Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

20.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2636

⸱

11 lutego 2011

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Tulane University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Streszczenie

Coraz częściej środowiska hodowli komórkowych o określonym wzorze stają się istotną techniką badania charakterystyki komórkowej, a wielu badaczy uznaje za niezbędne stosowanie środowisk 3D w eksperymentach in vitro, aby lepiej odwzorować właściwości in vivo 1-3. Badania w takich dziedzinach jak onkologia 4, inżynieria neuronalna 5, fizjologia serca 6 oraz oddziaływania komórka-macierz 7,8 wykazały, że zachowanie komórek różni się znacząco pomiędzy tradycyjnymi hodowlami monolayerowymi a konstrukcjami 3D.

Hydrożele są wykorzystywane jako środowiska 3D ze względu na swoją różnorodność, wszechstronność oraz możliwość dostosowania składu molekularnego poprzez funkcjonalizację 9-12. Istnieje wiele technik tworzenia konstrukcji służących jako macierze wspierające komórki, w tym elektroprzędzenie13, stempelki elastomerowe14, druk atramentowy15, addytywne fotopatternowanie16, statyczna litografia projekcyjna z maską fotolitograficzną17 oraz dynamiczna mikrostereolitografia z maską18. Niestety metody te wiążą się z wieloma etapami produkcji i/lub wymagają sprzętu, który nie jest łatwo dostosowalny do konwencjonalnych metod hodowli komórek i tkanek. Technika zastosowana w niniejszym protokole adaptuje dwie ostatnie metody, wykorzystując urządzenie cyfrowych mikroluster (DMD) do tworzenia dynamicznych masek fotolitograficznych w celu sieciowania geometrycznie specyficznych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG), indukowanego poprzez polimeryzację rodnikową inicjowaną promieniami UV. Powstałe struktury „2.5D” zapewniają ograniczone środowisko 3D dla wzrostu neuronów. Stosujemy podejście z podwójnym hydrożelem, w którym PEG służy jako region ograniczający komórki, nadając strukturę inaczej bezkształtnemu, ale dopuszczającemu komórki żelowi samofunkcjonalnemu wykonanemu z Puramatrix lub agarozy. Proces ten jest szybką i prostą jednoczynnościową metodą wytwarzania, która jest wysoce powtarzalna i łatwo dostosowalna do stosowania z konwencjonalnymi metodami i podłożami do hodowli komórkowych.

Całe eksplanty tkanek, takie jak embrionalne zwoje korzeni grzbietowych (DRG), mogą być włączone do dwuskładnikowych konstrukcji hydrożelowych w celu przeprowadzenia testów eksperymentalnych, takich jak pomiar wzrostu neurytów. Dodatkowo, dysocjowane komórki mogą zostać zamknięte w hydrożelu fotopolimeryzowalnym lub samopolimeryzującym, bądź selektywnie przytwierdzone do przepuszczalnej membrany wspierającej przy użyciu fotowzorowania ograniczającego rozmieszczenie komórek. Wykorzystując DMD, stworzyliśmy konstrukcje hydrożelowe o grubości do ~1mm, jednak struktury z PEG w formie cienkich warstw (<200 μm) były ograniczone przez wygaszanie tlenowe reakcji polimeryzacji rodnikowej. Następnie opracowaliśmy technikę wykorzystującą warstwę oleju nad cieczą polimeryzacyjną, co umożliwiło polimeryzację cienkich struktur z PEG.

W niniejszym protokole opisujemy szybkie tworzenie trójwymiarowych (3D) systemów hydrożelowych do produkcji mikrofabrykowanych kultur komórek i tkanek neuronalnych. Przedstawione tutaj podwójne konstrukty hydrożelowe stanowią wszechstronne modele in vitro, które mogą okazać się użyteczne w badaniach z zakresu neuronauki dotyczących przeżywalności komórek, ich migracji i/lub wzrostu oraz prowadzenia neurytów. Co więcej, ponieważ protokół ten można zastosować do wielu rodzajów hydrożeli i komórek, potencjalne zastosowania są różnorodne i szerokie.

