Mapowanie i zastosowanie ekspresji flippazy w pułapkach enhancerów w OUN larw i dorosłych osobników Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy metodę Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR), która pozwala wykorzystać tkankowo specyficzną FLP do określania wzorców ekspresji Gal80. W każdym miejscu, w którym Gal4 i FLP nakładają się na siebie, ekspresja Gal4 zostaje włączona (Gal80 zostaje usunięte – „flipped out”) lub wyłączona (Gal80 zostaje wstawione – „flipped in”). Metoda FINGR jest wszechstronnym narzędziem do analizy klonalnej i mapowania obwodów neuronalnych.

Streszczenie

Metoda binarna Gal4/UAS jest potężnym narzędziem do manipulacji genami i obwodami neuronalnymi u Drosophila. W większości badań neurobiologicznych ekspresja Gal4 jest jednak rzadko na tyle specyficzna tkankowo, aby umożliwić precyzyjną korelację obwodu z odczytami behawioralnymi. Aby pokonać tę główną przeszkodę, opracowaliśmy niedawno metodę FINGR, pozwalającą na uzyskanie bardziej restrykcyjnej ekspresji Gal4 w interesującej nas tkance. Metoda FINGR składa się z trzech komponentów: 1) tradycyjnego systemu Gal4/UAS; 2) zestawu narzędzi do konwersji Gal80 opartych na systemie FLP/FRT; oraz 3) pułapki enhancerowej FLP (ET-FLP). Gal4 służy do zdefiniowania głównego, badanego obwodu neuronalnego. Parowanie Gal4 z efektorem UAS, takim jak UAS-MJD78Q lub UAS-Shi^ts, reguluje aktywność neuronalną, co z kolei przejawia się zmianami w zachowaniu muchy. Dzięki zastosowaniu dodatkowego reportera UAS, takiego jak UAS-GFP, obwód neuronalny zaangażowany w konkretne zachowanie może być jednocześnie mapowany do analizy morfologicznej. W przypadku linii Gal4 o szerokiej ekspresji, można ją ograniczyć, stosując dwa komplementarne narzędzia konwersji Gal80: tub^P>Gal80> („flip out”) oraz tub^P>stop>Gal80 („flip in”). Wreszcie badacze mogą odpowiednio włączać lub wyłączać Gal80 przy pomocy tkankowo specyficznego ET-FLP. W trybie flip-in Gal80 będzie tłumić ekspresję Gal4 wszędzie tam, gdzie Gal4 i ET-FLP się przecinają. W trybie flip-out Gal80 zniesie represję Gal4 w komórkach, w których Gal4 i FLP nakładają się na siebie. Oba podejścia umożliwiają ograniczenie liczby komórek w obwodzie zdefiniowanym przez Gal4, ale w odwrotnych schematach. Metoda FINGR jest kompatybilna z ogromną kolekcją linii Gal4 dostępnych w społeczności badaczy much i jest niezwykle wszechstronna w tradycyjnej analizie klonalnej oraz w mapowaniu obwodów neuronalnych. W niniejszym protokole demonstrujemy mapowanie wzorców ekspresji FLP w wybranych liniach ET-FLPx2 oraz skuteczność metody FINGR w komórkach fotoreceptorów. Zasada metody FINGR powinna być również możliwa do zastosowania u innych organizmów modelowych, w których wykorzystuje się systemy Gal4/UAS, Gal80 oraz FLP/FRT.

