Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy wzmacniająco-pułapkowej w ośrodkowym układzie nerwowym larw i dorosłych Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy metodę intersekcjonalnej represji Gal80/Gal4 (FINGR) wywołaną przez Flippase, pozwalającą specyficznemu tkankowo FLP na określenie wzorców ekspresji Gal80. Wszędzie tam, gdzie Gal4 i FLP nakładają się na siebie, wyrażenie Gal4 jest włączone (Gal80 odwrócone) lub wyłączone (Gal80 odwrócone). Metoda FINGR jest wszechstronna w analizie klonalnej i mapowaniu obwodów neuronowych.

Streszczenie

Metoda binarna Gal4/ UAS jest skuteczna w manipulowaniu genami i obwodami neuronalnymi u Drosophila. Jednak w przypadku większości badań neurobiologicznych ekspresja Gal4 rzadko jest wystarczająco specyficzna tkankowo, aby umożliwić precyzyjną korelację obwodu z odczytami behawioralnymi. Aby pokonać tę poważną przeszkodę, niedawno opracowaliśmy metodę FINGR, aby osiągnąć bardziej restrykcyjną ekspresję Gal4 w tkance będącej przedmiotem zainteresowania. Metoda FINGR składa się z trzech elementów: 1) tradycyjnego systemu Gal4/UAS; 2) zestaw narzędzi do konwersji Gal80 za pośrednictwem FLP/FRT; oraz 3) wzmacniacz-pułapka FLP (ET-FLP). Gal4 służy do definiowania podstawowych obwodów neuronowych będących przedmiotem zainteresowania. Parowanie Gal4 z efektorem UAS, takim jak UAS-MJD78Q lub UAS-Shi^ts, reguluje aktywność neuronalną, która z kolei objawia się zmianami w zachowaniu muchy. Dzięki dodatkowemu rejestratorowi UAS, takiemu jak UAS-GFP, obwód neuronalny zaangażowany w określone zachowanie może być jednocześnie zmapowany do analizy morfologicznej. W przypadku linii Gal4 z szerokim wyrażeniem, wyrażenie Gal4 można ograniczyć za pomocą dwóch uzupełniających się narzędzi do konwersji Gal80: tub^P>Gal80> ("flip out") i tub^P>stop>Gal80 ("flip in"). Wreszcie, badacze mogą odpowiednio włączać i wyłączać Gal80 za pomocą specyficznego tkankowo ET-FLP. W trybie flip-in, Gal80 stłumi wyrażenie Gal4 wszędzie tam, gdzie przecinają się Gal4 i ET-FLP. W trybie flip-out Gal80 złagodzi represję Gal4 w komórkach, w których Gal4 i FLP nakładają się na siebie. Oba podejścia umożliwiają ograniczenie liczby komórek w obwodach zdefiniowanych przez Gal4, ale w odwrotnym wzorze. Metoda FINGR jest kompatybilna z ogromną kolekcją linii Gal4 w społeczności muchowej i jest wysoce wszechstronna w tradycyjnej analizie klonalnej i mapowaniu obwodów neuronowych. W tym protokole demonstrujemy mapowanie wzorców ekspresji FLP w wybranych liniach ET-FLPx2 oraz skuteczność metody FINGR w komórkach fotoreceptorowych. Zasada metody FINGR powinna mieć również zastosowanie do innych modelowych organizmów genetycznych, w których stosuje się Gal4/UAS, Gal80 i FLP/FRT.