Protokół

1. Konfiguracja DMD

  1. Płytka DMD, światłowód UV (z kolimatorem) oraz obiektyw 4x są zamontowane pionowo na stole wibroizolacyjnym.
  2. Światłowód UV należy ustawić tak, aby światło padało na macierz luster pod kątem 45° względem płaszczyzny luster oraz 24° poniżej płaszczyzny luster (Rysunek 1).
  3. Obiektyw jest zamontowany w taki sposób, aby odległość od DMD do obiektywu odpowiadała ogniskowej danej soczewki.
  4. Poniżej obiektywu umieszcza się mikroskop odwrócony, tak aby skupione światło odbite od DMD mogło być wizualizowane przez mikroskop. Odległość od obiektywu do powierzchni polimeryzacji powinna odpowiadać w przybliżeniu odległości roboczej soczewki. Stolik mikroskopu może być następnie wykorzystany do regulacji tej odległości w celu precyzyjnego ustawienia ostrości obrazu. Odległość ta może się różnić w zależności od wybranej powierzchni polimeryzacji.

2. Podwójne konstrukty hydrożelowe do hodowli eksplantów tkankowych

A. Adhezja eksplantów DRG

  1. Pokryć ścianki wkładów do hodowli komórkowych z powłoką kolagenową w 6 dołkach (Corning) preparatem Rain-X, uważając, aby nie pokryć samej membrany. (Alternatywnie można zastosować hydrofobowy pisak do tworzenia barier).
  2. Nawilżyć wkłady przez noc, stosując 1,5 mL medium adhezyjnego w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Medium adhezyjne to medium neurobasal z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,5mM L-glutaminy oraz 20 μg/mL NGF.
  3. Wyizolować embrionalne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) z zarodków szczura w 15. dniu rozwoju (E-15). Zwoje DRG należy wysiać na wkładach 6-dołkowych z powłoką kolagenową, maksymalnie po cztery zwoje na wkład.
  4. Inkubować wkłady przez 2 godziny, aby umożliwić adhezję DRG do membrany.

B. Fotopolimeryzacja z użyciem dynamicznej maski

Cyfrowe urządzenie mikrolustrzane (DMD) to matryca 1024 x 768 pojedynczych luster, podobna do tych stosowanych w telewizorach projekcyjnych, która selektywnie odbija światło w zależności od położenia luster. W naszych celach DMD jest wykorzystywane do naświetlania światłem ultrafioletowym (UV) fotousieciowalnych hydrożeli, co pozwala w prosty i szybki sposób tworzyć określone geometrie hydrożeli. Rysunek 1 przedstawia konfigurację DMD oraz drogę światła UV. Choć nasze DMD jest jednostką autonomiczną, urządzenie to może zostać również zintegrowane z wieloma istniejącymi mikroskopami.

  1. Usuń cały nadmiar cieczy z wkładu i dodaj do jego wnętrza 500 μL medium do polimeryzacji. Medium do polimeryzacji zawiera 10% PEG (MW 1000) oraz 0,5% Irgacure 2959 rozpuszczone w medium neurobasal uzupełnionym o 20 μg/mL NGF oraz 1% Pen/Strep.
  2. Umieść wkład pod urządzeniem DMD na szklanym podstawce potraktowanym preparatem Rain-X.
  3. Za pomocą dołączonego podstawowego programu GUI ALP-3 załaduj odpowiedni czarno-biały obraz, który będzie służył jako „fotomaska” na DMD. Na potrzeby naszych badań wybrano kształt rozwidlający, aby umożliwić zastosowanie systemów kierowania wypustkami neurytów.
  4. Używając mikroskopu odwróconego do wizualizacji, wyrównaj eksplanty tkankowe z odpowiednim miejscem na fotomasce, wykorzystując źródło światła widzialnego odbitego od DMD.
  5. Zamień źródło światła widzialnego na źródło światła UV i naświetlaj roztwór PEG do momentu uzyskania wystarczającego stopnia sieciowania. (Dla podanych warunków i natężenia 5,0 Watts/cm2 padającego na DMD, sieciowanie może zostać ukończone w czasie tak krótkim jak 55 sekund). Powtórz procedurę dla wszystkich czterech DRG na wkładzie.
  6. Przepłucz każdy wkład trzy razy sterylnym DPBS z 1% Pen-Strep.
  7. Dodaj 1,5 mL medium wzrostowego pod wkłady do hodowli komórkowych i pozostaw do wyrównania w inkubatorze na 30 minut. Medium wzrostowe to medium neurobasal zawierające 2% B-27, 1% Pen/Strep, 0,5 mM L-glutaminy oraz 20 μg/mL NGF.

