczych komórek, a nawet fragmentów wewnątrzkomórkowych, ale wymaga, aby komórki będące przedmiotem zainteresowania znajdowały się na powierzchni bardzo cienkich przekrojów.¹⁹ Podobnie jak w przypadku cytometrii przepływowej, laserowa mikrodysekcja również wymaga kosztownego sprzętu.

Jedną z głównych zalet opisanej powyżej techniki zbierania opartej na elektrodach jest możliwość uzyskania cennych danych elektrofizjologicznych z badanej komórki przed jej zebraniem, co pozwala na przeprowadzenie analizy funkcjonalnej i transkryptomicznej na tej samej komórce.²⁰ Wadą naszej techniki jest to, że wymaga ona doświadczenia w obsłudze mikromanipulatorów. Badacze zaznajomieni z mikromanipulatorami uznają tę technikę za bardzo intuicyjną; jednak osoby bez takiego doświadczenia będą musiały opanować precyzyjne ruchy, które są tutaj niezbędne.

Każda technika amplifikacji wiąże się z preferencyjną amplifikacją określonych transkryptów w zależności od ich wielkości oraz składu nukleotydowego.^4,6,7 Techniki oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), takie jak polimerazy reakcyjna z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) oraz szybka amplifikacja końców cDNA (RACE), prowadzą do wykładniczej amplifikacji transkryptów, podczas gdy procedura amplifikacji aRNA skutkuje amplifikacją liniową. Zatem jedną z głównych zalet procedury aRNA jest zdolność do lepszego zachowania względnej liczby transkryptów mRNA poprzez jedynie liniową amplifikację błędów lub odchyleń występujących w procesie amplifikacji, w przeciwieństwie do wykładniczej amplifikacji wspomnianych błędów i odchyleń.

Procedura aRNA w połączeniu z analizą mikromacierzy umożliwia porównanie poziomu mRNA pomiędzy pojedynczymi komórkami o podobnej lub różnej morfologii, poddanymi lub nie poddanymi działaniu określonych czynników. Dodatkowo, amplifikowany materiał może zostać poddany sekwencjonowaniu nowej generacji.^5,8 Należy jednak zachować ostrożność podczas takich analiz, ponieważ w przeciwieństwie do zastosowania starterów przypadkowych w tej procedurze, opisana powyżej metoda z zastosowaniem starterów oligo-dT powoduje preferencyjną amplifikację końców 3' mRNA i zazwyczaj prowadzi do niewielkiego skrócenia materiału amplifikowanego przy każdej kolejnej rundzie. Należy zachować ostrożność podczas analizy wyników mikromacierzy metodami standardowymi, ponieważ w przypadku lekko skróconego materiału amplifikowanego mogą wystąpić fałszywie ujemne wyniki. Ponadto, choć wyniki sekwencjonowania zapewnią pełną sekwencję 5' większości oryginalnych cząsteczek mRNA, sekwencje 5' niektórych mRNA mogą zostać pominięte. Z tych powodów liczba rund amplifikacji powinna być ograniczona.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szkiełka podstawowe Spiegelgas	Carolina Biological	63-3029
szalki hodowlane Nunc 35x10 mm	Fisher Scientific	12-565-90
Woda do hodowli komórkowych	Lonza Inc.	17-724Q	Do przygotowania roztworów stosowanych w hodowli komórkowej oraz do płukania szkiełek podstawowych
Poli-D-lizyna MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminina, ultrapure	BD Biosciences	354239
Kwas borowy	Sigma-Aldrich	B0252
MEM z dodatkiem soli Earle'a’sole solne i glutamax	Invitrogen	41090-101	Do wysiewania komórek
D-glukoza	Sigma-Aldrich	G8769
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Surowica konia	Invitrogen	16050
cytozyna beta-D-arabinofuranozyd	Sigma-Aldrich	C1768
MEM z dodatkiem soli Earle'a’sole L-glutaminy	Invitrogen	11095-098	Do hodowli komórek
Pirowinian sodu	Sigma-Aldrich	P2256
suplement bezsurowiczy B27	Invitrogen	17504-044
Kapilary borokrzemowe (średnica zewnętrzna 1,5 mm, długość 100 mm)	Kimble Chase	34500 99	Można zastosować dowolną pipetę z borokrzemianowego szkła, pod warunkiem uzyskania odpowiedniej średnicy otworu.
HBSS	Invitrogen	14175	Każdy roztwór będzie odpowiedni, pod warunkiem że składniki nie’aby nie zakłócić żadnego z przyszłych etapów przetwarzania (tj. brak Ca)2+ lub Mg2+)
strzykawka 1 ml	BD Biosciences	309628
Igła	BD Biosciences		Rozmiar igły (gauge) zależy od średnicy pipet
mieszanka dNTP	Amersham	28-4065-51
oligo dt-T7	Niestandardowy	Certyfikat Midland
Bufor do drugiej nici (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Dostarczono z buforem do syntezy drugiej nici
Ligaza DNA z E. coli	Invitrogen	100002324
polimeraza DNA I	Invitrogen	100004926
RNaza H	Invitrogen	18021-071
zestaw Megascript T7	Ambion	AM1334
Startery losowe	BMB	11034731001
odwrotna transkryptaza Superscript III	Invitrogen	56575	zestaw (18080-044) zawiera bufor do pierwszej nici (Y02321) oraz DTT
Zestaw MEGAclear	Ambion	1908
Zestaw do oczyszczania produktów reakcji MinElute	Qiagen	28206
polimeraza DNA T4	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Zestaw do amplifikacji RNA Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Wypalarka do mikropipet typu Flaming/Brown	Sutter Instrument Co.	P-87	Firma Sutter oferuje wiele innych modeli, z których wiele zostało omówionych w podręczniku.
Mikromanipulator	Olympus Corporation		Wiele innych mikromanipulatorów będzie odpowiednich, np. nowsze modele firmy Eppendorf
Stojak na pipety	Warner Instruments	MP-S15A	Będzie się różnić w zależności od mikromanipulatora i średnicy zewnętrznej pipety.
Zestaw Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511