Protokół

1. Szczepy Drosophila

1. Driver Gal4:
   GMR-Gal4, który wykazuje ekspresję Gal4 w komórkach fotoreceptorów.
2. Linie UAS
   UAS-MJD78Q (lub UAS-polyQ), która wywołuje degenerację neuronów w komórkach wykazujących ekspresję Gal4.
   UAS-GFP, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach wykazujących ekspresję Gal4.
3. Linie FLP
   ey-FLP, która wykazuje ekspresję FLP w fotoreceptorach oraz w podzbiorach obszarów mózgu.
   Linie ET-FLPx2, będące liniami typu enhancer-trap zawierającymi dwie kopie FLP (FLP-IRES-FLP). Wygenerowano ok. 1 0 linii ET-FLP (Bohm et al., 2010), których wzorce ekspresji nie zostały jeszcze scharakteryzowane. W niniejszej pracy opisujemy charakterystykę wzorca ekspresji wybranych linii ET-FLPx2 w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) larwalnych i dorosłych much.
4. Reporter FLP
   yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP (Pignoni & Zipursky, 1997), który raportuje wzorzec ekspresji ET-FLPx2 poprzez actin^P>Gal4; UAS-GFP po wycięciu sekwencji >CD2 w wyniku rekombinacji zależnej od FLP.
5. Dwa komplementarne narzędzia konwertujące Gal80
   Tub^P>Gal80> (Gordon & Scott, 209), konstrukt typu flip-out, który konstytutywnie wykazuje ekspresję Gal80 we wszystkich tkankach pod kontrolą silnego promotora tubuliny. Po rekombinacji zależnej od FLP sekwencja >Gal80 zostaje usunięta (flipped out), a ekspresja Gal80 zostaje przerwana wyłącznie w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2.
   Tub^P>stop>Gal80 (Bohm et al., 2010), konstrukt typu flip-in, który w normalnych warunkach nie wykazuje ekspresji Gal80. Ekspresja Gal80 jest uruchamiana przez promotor tubuliny tylko w tkankach wykazujących ekspresję ET-FLPx2, w których FLP usuwa sekwencję >stop i wprowadza (flips in) Gal80.
6. Muchy do badania aktywności FLP w oku złożonym
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80 (Bohm et al., 2010), które posiadają zdegenerowane i odbarwione oczy. W komórkach fotoreceptorów wykazujących ekspresję FLP ekspresja polyQ zostaje wyłączona po wprowadzeniu (flip-in) Gal80.
   GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80> (Bohm et al., 2010), które posiadają prawidłowe oczy. W komórkach fotoreceptorów wykazujących ekspresję FLP ekspresja polyQ zostaje uruchomiona po usunięciu (flip-out) Gal80.

2. Odczynniki

Bufor fosforanowy (PBS, 1X), pH 7,4.
4% paraformaldehyd (PFA), rozcieńczony w PBS z 16% PFA, stopień EM (Cat#15710, Electronic Microscopy Sciences, Hatfield, PA)
PBT, 1XPBS zawierający 0,1% Triton-X 10 (Sigma)
Przeciwciało anty-Elav (mAb, 9F8A9; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa), barwi wszystkie neurony u Drosophila.
Przeciwciało anty-Repo (mAb 8D12; Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) barwi komórki glejowe u Drosophila.
Wtórne przeciwciało anty-mysie z kurczaka Alexa 594 (Invitrogen)

