Drosophila melanogaster jądra można szybko i efektywnie wyizolować z dorosłych samców za pomocą igieł sekcyjnych. Dzięki praktyce w ciągu jednego lub dwóch dni można bez trudności wyizolować ilość jąder wystarczającą do analizy DNA lub RNA za pomocą sekwencjonowania wysokoprzepustowego lub bardziej tradycyjnych metod biologii molekularnej, a także białek do testów opartych na przeciwciałach lub enzymach.
Artykuł metodologiczny
Izolacja jąder Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jądra Drosophila melanogaster stanowią istotny model do badania utrzymania i różnicowania komórek macierzystych, mejozy oraz interakcji między somą a linią zarodkową. Jądra są zazwyczaj izolowane od dorosłych samców od 0 do 3 dni po wyjściu z poczwarki. Jądra much dzikiego typu można łatwo odróżnić od innych tkanek ze względu na ich żółty kolor, natomiast jądra much mutantów white, będących częstym tłem genetycznym w eksperymentach laboratoryjnych, są podobne kształtem i kolorem do jelit muchy. Przeprowadzenie sekcji na szklanym szkiełku przedmiotowym z czarnym tłem znacznie ułatwia identyfikację jąder. Jądra są usuwane z much za pomocą igieł sekcyjnych. W porównaniu z protokołami wykorzystującymi pęsety do sekcji jąder, nasza metoda jest znacznie szybsza, co pozwala wprawnej osobie na wypreparowanie jąder z 200-300 much dzikiego typu na godzinę, co daje 400-600 jąder. Jądra z much white lub z mutantów o zmniejszonym rozmiarze jąder są trudniejsze do wypreparowania i zazwyczaj pozwalają na uzyskanie 200-400 jąder na godzinę.
Protokół
- Przygotuj szklany preparat mikroskopowy z czarnym tłem: Dotnij biały papier 20# do rozmiaru preparatu mikroskopowego. Pokoloruj jedną stronę papieru na czarno za pomocą markera permanentnego (np. Sharpie). Na czarną stronę nałóż biały klej (Elmer's) i przyklej papier do preparatu. Preparat można wykorzystać ponownie. Używając taśmy etykietowej ¾" (Fisherbrand), przymocuj preparat mikroskopowy stroną szklaną do góry do podkładki CO2 do muszek, aby go ustabilizować.
- Zbierz samce muszek w wieku 0-3 dni.
- Przygotuj wiadro z lodem, roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) oraz igły sekcyjne.
- Znieczul 50-100 muszek strumieniem CO2 i przenieś je z butelki lub fiolki na podkładkę do muszek obok preparatu mikroskopowego.
- Nanieś pipetą ~50 μl lodowatego PBS w postaci kropli na środek preparatu mikroskopowego.
- Ostrożnie chwyć samca muszki za pomocą igły sekcyjnej — zanurz igłę w PBS, delikatnie dotknij igłą strony brzusznej muszki (tj. w pobliżu skrzydeł) — umieść ją w kropli PBS.
- Umieść jedną igłę na środku muszki, między klatką piersiową a odwłokiem, mocno naciskając. Drugą igłę umieść między szóstym (A6) a siódmym (A7) segmentem odwłoka (drugim i trzecim prążkiem od dołu); odsuń odwłok od klatki piersiowej.
- Oddziel jądra od pozostałych organów, zwłaszcza od przewodu pokarmowego. Szczególnie u mutantów white jądra i przewód pokarmowy wyglądają podobnie. Kluczowe różnice polegają na tym, że jądra zawsze występują w parach; każde jądro ma spiralny wzór i jest bardziej białe niż przewód pokarmowy.
- Przechowuj jądra w lodowatym PBS w polipropylenowej probówce do mikrocentryfugi.
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Widok grzbietowy męskiego układu rozrodczego,z flybase.org/reports/FBim0000074.html. Atrybucja Flybase: "Na podstawie Rysunku 38 A na stronie 508 z Miller (1950). A. Miller. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. In M. Demerec, editor, Biology of Drosophila, chapter 6, pages 420-534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, facsimile edition, 1994. Copyright 1994 by Cold Spring Harbor Laboratory Press. Użyto za uprzejmą zgodą Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Press. Patrz http://www.cshlpress.com."
Dyskusja
Przedstawiamy protokół izolacji jąder z dorosłych samców Drosophila melanogaster. Ponieważ technika ta wymaga koordynacji obu rąk, biegłość w jej wykonywaniu uzyskuje się jedynie poprzez praktykę.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Vasia Vagin za wprowadzenie tej techniki do naszego laboratorium.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Igła do sekcji | Narzędzie | Fisher Scientific | S17346 | |
| Przedmioty szkiełka mikroskopowe, czyste | Narzędzie | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Oświetlenie mikroskopowe | Narzędzie | Schott AG | KO-1500 | |
| Podkładka CO2 | Narzędzie | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Blatowy kompletny system Flowbuddy | Narzędzie | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Nawilżacz bąbelkowy | Narzędzie | Salter Labs | 7100 | |
| Igła do napełniania kulistego | Narzędzie | Genesee Scientific | 54-119 | |
| Taśma etykietująca ¾” | Materiały | Fisher Scientific | 15-901-5B |
Bibliografia
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
Przedruki i uprawnienia