Protokół

1. Szczepy Drosophila

1. Sterownik Gal4:
   GMR-Gal4, który ulega ekspresji Gal4 w komórkach fotoreceptorów.
2. Linie bezzałogowych statków powietrznych
   UAS-MJD78Q (lub UAS-polyQ), który powoduje zwyrodnienie neuronów w komórkach wykazujących ekspresję Gal4.
   UAS-GFP, który ulega ekspresji GFP w komórkach wykazujących ekspresję Gal4.
3. Linie FLP
   ey-FLP, który ulega ekspresji FLP w fotoreceptorach i podzbiorach regionów mózgu.
   Linie ET-FLPx2, które są liniami pułapek wzmacniających zawierającymi dwie kopie FLP (FLP-IRES-FLP). Wygenerowaliśmy ̃ 1,000 linii ET-FLP (Bohm i in., 2010), których wzorce ekspresji nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W tym miejscu opisano charakterystykę wzorca ekspresji wybranego ET-FLPx2 w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) larw i dorosłych much
.
4. FLP reporter
   yw, aktyna^P>CD2>Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), który informuje o wzorcu ekspresji ET-FLPx2 poprzez aktynę^P>Gal4; UAS-GFP po rekombinacyjnym wycięciu >CD2 za pośrednictwem FLP.
5. Dwa uzupełniające się narzędzia do konwersji Gal80
   Tub^P>Gal80> (Gordon & Scott, 2009), konstrukt typu flip-out, który konstytutywnie wyraża Gal80 we wszystkich tkankach napędzanych przez silny promotor tubuliny. Po rekombinacji za pośrednictwem FLP >Gal80 jest wywrócony, a ekspresja Gal80 jest zakończona tylko w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2.
   Tub>^P>stop>Gal80 (Bohm et al., 2010), konstrukcja typu flip-in, która nie wyraża Gal80 w normalnych warunkach. Ekspresja Gal80 jest włączana przez promotor tubuliny tylko w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2, w których FLP wywraca się >stop i odwraca się w Gal80.
6. Muchy do badania aktywności FLP w związku eye
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; wanna^P>stop>Gal80 (Bohm i wsp., 2010), która ma zdegenerowane i odbarwione oczy. W komórkach fotoreceptorów wykazujących ekspresję FLP ekspresja polyQ jest wyłączona po przerzuceniu Gal80.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; wanna^P>Gal80> (Bohm i wsp., 2010), która ma normalne oczy. W komórkach fotoreceptorów eksprymujących FLP ekspresja polyQ jest włączana po odwróceniu Gal80.

2. Odczynniki

Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, 1X), pH 7.4.
4% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony w PBS z 16% PFA, klasa EM (Cat#15710, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS zawierający 0,1% Triton-X 100 (Sigma)
Anty-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), barwi wszystkie neurony u Drosophila.
Anty-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) barwi komórki glejowe u Drosophila.
Kurczak Alexa 594 przeciwko mysiemu przeciwciału wtórnemu (Invitrogen)