3. Mapowanie wzorca ekspresji linii FLPx2 z pułapką enhancera (* kroki krytyczne)

1. Zebrać dziewicze samice z linii yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP i skrzyżować je z samcami poszczególnych linii ET-FLPx2. Pierwsza z nich służy jako reporter GFP dla ekspresji tkankowej ET-FLP.
2. *Przeprowadzić mikrodissekcję larw F1 w 3_rd stadium poczwarki (etap wędrowania), wyizolować OUN (t.j. mózg i brzuszny sznur nerwowy, VNC) oraz ścianę ciała, utrwalić przez 1 godzinę w 4% PFA w lodzie, przemyć 3X lodowatym PBS, a następnie 3X PBT.
   Mikrodissekcja
   1. Wyjąć wędrujące larwy F1 w 3^rd stadium poczwarki i umieścić je w czystym naczyniu z Sylgardem (szalka Petriego 35 mm x 10 mm wypełniona 2 gramami Sylgardu – zmieszanego zgodnie z instrukcją producenta).
      1. Usunąć resztki pożywki za pomocą pędzelka
   2. Wypełnić naczynie lodowatym 1XPBS i umieścić na lodzie, aby znieczulić larwy
   3. Przytrzymać haki gębowe larwy jedną pęsetą, chwycić kutykulę w pobliżu wysuniętego przedniego przetchawika drugą pęsetą i oddzielić kutykulę w kierunku końca tylnego. OUN zostanie oddzielony wraz z hakami gębowymi, gruczołami ślinowymi, jelitem i krążkami wyobraźnymi.
   4. Usunąć nadmiar tkanek i krążki wyobraźne otaczające OUN.
   5. Przenieść OUN do 3-dołkowego naczynia Pyrex wypełnionego PBS.
      1. Można użyć silikonizowanej końcówki pipety P200, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
   6. Utrwalić przez 1 godzinę w 20 μl 4% PFA w lodzie.
      1. Upewnić się, że OUN jest całkowicie zanurzony w PFA.
         1. Jeśli OUN pływa, zwykle sugeruje to, że nie został on prawidłowo oczyszczony z tkanek otaczających.
   7. Przemyć 3X lodowatym PBS, a następnie 3X PBT.
3. *Przeprowadzić mikrodissekcję OUN dorosłych much F1.
   1. Znieczulić muchy CO₂ lub umieścić muchy w pustej fiolce na lodzie przez 10 minut.
   2. Umieścić dorosłe muchy w szklanym naczyniu wypełnionym 95% EtOH na lodzie na 30 s.
   3. Przenieść dorosłe muchy do szklanego naczynia wypełnionego 1XPBS na lodzie.
      1. Przemyć 3X lodowatym 1X PBS, aby usunąć pozostałości EtOH
   4. Umieścić muchę w 35-milimetrowym naczyniu z Sylgardem wypełnionym lodowatym 1X PBS
   5. Ułożyć muchę stroną brzuszną do góry i wbić małą szpilkę entomologiczną (szpilki minutiens 0,1 mm) w połowie odwłoka.
      1. Przytrzymać podstawy nóg jedną pęsetą i usunąć nogi drugą pęsetą.
   6. Usunąć kutykulę głowy
      1. Chwytając trąbkę jedną pęsetą, umieścić drugą pod okiem i oddzielić kutykulę w kierunku grzbietowej linii środkowej głowy muchy.
      2. Chwycić drugie oko i usunąć pozostałą kutykulę z drugiej strony.
      3. Za pomocą ostrych pęset i/lub zaostrzonej igły wolframowej usunąć tkankę tchawkową otaczającą mózg
         1. Niewłaściwe oczyszczenie tchawki spowoduje silną autofluorescencję, która przesłoni ekspresję GFP, oraz sprawi, że mózg będzie pływał podczas utrwalania
   7. Mikrodissekcja VNC
      1. Usunąć kutykulę klatki piersiowej
         1. Zaczynając od tylnego końca klatki piersiowej, umieścić dwie pęsety po każdej stronie 3^rd preepisternum (t.j. chwytając podstawy tylnych nóg).
         2. Delikatnie oddzielić kutykulę od brzusznej linii środkowej; powtarzać tę czynność, aż dotrzeć do podstawy szyi.
         3. Delikatnie rozsunąć dwie połowy kutykuli klatki piersiowej, odsłaniając VNC
      2. Następnie oddzielić odwłok od klatki piersiowej. Trzymając klatkę piersiową jedną pęsetą u podstawy drugiej pary nóg, użyć drugiej pęsety, aby chwycić odwłok w pobliżu 1. sternitu odwłoka i odciągnąć odwłok.
      3. Aby oddzielić VNC od otaczających tkanek klatki piersiowej, przytrzymać obszar humeralny jedną pęsetą, a drugą pęsetą delikatnie oderwać większość szkieletu klatki piersiowej.
      4. Na tym etapie powinien pozostać pierścień tkanki łącznej otaczający połączenie szyjne (szyję). Za pomocą dwóch pęset rozerwać ten pierścień.
      5. Usunąć wszelkie nadmiarowe tkanki klatki piersiowej otaczające VNC
   8. Przenieść mózg i VNC do 9-dołkowego naczynia Pyrex zawierającego 1X PBS na lodzie
      1. Można użyć silikonizowanej końcówki pipety P20, aby zapobiec wysuszeniu tkanek
4. *Utrwalić dorosły OUN przez 1 godzinę w 4% PFA na lodzie, a następnie przemyć 3X lodowatym PBS i 3X PBT.
5. Inkubować preparat dorosłego OUN lub larwalnego OUN i ściany ciała w temperaturze 4°C przez noc z przeciwciałami przeciwko neuronom (anti-Elav, 1:10) lub glii (anti-Repo, 1:10). Przemyć preparat 5X PBT.
6. Inkubować preparat dorosły lub larwalny z wtórnym przeciwciałem Alexa 594 przeciwko myszy produkowanym w kurach (1:10) w temperaturze pokojowej przez 2 h, a następnie przemyć preparat PBS.
7. Zamontować larwalny lub dorosły OUN na szkiełku. Aby zachować naturalny kształt OUN, użyć na szkiełku plastikowego pierścienia w kształcie litery O (Clear Reinforcement Label, Avery Dennison, Office Products, Brea, CA) jako mini-mostka do podtrzymania szkiełka nakrywki.
8. Zbadać preparat pod kątem wzorców ekspresji GFP i Elav (lub Repo) pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Zastosowanie dwóch komplementarnych narzędzi konwertujących Gal80 w celu represji Gal4 w fotoreceptorach

