Western blotting z wykorzystaniem żeli Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Podsumowanie

Niniejszy artykuł techniczny opisuje standardową procedurę western-blottingu z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego systemu elektroforezy Mini-Gel NuPAGE firmy Invitrogen.

Streszczenie

Western blotting (lub immunoblotting) to standardowa procedura laboratoryjna umożliwiająca badaczom weryfikację ekspresji białka, określenie względnej ilości białka obecnego w różnych próbkach oraz analizę wyników eksperymentów ko-immunoprecypitacji. W tej metodzie białko docelowe jest wykrywane za pomocą specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego w danej próbce homogenatu lub ekstraktu tkankowego. Rozdział białek według masy cząsteczkowej osiąga się przy użyciu denaturującego SDS-PAGE. Po transferze na membranę białko docelowe jest znakowane specyficznym przeciwciałem pierwszorzędowym i wykrywane metodą chemiluminescencji.

Od czasu swojego pierwszego opisu technika western-blotting przeszła szereg ulepszeń, w tym wprowadzenie gotowych żeli oraz intuicyjnego sprzętu. W naszym laboratorium zdecydowaliśmy się na użycie dostępnego komercyjnie systemu elektroforezy NuPAGE firmy Invitrogen. Jest to innowacyjny system gotowych mini-żeli do nieciągłej elektroforezy SDS-PAGE o neutralnym pH. System ten oferuje kilka zalet w stosunku do tradycyjnej metody Laemmli, w tym: i) dłuższą trwałość gotowych żeli, wynoszącą od 8 miesięcy do 1 roku; ii) szeroki zakres rozdzielczości mas cząsteczkowych od 1 do 400 kDa, zależnie od zastosowanego rodzaju żelu; oraz iii) większą wszechstronność (zakres stężenia akryloamidu, rodzaj żelu oraz skład jonowy buforu do elektroforezy).

Procedura opisana w niniejszym artykule wideo wykorzystuje nieciągły system buforowy Bis-Tris z żelami gradientowymi Bis-Tris 4-12% i buforem do elektroforezy MES, stanowiąc ilustrację sposobu przeprowadzania analizy western-blot z użyciem systemu elektroforezy Invitrogen NuPAGE. W naszym laboratorium uzyskaliśmy dobre i powtarzalne wyniki dla różnych zastosowań biochemicznych, stosując tę metodę western-blottingu.

Protokół

Elektroforeza żelowa

Uwaga techniczna: Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować próbki białek.

W tym pierwszym kroku białka w próbce są rozdzielane zgodnie z ich masą cząsteczkową przy użyciu denaturującej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE). Bufor do próbek NuPAGE® LDS zawierający dodecylosiarczan litu (LDS) utrzymuje polipeptydy w stanie zdenaturowanym po podgrzaniu próbki białka w temperaturze 70°C przez 10 minut. Równocześnie stosuje się silny środek redukujący w celu usunięcia struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej (DTT, aby rozerwać mostki dwusiarczkowe). Ponadto białka w próbce zostają pokryte ujemnie naładowanym LDS, przez co przemieszczają się przez siatkę akrylamidu w żelu w kierunku dodatnio naładowanej elektrody. Pozwala to na ich rozdzielenie zgodnie z masą cząsteczkową (mierzoną w kilodaltonach, kDa).

Szczegółowe protokoły krok po kroku dotyczące przygotowania próbek oraz procedury PAGE można znaleźć na stronie internetowej firmy Invitrogen² lub w przewodniku technicznym NuPAGE³.

Wskazówki techniczne

1. W systemie buforowym do elektroforezy nieciągłej Invitrogen NuPAGE Bis-Tris mobilność elektroforetyczna białek oraz wynikający z niej zakres rozdziału żelu zależą od dwóch czynników: i) stężenia akrylamidu w żelu (wyższe stężenie akrylamidu zapewnia lepszą rozdzielczość białek o niższej masie cząsteczkowej) oraz ii) jonu towarzyszącego w buforze do prowadzenia elektroforezy, MOPS lub MES. Aby dobrać odpowiednią kombinację dla pożądanego zakresu rozdziału, należy skorzystać z tabeli migracji żelu¹. Grubość żelu oraz liczba studzienek zależą odpowiednio od objętości i liczby próbek przeznaczonych do nałożenia.
2. Podczas nakładania próbek do studzienek żelu co najmniej jedna ścieżka jest zarezerwowana dla markera masy cząsteczkowej (drabinki). Standardy białkowe te są dostępne w sprzedaży u kilku producentów i zazwyczaj składają się z mieszaniny barwionych białek o określonych masach cząsteczkowych, które tworzą widoczne prążki umożliwiające monitorowanie postępu migracji. Należy wybrać zakres mas cząsteczkowych dostosowany do rozdzielczości żelu.
3. W celu uzyskania ładnego i równomiernego wzoru migracji zaleca się wypełnienie WSZYSTKICH studzienek żelu podobną objętością próbki lub 1X buforu do próbek LDS.