C. Wtórny hydrożel

Puramatrix

  1. W zastosowaniach neuronalnych 1% Puramatrix rozcieńcza się zgodnie z instrukcjami producenta do stężenia 0,15% w sterylnym H2O i uzupełnia o rozpuszczalną lamininę w stężeniu 1 μg/mL.
  2. Wszelkie nadmiary pożywki należy usunąć z pustych przestrzeni PEG zawierających eksplanty DRG, używając sterylnego aplikatora z patyczkiem bawełnianym, chusteczki Kimwipe lub mikropipety.
  3. Do pustych przestrzeni PEG za pomocą mikropipety dodaje się Puramatrix, aby wypełnić wolną przestrzeń bez doprowadzenia do przelania. W zależności od objętości pustej przestrzeni, na jeden konstrukt zużywa się zazwyczaj ~ 1 μL.
  4. Proces samoorganizacji Puramatrix rozpoczyna się natychmiast po kontakcie z fizjologicznym roztworem soli, tzn. napęczniałym PEG, jednak pod insert dodaje się 1,5 mL pożywki wzrostowej i umieszcza go w inkubatorze na jedną godzinę, aby zapewnić całkowitą żelowanie.
  5. Początkowo Puramatrix ma lekko kwasowy odczyn, dlatego po godzinie należy wymienić pożywkę, aby umożliwić wyrównanie pH.
  6. Wymiana pożywki jest wymagana mniej więcej co 48 godzin. Należy dbać o to, aby całą pożywkę dodawać pod insert, aby chronić integralność mechanicznie słabego Puramatrix.

Agaroza

  1. W zastosowaniach neuronalnych agarozę rozcieńcza się do stężenia 1% w pożywce wzrostowej i umieszcza w kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy (~1 godz.). Następnie do roztworu dodaje się rozpuszczalną lamininę w stężeniu 1 μg/mL.
  2. Należy usunąć całą nadmiarową pożywkę z pustych przestrzeni PEG.
  3. Do pustych przestrzeni PEG dodaje się agarozę, aby wypełnić wolną przestrzeń, nie dopuszczając do przelania. W zależności od objętości pustej przestrzeni, zazwyczaj stosuje się ~ 1 μL na konstrukt.
  4. W płytce 6-dołkowej schładza się wstępnie 1,5 mL pożywki wzrostowej (8 °C), a następnie wkłady zawierające agarozę przenosi się do schłodzonej pożywki i przechowuje w lodówce w temperaturze 8 °C przez co najmniej trzy minuty, aby umożliwić żelowanie agarozy.
  5. Na koniec wkłady przenosi się do 1,5 mL wstępnie ogrzanej pożywki wzrostowej (37 °C) i inkubuje w temperaturze 37 °C, wymieniając pożywkę co 48 godzin.

3. Podwójna enkapsulacja komórek 3D w hydrożelu

Podwójna enkapsulacja w hydrożelu jest odpowiednia przy użyciu dowolnego żelu samowyciszającego. Żel fotousieciowalny, w tym przypadku PEG, służy jako wsparcie strukturalne dla geometrycznej prezentacji żelu samowyciszającego, na przykład Puramatrix lub agarozy. Niektóre z metod, a w szczególności rodzaj żelu i wybór fotomaski, będą zależeć od konkretnego zamierzonego zastosowania.