1. Usunięcie Gal80 za pomocą tub^P>Gal80> (Rysunek 5A).
   1. Wyselekcjonuj samce z linii GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80>. Zauważ, że oczy złożone u tych much są prawidłowe.
   2. Skrzyżuj je z dziewiczymi samicami ey-FLP.
   3. Wyselekcjonuj muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.
2. Wprowadzenie Gal80 za pomocą tub^P>stop>Gal80 (Rysunek 5B).
   1. Wyselekcjonuj samce much GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80 i zbadaj fenotyp oka. Zwróć uwagę na zdegenerowane i odbarwione oczy u tych much w porównaniu do szczepów typu dzikiego (Canton-S).
   2. Skrzyżuj je z dziewiczymi samicami ey-FLP;
   3. Wyselekcjonuj muchy F1 i zbadaj fenotyp oka.
3. Wybierz linie ET-FLPx2 z ekspresją w komórkach fotoreceptorowych

Kroki 4.1 i 4.2 można powtórzyć, używając linii ET-FLPx2, które wykazują ekspresję FLP w podzbiorze komórek fotoreceptorowych. Alternatywnie, muchy GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Gal80 lub GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>Gal80> można krzyżować z poszczególnymi liniami ET-FLPx2 w celu przesiewania linii wykazujących ekspresję FLP w komórkach fotoreceptorowych. Wartościowe linie ET-FLPx2 to te, które wykazują ekspresję FLP jedynie w podzbiorze lub pojedynczych komórkach fotoreceptorowych (Rysunek 6).

5. Reprezentatywne wyniki

Wzorzec ekspresji konkretnej linii ET-FLPx2 można łatwo zbadać i udokumentować w larwach F1 lub dorosłych muchach pochodzących z krzyżowania dziewic yw, actin^P>CD2>Gal4; UAS-GFP oraz samców ET-FLPx2 (Rysunek 1). Typowo przeprowadza się sekcję i badanie od trzech do pięciu powtórzeń zwierząt F1, aby określić powtarzalność wzorca ekspresji FLP (Bohm et al., 2010). Rysunek 2 przedstawia wzorzec ekspresji FLP w linii ET-FLPx2 173A w ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) larw i dorosłych osobników. Wzorzec FLP można dalej analizować przy użyciu markera neuronalnego lub glialnego (Rysunek 3 i 4).

