Zmodyfikowany test oparty na embrionalnych komórkach macierzystych myszy do ilościowego określania skuteczności indukcji kardiogennej

Summary

Opisujemy użycie testu opartego na mysich komórkach ES do identyfikacji krytycznych okien czasowych dla aktywacji sygnału Wnt/β-kateniny i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda zapewnia ustandaryzowaną platformę, która wiarygodnie określa ilościowo wydajność kardiogenną i ma zastosowanie do badania innych linii komórkowych.

Abstract

Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych jest ściśle kontrolowane przez czasową i przestrzenną regulację wielu kluczowych szlaków sygnałowych. Jedną z przeszkód w jego zrozumieniu były zróżnicowane metody korelacji zmian kluczowych zdarzeń sygnalizacyjnych ze skutecznością różnicowania. Opisujemy tutaj zastosowanie testu opartego na mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ES) do identyfikacji krytycznych okien czasowych dla aktywacji sygnału Wnt / β-kateniny i BMP podczas indukcji kardiogennej. Oceniając kurczące się ciała embrionalne (EB) w formacie płytki 96-dołkowej, możemy szybko określić ilościowo wydajność kardiogenną i zidentyfikować kluczowe okna czasowe dla aktywacji sygnału Wnt/β-kateniny i BMP w czasie następującym po określonych zabiegach modulatorowych. Przedstawiona tutaj zasada nie ogranicza się tylko do indukcji serca i może być zastosowana do badania wielu innych linii komórkowych. Ponadto format 96-dołkowy ma potencjał do dalszego rozwoju jako wysokowydajny, zautomatyzowany test, który pozwoli na testowanie bardziej wyrafinowanych hipotez eksperymentalnych.

Protocol

1. Tworzenie ciała embrionalnego (EB) przy użyciu 96-okrągłych płytek do mikromiareczkowania z denną studzienką

1. Hoduj mysie komórki ES na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowych z mysim podłożem z komórek ES uzupełnionym LIF.
2. Gdy komórki ES są gotowe do użycia (zwykle przy 50-70% zbiegu), usuń pożywkę ES i przepłucz komórki raz 5 ml sterylnego PBS.
3. Dodać 2 ml 0,05% trypsyny / EDTA do każdej płytki i inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 3 ̃5 minut, ugasić trypsynę EDTA za pomocą 3 ml pożywki ES.
4. Przenieś komórki do probówek sokoła o pojemności 50 ml i wiruj z prędkością 1000 obr./min przez 3 minuty.
5. Usuń supernatant i ponownie zawieś osad komórkowy z żądaną ilością pożywki EB.
6. Policz liczbę komórek i rozcieńcz komórki do 5 x 10³ komórek/ml w pożywce EB.
7. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl pożywki EB zawierającej komórki do każdej studzienki z 96 okrągłymi płytkami do mikromiareczkowania.
8. Umieścić 96 okrągłych płytek do mikromiareczkowania w inkubatorze.

2. Identyfikacja krytycznych okien czasowych kluczowych szlaków sygnałowych dla kardiogenezy

1. Dodaj modulatory określonych ścieżek sygnałowych i kontroli nośnika do każdej studzienki 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych zawierających komórki ES w różnych punktach czasowych, takich jak dzień 0, dzień 1, dzień 2, dzień 3 i dzień 4 itd. Połowa studzienek w każdej płytce 96-dołkowej (48 dołków) jest używana dla każdego punktu początkowego leczenia.
2. Wypłukać modulatory, zmieniając media EB dla każdych 48 dołków w różnych punktach czasowych zatrzymania. Na przykład, aby uzyskać dwudniowe leczenie komórek ES począwszy od dnia 0, należy wypłukać modulatory w dniu 2. W przypadku każdego zabiegu dłuższego niż 48 godzin, należy zmieniać pożywki EB uzupełnione nowymi modulatorami co dwa dni, aż do pożądanych punktów czasowych zatrzymania.
3. Zbadaj skurcz EB pod mikroskopem po 7 dniu. Oceń dołki z zakontraktowanymi EB jako pozytywne, aby uzyskać procent zachorowania EB dla każdego z różnych przebiegów leczenia.
4. Krytyczne punkty czasowe dla kardiogenezy ES to ramy czasowe, w których występował najwyższy odsetek zachorowań na EB leczonych modulatorami sygnalizacji w porównaniu z grupą kontrolną pojazdu.

3. Weryfikacja okien czasowych sygnalizacji dla kardiogenezy w EB wykonanych z wiszących kropelek

1. Przygotuj szalki Petriego, dodając 3-4 ml PBS, aby zapobiec parowaniu.
2. Wykonaj kroki 1.1 ̃ 1.5, aby przygotować komórki ES o końcowej gęstości komórek 2,5x10⁴ / ml.
3. Wlej mieszaninę komórek do naczynia bakteryjnego, aby uzyskać łatwy dostęp. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 20 μl kropli (zawierających około 500 komórek) na odwrócone pokrywki. Nie pozwól, aby poszczególne kropelki się stykały. Generalnie jedna pokrywka może pomieścić do 80 kropli. Odwróć pokrywkę z powrotem na naczynie zawierające PBS. Inkubować przez 24 godziny lub 48 godzin, aby umożliwić tworzenie się EB w inkubatorze.
4. Uporanie EB utworzonej z kropelek zwisających z każdej pokrywki za pomocą 3 ml pożywki EB i puli 2 pokrywek EB na nową szalkę Petriego. Dodaj pożywkę EB do całkowitej objętości 10 ml.
5. Przenieść EB w zawiesinie na 0,2% pokryte żelatyną płytki 6-dołkowe w 4 dniu. Ogólnie rzecz biorąc, do każdej studni przenosi się 30 EB. Dodaj pożywkę EB, aby uzyskać końcową objętość 2 ml dla każdego dołka.
6. Inkubuj modulatory sygnalizacji w okresie określonym na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych.
7. Obserwuj skurcz EB pod mikroskopem po 7 dniu, a kardiogenezę można dodatkowo scharakteryzować za pomocą RT-PCR, barwienia immunologicznego i innych, jeśli to konieczne.

Discussion

Metoda wiszącej kropli jest konwencjonalną metodą stosowaną do tworzenia EB i różnicowania in vitro. Jest to jednak pracochłonne i ogranicza elastyczność eksperymentalną ze względu na problemy logistyczne. Z tego samego powodu wyniki są również trudniejsze do zweryfikowania, ponieważ umiejętności eksperymentatora mają kluczowe znaczenie dla udanego tworzenia EB i manipulacji w postaci wiszących kropli. Prostszą metodą jest formowanie EB w okrągłodennej 96-dołkowej płytce w jednoetapowym procesie. Format ten pozwala na standaryzację różnicowania in vitro i może dostosować się do większej liczby warunków eksperymentalnych ze względu na łatwość tworzenia EB i dalszej manipulacji (np. dodawanie lub usuwanie modulatora). Co więcej, format płytki 96-dołkowej można zoptymalizować tak, aby był skutecznym narzędziem do badań przesiewowych w mysich komórkach ES.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Głównie używane są komórki CGR8 myszy.
ES medium: Pożywka GMEM uzupełniona o 10% inaktywowany termicznie FBS, 2 mM L-glutaminy, 0,05 mM 2-mercapt– tanol i 200 U/ml mysiego LIF.
EB podłoże: Przygotuj pożywkę IMDM z 20% inaktywowanym termicznie FBS, 1,6 mM L-glutaminy, 0,08 mM 2-mercapt– tanol i 1X MEM Nieistotny roztwór aminokwasów.