  1. Wgraj odpowiednią maskę do DMD. W naszym zastosowaniu, jakim jest przeżywalność komórek, wybraliśmy prostą cylindryczną prezentację Puramatrix, aby ułatwić obrazowanie komórek. Badacze zajmujący się sygnalizacją komórkową mogą być zainteresowani geometrią przedziałową, aby umożliwić dyfuzję cząsteczek chemotaktycznych. Ponadto pokazano przybliżony model tętnicy, aby przedstawić możliwe zastosowanie w badaniach nad naczyniami krwionośnymi.
  2. Potraktuj ścianki poliestrowego insertu do hodowli komórkowej preparatem Rain-X i umieść go pod DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.
  3. Dodaj do insertu 500 μL medium do polimeryzacji. Wywołaj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV przez 55 sekund.
  4. Przemyj trzy razy sterylnym DPBS oraz 1% Pen-Strep.
  5. Usuń całe nadmiarowe medium z pustych przestrzeni PEG.
  6. Odwirowuj komórki przy pożądanej gęstości do postaci pelletu. Należy zadbać o usunięcie całego medium z pelletu komórkowego przed mieszaniem, ponieważ Puramatrix rozpoczyna samoorganizację natychmiast po kontakcie z roztworem soli. Zawieś komórki w 0,15% Puramatrix rozcieńczonym w sterylnym H2O z dodatkiem 10% sacharozy.
  7. Wstrzyknij mieszaninę Puramatrix/komórki/sacharoza do pustych przestrzeni w PEG.
  8. Dodaj 1,5 mL medium wzrostowego pod insert i pozostaw do żelowania w inkubatorze przez jedną godzinę.
  9. Wymień medium po jednej godzinie, a następnie mniej więcej co 48 godzin.

4. Pojedyncza inkapsulacja komórek 3D w hydrożelu

Pojedyncza enkapsulacja w hydrożelu byłaby odpowiednia w każdej sytuacji, w której komórki mogą być badane wewnątrz fotousieciowalnego hydrożelu.

  1. Wczytaj odpowiednią maskę do urządzenia DMD. W badaniach nad przeżywalnością komórek ponownie wybrano podstawową maskę okrągłą reprezentującą cylinder. W zależności od dziedziny badań można ponownie zastosować maski podobne do tych przedstawionych w metodzie 4.
  2. Potraktuj poliestrowy insert do hodowli komórkowej preparatem Rain-X, a następnie umieść go pod urządzeniem DMD na szkiełku pokrytym Rain-X.
  3. Komórki w dowolnym pożądanym stężeniu można dodać bezpośrednio do 10% roztworu PEG, dokładnie mieszając w celu zapewnienia homogennego rozkładu.
  4. Dodaj 500 μL medium polimeryzacyjnego do insertu. Indukuj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV przez 55 sekund.
  5. Przemyj trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep.
  6. Wypełnij medium wzrostowym przestrzeń zarówno pod insertem, jak i nad nim, wymieniając medium mniej więcej co 2 dni.

5. Polimeryzacja cienkowarstwowego hydrożelu

  1. Wczytaj odpowiednią maskę na DMD.
  2. Potraktuj wkładkę do hodowli komórkowej z poliestru powleczonej kolagenem preparatem Rain-X, a następnie umieść ją na szkiełku powleczonym Rain-X.
  3. Dodaj wystarczającą ilość medium polimeryzacyjnego, aby zakryć dno wkładki (~250-300 μL dla wkładek do płytek 6-dołkowych). Pozostaw medium, aby przeniknęło przez membranę wkładki przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Usuń nadmiar medium polimeryzacyjnego z wkładki za pomocą mikropipety lub chusteczki Kimwipe. Dodaj wystarczającą ilość oleju przezroczystego dla UV, aby całkowicie zakryć dno wkładki. Pozostaw wkładkę na 15-30 minut w temperaturze pokojowej, aby olej utworzył wyraźną warstwę nad medium polimeryzacyjnym nasycającym membranę wkładki.
  5. Umieść wkładkę i szkiełko pod DMD. Wywołaj sieciowanie PEG poprzez naświetlanie światłem UV. Ze względu na cienką warstwę PEG, sieciowanie może zostać zakończone w czasie nawet 15 sekund przy natężeniu 5.0 Watts/cm2 padającym na DMD.
  6. Przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep. (Jeśli problemem jest utrzymywanie się tłustych osadów, do buforu do płukania można dodać łagodny detergent, taki jak Tween 20 (1%).)
  7. Przechowuj wkładkę w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Dodaj medium wzrostowe do zawiesiny komórek w pożądanym stężeniu, a następnie pipetuj wystarczającą objętość zawiesiny komórek do wkładki do hodowli komórkowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Następnie dodaj pod wkładkę wystarczającą ilość medium wzrostowego, aby w pełni utrzymać żywotność komórek (~1.5 mL).
  8. Po upływie 48 godzin przemyj wkładkę trzy razy sterylnym DPBS z dodatkiem 1% Pen-Strep, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone komórki. Wymieniaj medium mniej więcej co 48 godzin.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady podwójnych konstrukcji hydrożelowych zawierających eksplanty zzęsłów korzeni grzbietowych (DRG) przedstawiono na rysunku 2. Zauważmy, że migracja komórek i wydłużanie neurytów są ograniczone do obszaru konstrukcji podwójnego hydrożelu dopuszczającego obecność komórek. Rysunek 3 przedstawia zdysocjowane komórki enkapsulowane w podobny sposób wewnątrz podwójnych konstrukcji hydrożelowych. Ze względu na dynamiczny charakter maski fotolitograficznej DMD, geometria dostępna do enkapsulacji jest ograniczona jedynie wymiarami i rozdzielczością optyki. Enkapsulacja komórek była możliwa również wewnątrz pojedynczego fotopolimeryzowalnego hydrożelu, PEG, a test żywotności (live/dead) został przeprowadzony, co wykazano na rysunku 4. Enkapsulacja w PEG służy jedynie jako przykład, ponieważ PEG nie stanowi idealnego środowiska dla komórek neuronalnych. W związku z tym żywotność komórek uzyskana w naszych konstrukcjach z PEG jest zrozumiałe niska. Na koniec, na rysunku 5 przedstawiono przykłady wykorzystania cienkich filmów PEG jako wzorowanej warstwy ograniczającej adhezję komórek na wkładkach do hodowli komórkowej. Ponadto na rysunku 6 zaprezentowano przykłady możliwych „nieprawidłowych” wyników.