Wyniki przedstawione na Rysunku 7 ilustrują skuteczność systemów Gal80 flip-in i flip-out w interseksjonalnej represji Gal4 po rekombinacji pośredniczonej przez FLP. Konstrukt tub^P>stop>Gal80 nie wykazuje żadnej nieszczelnej ekspresji Gal80 (na podstawie jednorodnej degeneracji i depigmentacji fotoreceptorów), a mimo to jest w 100% skuteczny w procesie wstawiania (flip-in) Gal80 przy pomocy eyFLP w celu represji GMR-Gal4 i przywrócenia oczom normalnego wyglądu (Rys. 7A). Przeciwnie, tub^P>Gal80> w pełni represuje GMR-Gal4 przed wprowadzeniem eyFLP. Po usunięciu Gal80 (flip-out), GMR-Gal4 napędza ekspresję UAS-polyQ, co prowadzi do degeneracji i depigmentacji oczu (Rys. 7B). W tym przykładzie użyliśmy pan-fotoreceptorowego FLP do mapowania „obwodów” fotoreceptorów, lecz nie badaliśmy konsekwencji behawioralnych. Stosując podobne podejścia z liniami Gal4 istotnymi behawioralnie, zmapowaliśmy część obwodu CCAP-Gal4 regulującego rozprostowanie skrzydeł u dorosłych much (Bohm et al., 2010). Wierzymy, że metoda FINGR będzie cenna w pogłębianiu naszego zrozumienia neuronalnych podstaw zachowania.

Rysunek 1. Analiza wzorca ekspresji linii ET-FLPx2. Wzorzec ekspresji FLP (niebieskie owale) z linii ET-FLPx2 można wyznaczyć poprzez skrzyżowanie samca ET-FLPx2 (lewa góra) z aktyną^P>CD2>dziewicze Gal4; UAS-GFP (prawy górny róg). Ubikwitynowa aktyna^P>Ekspresja Gal4 u samicy rodzicielskiej jest hamowana przez insercję sekwencji CD2 flankowanej przez miejsca FRT (szare trójkąty). W potomstwie F1 rekombinaza FLP wytnie sekwencję CD2, co umożliwi ekspresję aktyny^P>Gal4 do sterowania ekspresją UAS-GFP.

Rysunek 2. Wzór ekspresji linii ET-FLPx2 w centralnym układzie nerwowym larw i osobników dorosłychObrazy te przedstawiają ośrodkowy układ nerwowy (mózg i brzuszny sznur nerwowy, VNC) wypreparowany z potomstwa uzyskanego z krzyżowania yw, actin^P>CD2>rodziców Gal4 oraz UAS-GFP do linii ET-FLPx2 173A. Poprzez rekombinacyjne usunięcie >CD2> kaseta, FLP aktywuje aktynę^P>ekspresja GAL4 (wtórna ekspresja UAS-GFP). Zatem wzór GFP wskazuje komórki wykazujące ekspresję FLP. Panel A przedstawia wzorzec ekspresji FLP w larwach, natomiast panel B przedstawia wzorzec ekspresji u osobników dorosłych w linii 173A.

Rysunek 3. Charakterystyka typów komórek wykazujących ekspresję flippazy w linii ET-FLPx2 nr 688A. A, obraz kompozytowy utrwalonej F1 3^rd larwa w stadium poczwarki zabarwiona przeciwciałem anty-REPO, pochodząca z krzyżówki linii ET-FLPx2 nr 68A i linii raportującej GFP Flippase. B-D, widok przy dużym powiększeniu (Zeiss Plan-Apochromat 63x oil) wykonany z tylnego końca VNC z 3^{Badania i rozwój} stadia larwalne.