3. Mapowanie wzorca wyrażenia linii FLPx2 enhancer-trap (* kroki krytyczne)

1. Zbieraj dziewice samice z yw, aktyna^P>CD2>Gal4; Linia UAS-GFP i krzyżowanie z samcami poszczególnych linii ET-FLPx2. Ten pierwszy służy jako reporter GFP do tkankowej ekspresji ET-FLP.
2. * Wypreparuj wędrujące larwy F1 w trzecim stadium rozwojowym, zachowaj OUN (tj. mózg i brzuszny rdzeń nerwowy, VNC) oraz ścianę ciała, utrwal przez 1 godzinę w 4% PFA na lodzie, przemyj 3X lodowatym PBS, a następnie 3X przepłucz PBT.
   Rozwarstwienie
   1. Usuń wędrujące larwy F1 z 3^stadium rozwojowego i umieść je w czystej szalce Sylgard (szalka Petriego 35 mm x 10 mm wypełniona 2 gramami Sylgard - zmieszana zgodnie z instrukcją producenta).
      1. Usuń resztki jedzenia za pomocą pędzla
   2. Napełnij naczynie lodowatym 1XPBS i umieść na lodzie, aby znieczulić larwy
   3. Przytrzymaj haczyki gębowe larwy parą kleszczy i chwyć naskórek w pobliżu przedłużającej się przedniej przetchlinki inną parą kleszczy i oderwij naskórek w kierunku tylnego końca. OUN zostanie przymocowany do haczyków ustnych wraz z gruczołami ślinowymi, jelitami i dyskami urojonymi.
   4. Usuń nadmiar tkanki i wyimaginowanych krążków otaczających OUN.
   5. Przenieś OUN do napełnionej PBS 3-dołkowej naczynia pyreksowej.
      1. Można użyć silikonowanej końcówki do pipety P200, aby uniknąć wysuszenia tkanki.
   6. Utrwal na 1 godzinę w 200 μl 4% PFA na lodzie.
      1. Upewnij się, że CNS jest całkowicie zanurzony w PFA.
         1. Jeśli OUN unosi się, zwykle sugeruje to, że OUN nie jest odpowiednio oczyszczony z otaczającej tkanki.
   7. Umyj 3X lodowatym PBS, a następnie 3X prań PBT.
3. * Wypreparuj OUN dorosłych much F1.
   1. Znieczulić muchy CO₂ lub umieścić zawarte muchy w pustej fiolce na lodzie na 10 minut.
   2. Umieść dorosłe muchy w szklanym naczyniu wypełnionym 95% EtOH na lodzie na 30 sekund.
   3. Przenieś dorosłe muchy do szklanego naczynia wypełnionego 1XPBS na lodzie.
      1. Przemyj 3X lodowatym 1X PBS, aby usunąć resztki EtOH
   4. Umieść muchę w 35-milimetrowym naczyniu Sylgard wypełnionym lodowatym 1X PBS
   5. Umieść stronę brzuszną skierowaną do góry i włóż mały długopis przeciw owadom (minuteria 0,1 mm) w połowie brzucha.
      1. Za pomocą kleszczy przytrzymaj podstawę nóg i usuń nogi inną parą kleszczy.
   6. Usuń naskórek
      głowy
      1. Chwytając trąbkę jedną parą kleszczy, umieść drugą pod okiem i złudź naskórek w kierunku grzbietowej linii środkowej głowy muchy.
      2. Chwyć drugie oko i usuń pozostały naskórek po drugiej stronie.
      3. Za pomocą ostrych kleszczy i/lub zaostrzonej igły wolframowej usuń tkankę tchawicy otaczającą mózg
         1. Niewłaściwe czyszczenie tchawicy spowoduje silną autofluorescencję, utrudniając ekspresję GFP i pozwoli mózgowi unosić się podczas utrwalania
   7. Sekcja
      VNC
      1. Usuń naskórek
         klatki piersiowej
         1. Zaczynając od tylnego końca klatki piersiowej, umieść dwa kleszcze po obu stronach 3. przedepisternum (tj. chwytając podstawę tylnych nóg).
         2. Delikatnie oddziel naskórek od brzusznej linii środkowej, powtarzaj to, aż dotrzesz do podstawy szyi.
         3. Delikatnie rozprowadź dwie połówki naskórka klatki piersiowej, odsłaniając VNC
      2. Następnie usuń brzuch z klatki piersiowej. Używając pary kleszczy do przytrzymania klatki piersiowej u podstawy drugiej nogi, użyj innej pary kleszczy, aby chwycić brzuch w pobliżu 1. sternitu brzusznego i ściągnąć brzuch.
      3. Aby usunąć VNC z otaczającej tkanki klatki piersiowej. Przytrzymaj obszar kości ramiennej parą kleszczy, a drugą parą kleszczy delikatnie oderwij większość tuszy klatki piersiowej.
      4. W tym miejscu powinien znajdować się pierścień tkanki łącznej otaczający tkankę łączną szyjki macicy (szyję). Za pomocą dwóch kleszczy rozerwij pierścień.
      5. Usuń nadmiar tkanki klatki piersiowej otaczającej VNC
   8. Przenieś mózg i VNC do 9-dołkowej naczynia Pyrex zawierającej 1X PBS na lodzie
      1. Można użyć silikonowanej końcówki do pipety P200, aby uniknąć wysuszenia tkanki
4. *Utrwal dorosły OUN na 1 godzinę w 4% PFA na lodzie i przemyj 3X lodowatym PBS i 3X PBT.
5. Inkubować preparat dla dorosłego ośrodkowego układu nerwowego lub ośrodkowego układu nerwowego larwalnego i ściany ciała w temperaturze 4°C przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom (anty-Elav, 1:10) lub glejowi (anty-Repo. 1:10). Przemyć preparat 5X z PBT.
6. Inkubować z preparatem dla dorosłych lub larw z kurczakiem Alexa 594 przeciwko mysiemu przeciwciału wtórnemu (1:100) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny i przemyć preparat PBS.
7. Zamontuj larwalną lub dorosły OUN na szkiełku. Aby zachować naturalny kształt CNS, należy użyć plastikowego pierścienia w kształcie litery O (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) na szkiełku jako minimostka do zawieszenia szkiełka nakrywkowego.
8. Zbadaj przygotowanie do wzorców ekspresji GFP i Elav (lub Repo) pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Zastosowanie dwóch uzupełniających się narzędzi do konwersji Gal80 w tłumieniu Gal4 w fotoreceptorach