Wyniki te stanowią jedynie niewielką część możliwych zastosowań metod opracowanych w naszym laboratorium. Mają one na celu zademonstrowanie łatwości, wszechstronności i wykonalności naszego podejścia i mogą zostać potraktowane jako „dowód koncepcji” dla badaczy chcących opracować własne adaptacje.

Schemat układu fotopolimeryzacji UV z DMD, obiektywem i rzutowaną fotomaską.
Rysunek 1. Schematyczny rysunek drogi światła wykorzystywanej w fotolitografii. Wstawka: Światło UV oświetla DMD pod kątem 45°, 24° poniżej płaszczyzny macierzy luster.

Wyniki urządzenia mikrofluidycznego; migracja komórek; mikroskopia fluorescencyjna; wiele kanałów; analiza biologiczna.
Rycina 2. Oznakowany wzrost i proliferacja w konstrukcjach z podwójnego hydrożelu zawierających zwoje korzeni grzbietowych (DRG). A-D) Obrazy przedstawiające spolimeryzowane konstrukcje z PEG (szare) z neurytami oznakowanymi Beta III tubuliną (zielone) oraz jądrami komórkowymi barwionymi DAPI (niebieskie). Eksplanty DRG znajdują się w Puramatrix i są rozmieszczone w okrągłych obszarach wzoru, a neuryty rosną w kierunku rozgałęzienia (rozgałęzień).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające mikrowzorowane hydrożele o różnych kształtach.
Rysunek 3. Podwójne konstrukty hydrożelowe zawierające komórki znakowane calceiną AM, markerem żywych komórek, po 48 godzinach w pożywce wzrostowej. A-D) Różne kształty PEG, wypełnione Puramatrix zawierającym zdysocjowane neurony DRG (~5x103 komórek/mL).

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej, komponenty komórkowe, skala 200 µm, obrazowanie biologiczne, analiza komórkowa.
Rycina 4. Pojedyncza konstrukcja hydrożelowa zawierająca żywe komórki znakowane Calcein AM (zielony) oraz martwe komórki znakowane etydinium homodimerem-1 (czerwony) po 24 godzinach w pożywce wzrostowej (5x103 cells/mL).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej porównujące strukturę i rozmieszczenie komórek; powiększenie A) 500μm, B) 100μm.
Rycina 5. Restrykcyjny dla komórek PEG spolimeryzowany w postaci cienkiej warstwy z użyciem „wzorca testowego”, aby selektywnie przytwierdzić dysocjowane komórki do pokrytej kolagenem membrany w podkładkach przepuszczalnych. A, B) Żywe komórki zostały znakowane po 48 godzinach Calcein AM (zielony), natomiast martwe komórki znakowano etydium homodimerem-1 (czerwony). Minimalna adhezja komórek występuje w obszarze zawierającym cienką warstwę PEG.