Przenieś

Uwaga techniczna: Przed rozpoczęciem etapu transferu należy przygotować bufor do transferu (1X z 10% metanolu) i schłodzić go do 4°C w pomieszczeniu chłodniczym.

Aby umożliwić wykrywanie białek za pomocą przeciwciał, są one przenoszone metodą elektroblottingu z żelu na membranę nitrocelulozową. Wiązanie białek opiera się na oddziaływaniach hydrofobowych, a także na oddziaływaniach elektrostatycznych między membraną a białkiem.

(Jako alternatywę można zastosować membranę z polifluorku winylidenu (PVDF). W takim przypadku membranę PVDF należy uprzednio zwilżyć w metanolu przez co najmniej 30 sekund przed użyciem.)

Szczegółowy protokół procedury transferu krok po kroku można znaleźć w odniesieniu 4 w przypadku korzystania z komory do transferu elektroforetycznego Bio-Rad Mini Trans-Blot lub w odniesieniach 2-3, jeśli laboratorium jest wyposażone w moduł do transferu Invitrogen XCell II™ Blot Module.

W wyniku tego procesu białka zostają wyeksponowane na cienkiej warstwie powierzchniowej i są gotowe do detekcji. Jednorodność oraz ogólną skuteczność transferu białka z żelu na membranę można sprawdzić za pomocą odwracalnego barwienia membrany barwnikiem Ponceau S.

Procedura barwienia Ponceau S (opcjonalnie):

1. Po transferze białek umieść membranę w kuwecie do inkubacji (białka skierowane do góry).
2. Dodaj wystarczającą ilość barwnika Ponceau S, aby pokryć membranę, i inkubuj przez co najmniej 30 sekund przy łagodnym wytrząsaniu.
3. Płucz membranę wodą destylowaną, aż tło będzie przejrzyste.
4. Odbarw membranę pod bieżącą wodą destylowaną przez 2-3 minuty.
5. Umieść membranę w roztworze blokującym (patrz poniżej).

Wskazówki techniczne:

1. Zalecamy opisanie membrany ołówkiem przed transferem białek, aby zaznaczyć stronę, na której znajdowały się białka, oraz orientację próbek.
2. Zarówno barwienie Ponceau S, jak i markery masy cząsteczkowej mogą posłużyć do wycięcia membrany po transferze w celu inkubacji poszczególnych fragmentów z różnymi przeciwciałami.

Immunodetekcja:

Uwaga techniczna: Niniejsza procedura immunodetekcji ma charakter wyłącznie wytycznych. Optymalizacja może być wymagana dla każdego przeciwciała; szczegółowe informacje można znaleźć w większości kart charakterystyki przeciwciał dostępnych w sprzedaży (np. rozcieńczenie robocze, czas inkubacji itp.).

Podczas tego ostatniego etapu białko docelowe zostanie wykryte za pomocą specyficznego przeciwciała i pojawi się jako prążek na kliszy. Położenie prążka zależy od masy cząsteczkowej białka docelowego, natomiast intensywność prążka zależy od ilości obecnego białka docelowego.

Zazwyczaj osiąga się to po trzech podetapach:

1. Blokowanie: Aby uniknąć niespecyficznych oddziaływań przeciwciała z membraną (wolna przestrzeń na membranie jest pokrywana rozcieńczonym roztworem białka ogólnego).
2. Sondowanie: Białko docelowe jest wykrywane za pomocą specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego, membranę poddaje się działaniu innego przeciwciała sprzężonego z enzymem reporterowym, peroksydazą chrzanową (HRP). To przeciwciało wtórne jest skierowane przeciwko specyficznej dla gatunku części przeciwciała pierwszorzędowego (np. przeciwciało wtórne anty-królicze zwiąże się z każdym przeciwciałem pierwszorzędowym pochodzącym od królika).
3. Detekcja: Jako substrat stosuje się czynnik chemiluminescencyjny, który emituje światło w kontakcie z HRP znajdującym się na przeciwciele wtórnym. Reakcja ta powoduje emisję luminescencji w miejscu i w proporcji do ilości sondowanego białka. Światło jest następnie rejestrowane na kliszy fotograficznej.

Poniżej przedstawiono ogólną procedurę krok po kroku. Inne szczegółowe procedury można znaleźć w instrukcji obsługi odczynników do detekcji ECL Plus Western Blotting⁵ lub w większości kart charakterystyki dołączonych do dostępnych komercyjnie przeciwciał. Czas inkubacji, rozcieńczenie przeciwciał oraz roztwory blokujące i płuczące muszą zostać zoptymalizowane empirycznie dla każdego przeciwciała.