1. Wysuwanie Gal80 przez wannę^P>Gal80> (Rysunek 5A).
   1. Zbierz samce z linii GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80>. Zauważ, że oczy złożone są normalne u tych much.
   2. Połącz się z dziewicami ey-FLP.
   3. Zbierz muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.
2. Obracanie Gal80 przez wannę^P>stop>Gal80 (Rysunek 5B).
   1. Zbierz GMR-Gal4, UAS-polyQ; wanna^P>stop>Gal80 samców much i zbadaj fenotyp oka. Zwróć uwagę na zdegenerowane i odbarwione oczy u tych much w porównaniu ze szczepami typu dzikiego (Canton-S)
   2. Mate z dziewicami ey-FLP;
   3. Zbierz muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.
3. Wybierz linie ET-FLPx2 z ekspresją w komórkach fotoreceptorowych

Kroki 4.1 i 4.2 można powtórzyć za pomocą linii ET-FLPx2, które wyrażają FLP w podzbiorze komórek fotoreceptorowych. Alternatywnie, albo GMR-Gal4, UAS-polyQ; wanna^P>stop>Gal80 leci lub GMR-Gal4, UAS-polyQ; Muchy^{tub P}>Gal80> można krzyżować z pojedynczymi liniami ET-FLPx2 w celu wykrycia linii, które wyrażają FLP w komórkach fotoreceptorów. Cenne linie ET-FLPx2 to te, które wyrażają FLP tylko w podzbiorze lub pojedynczych komórkach fotoreceptorowych (ryc. 6).

5. Reprezentatywne wyniki

Wzorzec ekspresji specyficznej linii ET-FLPx2 można łatwo zbadać i udokumentować u larw F1 lub dorosłych muszek pochodzących ze skrzyżowania yw, aktyny>^P>CD2>Gal4; Dziewice UAS-GFP i samce ET-FLPx2 (ryc. 1). Zazwyczaj od trzech do pięciu powtórzeń zwierząt F1 jest preparowanych i badanych w celu określenia odtwarzalności wzorca ekspresji FLP (Bohm i in., 2010). Rycina 2 przedstawia wzorzec ekspresji FLP w linii ET-FLPx2 173A w larwalnym i dorosłym OUN. Wzorzec FLP może być dalej analizowany za pomocą markera neuronalnego lub glejowego (ryc. 3 i 4).

Wyniki pokazane na rysunku 7 ilustrują skuteczność systemów typu flip-in i flip-out Gal80 w intersekcjonalnej represji Gal4 po rekombinacji za pośrednictwem FLP. Konstrukt^{wanny P}>stop>Gal80 nie wydaje się mieć żadnej nieszczelnej ekspresji Gal80 (w oparciu o jednolitą degenerację i depigmentację fotoreceptorów), a mimo to jest w 100% skuteczny w odwracaniu Gal80 za pomocą eyFLP w celu stłumienia GMR-Gal4 i przywrócenia oka do normalnego wyglądu (ryc. 7A). Wręcz przeciwnie, tub^P>Gal80> całkowicie tłumi GMR-Gal4 przed wprowadzeniem eyFLP. Po odwróceniu Gal80, GMR-Gal4 napędza ekspresję UAS-polyQ, prowadząc do zwyrodnienia i depigmentacji oczu (ryc. 7B). W tym przykładzie użyliśmy FLP pan-photorecetor do mapowania "obwodów" fotoreceptorów, ale nie badaliśmy konsekwencji behawioralnych. Stosując podobne podejścia z behawioralnie istotnymi liniami Gal4, zmapowaliśmy część obwodu CCAP-Gal4 regulującego rozszerzanie się skrzydeł u dorosłych much (Bohm i in., 2010). Wierzymy, że metoda FINGR będzie cenna w zrozumieniu neuronalnych podstaw zachowania.

Rysunek 1. Badanie wzorca ekspresji linii ET-FLPx2. Wzorzec ekspresji FLP (niebieskie owale) z linii ET-FLPx2 można określić, krzyżując samca ET-FLPx2 (u góry po lewej) z aktyną^P>CD2>Gal4; UAS-GFP dziewiczy (u góry po prawej). Wszechobecna ekspresja^{aktyny P}>Gal4 u rodzicielskiej samicy jest utrudniona przez insercję sekwencji CD2 otoczonej FRT (szare trójkąty). W potomstwie F1 FLP wytnie sekwencję CD2, umożliwiając aktynie^P>Gal4 sterowanie ekspresją UAS-GFP.