Rozgałęziona struktura mikrofluidyczna; mikroskopia optyczna z markerami fluorescencyjnymi do analizy przepływu.
Rysunek 6. Reprezentatywne obrazy niepożądanych wyników. A) Częściowa polimeryzacja PEG, prowadząca do powstania nieużytecznej konstrukcji z PEG. Nieprawidłowa polimeryzacja może wystąpić z powodu obecności menisku w medium pre-polimerowym, niewystarczającej ilości medium polimeryzacyjnego, niewystarczającej ekspozycji na UV lub niewłaściwego ustawienia ostrości optyki. B) Obraz przedstawiający spolimeryzowane konstrukcje z PEG (szary) z neurytami znakowanymi Beta III tubuliną (zielony) oraz jądrami komórkowymi barwionymi DAPI (niebieski). Neuryty były w stanie rosnąć poza wzorcowanymi kanałami z PEG. Często dzieje się tak w sytuacji, gdy Puramatrix przelewa się na górną część PEG podczas wtryskiwania.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda może być wykorzystana przez każdego badacza poszukującego prostych i powtarzalnych systemów hodowli komórkowych. Teoretycznie, dzięki szerokiej gamie dostępnych fotopolimeryzowalnych hydrożeli, środowisko można dostosować do każdego typu komórek, w tym do całych eksplantów tkankowych. Dodatkowo, podwójny system hydrożeli pozwala na lepszą kontrolę przestrzenną w prezentacji hydrożeli samopolimeryzujących, które mają tendencję do przyjmowania amorficznych kształtów. Powstałe „2,5D” mikrostrukturalne konstrukty hydrożelowe zapewniają macierz 3D dla wzrostu neuronów w konfiguracji 2D, co umożliwia wygodną ocenę mikroskopową. Można również zmieniać podłoże, na którym polimeryzowane są żele, co pozwala na większą kontrolę w projektowaniu eksperymentów. Nasze metody są zoptymalizowane pod kątem zastosowania z przepuszczalnymi podłożami do hodowli komórkowych, ponieważ zaobserwowaliśmy poprawę przeżywalności (Rysunek 4) w porównaniu z polimeryzacją na szkiełkach przedmiotowych (dane niepokazane). Jednak inne powierzchnie polimeryzacji mogą być bardziej odpowiednie dla różnych zastosowań, na przykład do wytwarzania na szkiełkach przedmiotowych wykorzystywanych w eksperymentach mikroprzepływowych lub do formowania agregatów komórkowych.

Nasze doświadczenia z tymi systemami hodowli pozwoliły na zidentyfikowanie potencjalnych obszarów problematycznych. Po pierwsze, wymagane są staranne techniki w celu zachowania sterylności konstruktów. Ze względu na masywną budowę zestawu DMD, trudno jest przeprowadzać etapy polimeryzacji w warunkach sterylnych. Aby zapobiec temu problemowi, pomocny jest opisany w metodach etap płukania, a we wszystkich pożywkach należy stosować antybiotyki. Dodatkowo, końcowa grubość i kształt spolimeryzowanego konstruktu są w dużym stopniu zależne od właściwości płynnych mieszaniny prepolimeru, a obecność menisku może prowadzić do powstania konstruktów żelowych, które są zbyt cienkie lub niecałkowicie spolimeryzowane (Rysunek 6). Można podjąć dwa kroki w celu zminimalizowania tworzenia się menisku wewnątrz insertów do hodowli komórkowych. W przypadku grubych hydrożeli (>200 μm) wystarczająca jest prosta powłoka z Rain-X na wewnętrznej ściance insertu. Jednakże, jak krótko opisano powyżej, dla cienkich konstruktów (<200 μm) wymagana jest warstwa oleju, aby zarówno zminimalizować menisk, jak i zapobiec wygaszaniu polimeryzacji wolnorodnikowej przez tlen. Stwierdzono, że rozdzielczość zależy od grubości, przy czym rozmiar detali zmniejszał się wraz ze zwiększaniem grubości żelu. Rozdzielczość różniła się również w zależności od tego, czy detal stanowił wypukłość czy wklęsłość w hydrożelu. Niemniej jednak, osiągnęliśmy wystarczającą rozdzielczość dla konstruktów z minimalnymi rozmiarami detali rzędu ~100 μm, używając wyłącznie obiektywów mikroskopowych jako optyki skupiającej.