Procedura immunodetekcji:

1. Zablokuj niespecyficzne wiązania, inkubując membranę w objętości roztworu blokującego PBS z 1% kazeiną wystarczającej do całkowitego przykrycia całej membrany. Umieść na shakerze na co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.
2. Inkubuj membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym (specyficznym dla badanego białka). Przeciwciało pierwszorzędowe powinno być rozcieńczone w roztworze blokującym. W przypadku większości przeciwciał pełne wiązanie jest osiągane po 1-2 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu. Alternatywnie, etap inkubacji można przeprowadzić przez noc w 4°C, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
3. Usuń roztwór (odrzuć lub przechowuj w temperaturze od 4°C do -20°C do ponownego użycia) i szybko przemyj membranę raz. Następnie przemywaj 3 razy po 10 minut roztworem PBS z 0,05% Tween 20 (PBST) w temperaturze pokojowej przy intensywnym wstrząsaniu.
4. Inkubuj membranę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP, rozcieńczonym w roztworze blokującym. Wybierz przeciwciało rozpoznające część IgG gatunku, w którym wytworzono przeciwciało pierwszorzędowe. Inkubację przeprowadza się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu.
5. Odrzuć roztwór i szybko przemyj membranę raz. Następnie przemywaj 3 razy po 10 minut roztworem PBST w temperaturze pokojowej przy intensywnym wstrząsaniu.
6. Przejdź do detekcji chemiluminescencyjnej zgodnie z instrukcją producenta. Używamy odczynników do detekcji Western Blotting ECL Plus firmy GE Healthcare (szczegółowe instrukcje znajdują się w referencji 5).
7. Umieść membranę w folii spożywczej lub woreczku, a następnie włóż do kasety autoradiograficznej. Pamiętaj o odlaniu nadmiaru płynu i usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza.
8. Naświetl film fotograficzny membraną w ciemni. Zacznij od 1 minuty czasu ekspozycji i dostosuj go do pożądanej intensywności sygnału.

Wskazówki techniczne:

1. Blokowanie nieswoistego wiązania osiąga się poprzez umieszczenie membrany w rozcieńczonym roztworze białka. Zazwyczaj stosujemy 1% kazeinę, ale alternatywnie można użyć albuminy surowicy wołowej (~2% BSA) lub odtłuszczonego mleka w proszku (~5%).
2. W całej procedurze zamiast PBS można stosować bufor solno-fosforanowy z Trisem (TBS). Zalecamy stosowanie TBS, jeśli planują Państwo analizę membrany z użyciem przeciwciał fosfoswoistych.
3. Użycie naklejki fluorescencyjnej (np. Stratagene’s Glogos® II Autorad Markers) przyklejonej do dna kasety do autoradiografii pomoże w wyrównaniu filmu i membrany podczas etapu analizy.

Analiza

Po naświetleniu filmu zauważysz, że w praktyce nie wszystkie analizy Western blot wykazują białko w formie jednego, wyraźnego prążka. Mogą pojawić się dodatkowe prążki wynikające z niespecyficznego wiązania zarówno przeciwciał pierwszorzędowych, jak i drugorzędowych. Sygnał tła można zredukować poprzez optymalizację procedury immunodetekcji. Ponadto odpowiednia kontrola (np. komórki nietransfekowane, komórki traktowane siRNA itp.) będzie pomocna w określeniu swoistości przeciwciała oraz dokładnej lokalizacji białka docelowego na membranie.

Po zaznaczeniu na folii pozycji zabarwionych prążków standardu białek z membrany, należy wykreślić logarytm masy cząsteczkowej standardów białek (oś y) w funkcji ich odpowiadającej relatywnej mobilności (oś x). Relatywna mobilność (Rf) to termin określający stosunek odległości, o jaką białko przemieściło się od punktu startowego (góra żelu), do odległości przebytej przez barwnik śledzący lub marker o niskiej masie cząsteczkowej (front żelu). Wyznacza się linię regresji krzywej wzorcowej, aby otrzymać wartości nachylenia i punktu przecięcia z osią y. Nieznaną masę cząsteczkową (wielkość) białka docelowego szacuje się, korzystając z jego Rf oraz następującego zmodyfikowanego równania:

log masy cząsteczkowej = (nachylenie)(mobilność lub Rf białka docelowego) + wyraz wolny

(szczegółowe instrukcje znajdują się w referencji 6).

Przybliżone poziomy ekspresji wyznacza się poprzez porównanie intensywności prążka białka docelowego z intensywnością prążka białka strukturalnego (np. tubuliny lub aktyny) lub produktu genu konstytutywnego, takiego jak GAPDH. Tak zwana „kontrola załadunku” nie powinna ulegać zmianom pomiędzy próbkami i jest wykrywana przy użyciu specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego. Obraz może zostać poddany dalszej analizie densytometrycznej w celu oceny względnej ilości zabarwionego białka i kwantyfikacji wyników w formie gęstości optycznej.

Dyskusja

Procedura przedstawiona w niniejszym materiale wykorzystuje żel Bis-Tris z buforem do elektroforezy MES jako przykład denaturującej elektroforezy w żelach poliakrylamidowych (PAGE) z użyciem systemu elektroforetycznego Invitrogen NuPAGE Novex. Ponadto ten system gotowych żeli pozwala na rozdzielanie białek w warunkach denaturujących lub niedenaturujących, a także obsługuje szeroki zakres mas cząsteczkowych (od 1-200 kDa dla żeli Bis-Tris do 36-400 kDa dla żeli Tris-Acetate). W zależności od celu eksperymentu można zdecyd...