Rysunek 2. Wzorzec ekspresji linii ET-FLPx2 w larwalnym i dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym. Obrazy te przedstawiają OUN (mózg i brzuszny rdzeń nerwowy, VNC) wypreparowany z potomstwa powstałego z krycia yw, aktyny^P>CD2>Gal4; UAS-GFP rodzice linii ET-FLPx2 173A. Poprzez rekombinację kasety >CD2>, FLP aktywuje ekspresję aktyny^P>GAL4 (wynikającą z niej ekspresję UAS-GFP). W związku z tym wzorzec GFP zgłasza komórki wykazujące ekspresję FLP. Panel A pokazuje wzorzec ekspresji FLP larw, podczas gdy panel B pokazuje wzorzec ekspresji dorosłego osobnika w linii 173A.

Rysunek 3. Charakterystyka typów komórek, które wyrażają flippazę w linii ET-FLPx2 #688A. A, Złożony obraz utrwalonej larwy F1 3^rd instar barwionej anty-REPO ze skrzyżowania linii ET-FLPx2 #688A i linii raportowania GFP Flippase. B-D, Widok w dużym powiększeniu (olej Zeiss Plan-Apochromat 63x) wykonany z tylnego końca VNC z larwy w 3^{. stadium} rozwojowym.

Rysunek 4. Charakterystyka typów komórek w ciele grzyba linii ET-FLPx2 #150. A-C, Obraz w dużym powiększeniu (63-krotne zanurzenie w oleju) korpusu grzyba z nieruchomej larwy F1 3rd w stadium rozwojowym zabarwionej anty-REPO.

Rysunek 5. Ilustracja strategii Gal80 Flip-in i Flip-out. ZA. W strategii flip-out, Gal80 (Tub^P>Gal80> napędzany przez promotor tubuliny jest konstytutywnie aktywny, co powoduje tłumienie GMR-Gal4 i fenotyp oka typu dzikiego (czerwone oko). To ograniczenie zostało usunięte przez wprowadzenie FLP (fioletowy), który odwróci Gal80 (środek, czerwony) i pozwoli GMR-Gal4 sterować wyrażeniem UAS-polyQ. Powoduje to zwyrodnienie komórek fotoreceptorowych (zilustrowane białymi kropkami w oku). B. W odwrotności poprzedniej strategii, ekspresja Gal80 napędzana przez promotor tubuliny jest przerywana przez kodon "stop" otoczony FRT (szary trójkąt). W przypadku braku Gal80, GMR-Gal4 wiąże się z UAS-polyQ, powodując zwyrodnienie neuronów w fotoreceptorach (zilustrowane białymi kropkami w oku). Przecinając GMR-Gal4, UAS-polyQ; Samce^{tub P}>stop>GAL80 z dziewiczymi samicami, które wyrażają FLP w komórkach fotoreceptorowych, FLP (fioletowy) będzie katalizować rekombinację w miejscach FRT, wycinając kodon "stop" (środkowy, czerwony), umożliwiając w ten sposób ekspresję Gal80 i represję GMR-Gal4. Rezerwuje to neurodegenerację w komórkach fotoreceptorów (ilustruje to brak białych kropek w oku).

Rysunek 6. Zastosowanie metody FINGR w wywracaniu Gal80 za pomocą ET-FLPx2 Line #688A. Potomstwo F1 ze skrzyżowania linii ET-FLPx2 #688A dziewicze z GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP>GAL80 męski. Brak pigmentu w środku oka ommatidia reprezentuje ekspresję FLP w linii #688A. W tym rejonie tłumienie GMR-Gal4 przez Gal80 zostało złagodzone, co pozwoliło Gal4 na sterowanie UAS-polyQ.