Rycina 4. Charakterystyka typów komórek w obrębie ciała grzybowego linii ET-FLPx2 nr 150. A-C, zdjęcie przy dużym powiększeniu (63x, imersja olejowa) ciał grzybowatych utrwalonej larwy F1 w trzecim stadium rozwojowym, barwionej przeciwciałem anty-REPO.

Rysunek 5. Ilustracja strategii Gal80 Flip-in i Flip-out. A. W strategii flip-out Gal80 pod promotorem tubuliny (Tub^P>Gal80>) wykazuje aktywność konstytutywną, co prowadzi do represji GMR-Gal4 i fenotypu oka typu dzikiego (czerwone oko). Represja ta jest zniesiona poprzez wprowadzenie FLP (fioletowy), który powoduje odwrócenie orientacji Gal80 (środek, czerwony), umożliwiając GMR-Gal4 stymulację ekspresji UAS-polyQ. Skutkuje to degeneracją komórek fotoreceptorowych (zilustrowaną białymi kropkami w oku). BW odwrotności do poprzedniej strategii, ekspresja Gal80 sterowana promotorem tubuliny jest przerywana przez kodon „stop” flankowany sekwencjami FRT (szary trójkąt). Wobec braku Gal80, GMR-Gal4 wiąże się z UAS-polyQ, co powoduje degenerację neuronalną w fotoreceptorach (zilustrowaną białymi kropkami w oku). Poprzez krzyżowanie GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>Samce GAL80 z dziewiczymi samicami wykazującymi ekspresję FLP w komórkach fotoreceptorów; FLP (fioletowy) katalizuje rekombinację w miejscach FRT, wycinając kodon „stop” (środek, czerwony), co umożliwia ekspresję Gal80 i represję GMR-Gal4. Zapobiega to neurodegeneracji w komórkach fotoreceptorów (zilustrowane brakiem białych kropek w oku).

Rycina 6. Zastosowanie metody FINGR do wyciszenia Gal80 przy użyciu linii ET-FLPx2 nr 68A. Potomstwo F1 z krzyżówki linii ET-FLPx2 nr 68A (dziewice) z GMR-Gal4, UAS-polyQ; tubP>Samce GAL80. Brak pigmentu w środkowej części ommatidiów oka reprezentuje ekspresję FLP w linii #68A. W tym obszarze zniesiono supresję GMR-Gal4 przez Gal80, co pozwoliło Gal4 na napędzanie UAS-polyQ.

Rycina 7. Zastosowanie metody FINGR w celu wprowadzenia lub usunięcia Gal80 w celu przecięcia się z Gal4 w fotoreceptorach. A. Kuweta^P>zatrzymaj>System flip-in Gal80 ogranicza ekspresję GAL4 w sposób zależny od FLP. W GMR-Gal4, UAS-polyQ; tub^P>stop>W przypadku much GAL80 komórki fotoreceptorowe są zdegenerowane i odbarwione (mucha po lewej). Po wprowadzeniu eyFLP białko Gal80 ulega ekspresji w komórkach fotoreceptorowych, co prowadzi do pełnej represji GMR-Gal4, co z kolei wyłącza ekspresję polyQ i daje muchy z prawidłowo rozwiniętymi oczami (mucha po prawej). B. Kuweta^P>Gal80> system odchylny działa w sposób przeciwny do wanny^P>zatrzymaj>System flip-in Gal80. Tub^P>Gal80> konstytutywnie represuje GAL4 i tłumi ekspresję polyQ (muszka po lewej, z normalnymi oczami). Po wprowadzeniu eyFLP Gal80 zostaje usunięte z komórek fotoreceptorów, co znosi supresję GMR-Gal4 i uruchamia ekspresję polyQ. Prowadzi to do powstania muszek zdegenerowanymi i odbarwionymi oczami (muszka po prawej).