Nasze eksperymenty wykazały, że opisane tutaj podwójne konstrukty hydrożelowe stanowią doskonałą podstawę do tworzenia podstawowych modeli in-vitro wzrostu i prowadzenia neurytów. Zastosowana technika mikrowzorowania jest adaptacją istniejących metod18,19, jednak nasz układ kładzie nacisk na prosty w implementacji projekt i został zoptymalizowany pod kątem produkcji podwójnych konstruktów hydrożelowych na insertach do hodowli komórkowych; inserty te były kluczowe dla poprawy żywotności komórek, a także dla sieciowania wokół wcześniej przytwierdzonych eksplantów tkankowych. Zakres przedstawionych wyników jest ograniczony obszarami zainteresowań naszego laboratorium; wierzymy jednak, że metody opisane w niniejszej publikacji okażą się przydatne dla badaczy poszukujących stosunkowo taniej, szybkiej i łatwej w użyciu metody wytwarzania trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować laboratorium prof. Anthony’ego Windebanka za podzielenie się wiedzą specjalistyczną w zakresie dysekcji i hodowli zwojów korzeni grzbietowych (DRG), a także prof. Shaochena Chena za pomocne dyskusje dotyczące konfiguracji DMD. Badania te były częściowo finansowane przez Tulane University oraz z grantów Louisiana Board of Regents (LEQSF[2009-10]-RD-A-18) i NIH (NS065374).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
cyfrowe urządzenie mikrolustrzane (DMD)Texas InstrumentsDLPD4X00KIT
przepuszczalne podłoże Transwell powlekane kolagenemCorning3491W manuskrypcie określany również jako wkład do hodowli komórkowych
przepuszczalne podłoże Transwell poliestroweCorning3412W manuskrypcie określany również jako wkład do hodowli komórkowych
pożywka NeurobasalInvitrogen21103-049
płodowa surowica bydlęca (FBS)Invitrogen16000-036
L-glutaminaInvitrogen25030-164
czynnik wzrostu nerwów (NGF)Invitrogen13257-019
Pen/StrepInvitrogen15140-122
suplement B-27Invitrogen17504-044
DPBSInvitrogen14190-250
PuramatrixBD Biosciences354250
PEG 1000Polysciences, Inc.15178
Irgacure 2959Ciba Specialty Chemicals0298913AB
olejstosowano zarówno olej rzepakowy, jak i olej silikonowymusi być przezroczysty dla promieni UV i minimalizować powstawanie menisku
OmniCure Series 1000EXFO
Rain-X

Bibliografia

  1. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, 870-872 (2003).
  2. Schindler, M. Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine. Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).
  3. Maltman, D. J., Przyborski, S. A. Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses. Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).
  4. Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).
  5. Irons, H. R. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).
  6. Bursac, N. Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties. Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  8. Cushing, M. C., Anseth, K. S. Materials science. Hydrogel cell cultures. Science. 316, 1133-1134 (2007).
  9. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties. Science. 324, 59-63 (2009).
  10. Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics. Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).
  11. Luo, Y., Shoichet, M. S. A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration. Nature Materials. 3, 249-253 (2004).
  12. Wylie, R. G., Shoichet, M. S. Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel. Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).
  13. Ji, Y. Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds. Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).
  14. Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. A microwell array system for stem cell culture. Biomaterials. 29, 752-763 (2008).
  15. Xu, T. Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method. Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).
  16. Liu Tsang, V. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21, 790-801 (2007).
  17. Beebe, D. J. Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).
  18. Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).
  19. Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays. Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cyfrowe urz dzenie mikrolustrzanehydro ele z glikolu polietylenowegopodw jne konstrukty hydro eloweembrionalne zwoje korzeni grzbietowychanaliza wzrostu neuryt wpolimeryzacja inicjowana promieniami UVfotopatterning ograniczaj cy wzrost kom rek
Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.