Rysunek 7. Zastosowanie metody FINGR w odwracaniu Gal80 do wewnątrz lub na zewnątrz w celu przecięcia Gal4 w fotoreceptorach. ZA. System^{flip-in P}>Stop>Gal80 w wannie ogranicza ekspresję GAL4 w sposób zależny od FLP. W GMR-GAL4, UAS-polyQ; wanna^P>stop>GAL80 muchuje, komórki fotoreceptorowe są zdegenerowane i odbarwione (lewa mucha). Po wprowadzeniu eyFLP, Gal80 ulega ekspresji w komórkach fotoreceptorów, co powoduje pełną represję GMR-Gal4, co z kolei wyłącza ekspresję polyQ i wytwarza muchy z normalnymi oczami (prawa mucha). Ur. System flip-out^{wanny P}>Gal80> działa w odwrotny sposób niż system flip-in^P>stop>Gal80. Tub^P>Gal80> konstytutywnie tłumi GAL4 i tłumi ekspresję polyQ (lewy muchowiec, z normalnymi oczami). Po wprowadzeniu eyFLP, Gal80 jest wyrzucany z komórek fotoreceptorów, łagodząc supresję GMR-Gal4 i włączając ekspresję polyQ. Prowadzi to do much ze zdegenerowanymi i odbarwionymi oczami (prawa mucha).

Dyskusja

System Gal4/UAS jest szeroko i z powodzeniem stosowany przez drozofilów do różnych badań biologicznych (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Do tej pory społeczność muchowa wygenerowała tysiące linii Gal4 napędzanych przez promotorów i ulepszających. Główną zaletą metody FINGR jest to, że jest ona kompatybilna z systemem Gal4/UAS, co umożliwia znaczne rozszerzenie mocy Gal4 w badaniach nad Drosophila.

Jednym z ważnych zastosowań metody FINGR jest precyzyjne dostrojenie obwodów neuronowych leżących u podstaw zachowania poprzez przecięcie Gal4/Gal80. Zachowania te mogą obejmować między innymi uczenie się i pamięć, zaloty, sen i rytm okołodobowy. Metoda FINGR może być również wykorzystana do mapowania krytycznych neuronów, które są podatne na neurodegenerację w modelowaniu ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i choroby Parkinsona. Podobnie, ogniska neuronów lub obwodów neuronalnych kluczowe dla pośredniczenia w uzależnieniu od kokainy, alkoholu i innych substancji mogą być mapowane za pomocą metody FINGR. Należy zauważyć, że warunkowe Gal4s (Osterwalder i wsp., 2001; Roman i wsp., 2001) mogą być stosowane z metodą FINGR w celu uzyskania czasowej kontroli nad obwodami neuronalnymi i zachowaniami. Modyfikacja narzędzi do przekształcania Gal80 poprzez użycie wrażliwego na temperaturę Gal80 (Gal80^ts, McGuire i in., 2003) może wytwarzać wannę^P>stop>Gal80^ts lub wannę^P>Gal80^ts>, dodając dalszą elastyczność czasową w manipulacji obwodami. Poza układem nerwowym, metoda FINGR ma również zastosowanie do ograniczania ekspresji Gal4 w podzbiorach komórek, niezależnie od tego, czy jest to skrzydło, czy noga.

Linie ET-FLPx2 będą cennym źródłem informacji dla wszystkich biologów zajmujących się analizą klonalną opartą na FRT/FLP (Xu & Rubin, 1993), w tym MARCM (Lee & Luo, 1999). Oczekuje się również, że niektóre linie ET-FLPx2 mogą zastąpić szok cieplny FLP w produkcji powtarzalnych klonów oraz w powtarzających się analizach morfologicznych i behawioralnych. Podobnie jak linie Gal4 enhancer-trap, większość linii ET-FLPx2 prawdopodobnie nie zostanie wyrażona specyficznie w interesujących nas komórkach. Większość linii będzie wyrażać FLP w interesujących komórkach ORAZ w innych komórkach lub tkankach. Jednak brak "specyficzności tkankowej" zarówno Gal4, jak i ET-FLPx2 nie będzie poważnym problemem dla metody FINGR, o ile ich nakładający się region jest pożądany w konkretnym eksperymencie. FINGR został zaprojektowany tak, aby przekształcić dwa "szerokie" systemy w jeden wyrafinowany.

Metody przedstawione w tych protokołach są raczej standardowe i powinny być powtarzalne. Głównymi krokami ostrzegawczymi, które wymagają uwagi, są wybór i użycie utrwalacza. Należy unikać utrwalaczy innych niż PFA, ponieważ będą one tłumić sygnał GFP. Zauważyliśmy również, że naczynie do preparacji nie powinno być używane do utrwalania za pomocą PFA, aby uniknąć możliwości, że ekspresja FLP nie zostanie wiarygodnie zgłoszona przez GFP.