Dyskusja

System Gal4/UAS jest szeroko i z sukcesem wykorzystywany przez badaczy Drosophila w różnych studiach biologicznych (Brand & Perrimon, 1993; Duffy, 2002). Do tej pory środowisko badawcze stworzyło tysiące linii Gal4 sterowanych przez promotory oraz linie typu enhancer-trap. Główną zaletą metody FINGR jest jej kompatybilność z systemem Gal4/UAS, co pozwala na znaczne zwiększenie możliwości wykorzystania Gal4 w badaniach nad Drosophila.

Jednym z istotnych zastosowań metody FINGR jest precyzyjne dostrajanie obwodów neuronalnych leżących u podstaw zachowań poprzez przecięcie Gal4/Gal80. Zachowania te mogą obejmować, między innymi, uczenie się i pamięć, zaloty, sen oraz rytm okołodobowy. Metoda FINGR może być również wykorzystana do mapowania kluczowych neuronów podatnych na neurodegenerację w modelowaniu ludzkich chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, stwardnienie zanikowe boczniszne (ALS) oraz choroba Parkinsona. Podobnie, za pomocą metody FINGR można mapować skupiska neuronów lub obwodów neuronalnych kluczowych dla mediowania uzależnienia od kokainy, alkoholu i innych substancji. Należy zauważyć, że z metodą FINGR można stosować warunkowe Gal4 (Osterwalder et al., 2001; Roman et al., 2001), aby uzyskać kontrolę czasową nad obwodami neuronalnymi i zachowaniami. Modyfikacja narzędzi konwertujących Gal80 poprzez zastosowanie temperaturo-czułego Gal80 (Gal80^ts, McGuire et al., 2003) może prowadzić do wytworzenia tub^P>stop>Gal80^ts lub tub^P>Gal80^ts>, co zapewnia dodatkową elastyczność czasową w manipulacji obwodami. Poza układem nerwowym metoda FINGR jest równie przydatna do ograniczania ekspresji Gal4 w podzbiorach komórek, niezależnie od tego, czy chodzi o skrzydło, czy odnogę.

Linie ET-FLPx2 będą cennym zasobem dla wszystkich biologów badających Drosophila, zainteresowanych analizą klonalną opartą na systemie FRT/FLP (Xu & Rubin, 1993), w tym metodą MARCM (Lee & Luo, 1999). Przewiduje się również, że niektóre linie ET-FLPx2 mogą zastąpić heatshock-FLP w celu generowania powtarzalnych klonów oraz do wielokrotnych analiz morfologicznych i behawioralnych. Podobnie jak w przypadku linii Gal4 z pułapką enhancerową, większość linii ET-FLPx2 prawdopodobnie nie będzie wykaziwać ekspresji specyficznie w komórkach będących przedmiotem zainteresowania. Większość linii będzie exprimować FLP w komórkach docelowych ORAZ w innych komórkach lub tkankach. Jednak brak „specyficzności tkankowej” zarówno Gal4, jak i ET-FLPx2 nie będzie stanowił istotnego problemu dla metody FINGR, dopóki obszar ich nakładania się jest pożądany w konkretnym eksperymencie. Metoda FINGR została zaprojektowana tak, aby przekształcić dwa „szerokie” systemy w jeden precyzyjny.

Metody przedstawione w tych protokołach są dość standardowe i powinny być powtarzalne. Główne kroki wymagające szczególnej uwagi dotyczą wyboru i zastosowania utrwalacza. Należy unikać utrwalaczy innych niż PFA, ponieważ mogą one wygasić sygnał GFP. Zauważyliśmy również, że do utrwalania za pomocą PFA nie należy używać szalki do sekcji, aby uniknąć możliwości, w których ekspresja FLP nie będzie wiarygodnie raportowana przez GFP.