Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.
Artykuł metodologiczny
Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych jest ściśle kontrolowane przez regulację czasową i przestrzenną wielu kluczowych szlaków sygnalizacyjnych. Jedną z przeszkód w zrozumieniu tego procesu były zróżnicowane metody korelacji zmian w kluczowych zdarzeniach sygnalizacyjnych z wydajnością różnicowania. Opisujemy tutaj wykorzystanie testu opartego na mysich embrionalnych komórkach macierzystymi (ES) w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych dla aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogenicznej. Poprzez ocenę kurczliwych ciałek embrionalnych (EB) w formacie płytki 96-dołkowej, możemy szybko określić ilościowo wydajność kardiogenną i zidentyfikować kluczowe okna czasowe dla aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP w przebiegu czasowym po zastosowaniu specyficznych modulatorów. Przedstawiona tutaj zasada nie ogranicza się wyłącznie do indukcji kardiogennej i może być zastosowana w badaniach nad wieloma innymi liniami komórkowymi. Ponadto format 96-dołkowy ma potencjał do dalszego rozwoju jako wysokoprzepustowy, zautomatyzowany test, umożliwiający weryfikację bardziej złożonych hipotez eksperymentalnych.
Protokół
1. Tworzenie ciałek embrionalnych (EB) z wykorzystaniem 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych z półkolistym dnem
- Hodować mysie komórki ES na 10-centymetrowych płytkach do hodowli komórkowej w pożywce do mysich komórek ES uzupełnionej o LIF.
- Gdy komórki ES będą gotowe do użycia (zazwyczaj przy 50-70% konfluencji), usunąć pożywkę ES i raz przepłukać komórki 5 ml sterylnego PBS.
- Dodać 2 ml 0,05% trypsyny / EDTA do każdej płytki i inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 3˜5 minut, a następnie zneutralizować trypsynę EDTA za pomocą 3 ml pożywki ES.
- Przenieść komórki do probówek Falcon o pojemności 50 ml i wirować przy 1000 rpm przez 3 minuty.
- Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy pożąganą ilością pożywki EB.
- Policzyć liczbę komórek i rozcieńczyć komórki w pożywce EB do stężenia 5 x103 komórek/ml.
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 100μl pożywki EB zawierającej komórki do każdego dołka 96-dołkowych okrągłych płytek mikrotitracyjnych.
- Umieścić 96-dołkowe okrągłe płytki mikrotitracyjne w inkubatorze.
2. Identyfikacja krytycznych okien czasowych kluczowych szlaków sygnalizacyjnych dla kardiogenezy
- Do każdego dołka 96-dołkowych płytek mikrotitracyjnych zawierających komórki ES w różnych punktach czasowych, takich jak dzień 0, dzień 1, dzień 2, dzień 3, dzień 4 itd., dodać modulatory specyficznych szlaków sygnalizacyjnych oraz kontrolę nośnikiem. Połowa dołków w każdej 96-dołkowej płytce (48 dołków) jest wykorzystywana dla każdego początkowego punktu czasowego traktowania.
- Wypłukać modulatory poprzez wymianę pożywki EB dla każdych 48 dołków w różnych punktach końcowych. Na przykład, aby uzyskać dwudniowy czas traktowania komórek ES rozpoczynający się w dniu 0, modulatory należy wypłukać w dniu 2. W przypadku każdego traktowania trwającego dłużej niż 48 godzin, wymieniać pożywkę EB uzupełnioną o świeże modulatory co dwa dni aż do osiągnięcia pożądanych punktów końcowych.
- Po 7 dniu zbadać skurcze ciał embroidalnych (EB) pod mikroskopem. Dołki z kurczących się EB ocenić jako pozytywne, aby obliczyć procent kurczących się EB dla każdego z różnych przebiegów czasowych traktowania.
- Krytyczne punkty czasowe dla kardiogenezy komórek ES to przedziały czasowe, w których odnotowano najwyższy procent kurczących się EB traktowanych modulatorami sygnalizacji w porównaniu z kontrolą nośnikiem.
3. Weryfikacja okien czasowych sygnalizacji dla kardiogenezy w ciałach embryoidalnych (EB) wytworzonych z wiszących kropel
- Przygotować szalki Petriego, dodając do nich 3-4 ml PBS w celu zapobiegania odparowywaniu.
- Postępować zgodnie z krokami 1.1 ˜ 1.5, aby przygotować komórki ES o końcowej gęstości 2,5x104 komórek / ml.
- Przelać mieszaninę komórek do szalki bakteriologicznej dla łatwiejszego dostępu. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść krople o objętości 20 μl (zawierające około 500 komórek) na odwrócone pokrywki. Należy dopilnować, aby poszczególne krople nie stykały się ze sobą. Zazwyczaj na jednej pokrywce można zmieścić do 80 kropli. Przykryć szalkę z PBS ponownie pokrywką. Inkubować w inkubatorze przez 24 lub 48 godzin, aby umożliwić formowanie się ciał embroidalnych (EB).
- Zmyć uformowane EB z wiszących kropli z każdej pokrywki za pomocą 3 ml pożywki EB i zebrać EB z dwóch pokrywek do nowej szalki Petriego. Dodać pożywkę EB do uzyskania całkowitej objętości 10 ml.
- W 4. dniu przenieść EB w zawiesinie na płytki 6-dołkowe pokryte 0,2% żelatyną. Zazwyczaj do każdego dołka przenosi się 30 EB. Dodać pożywkę EB, aby uzyskać końcową objętość 2 ml dla każdego dołka.
- Inkubować z modulatorami sygnalizacji w okresie czasu określonym na podstawie eksperymentów na płytkach 96-dołkowych.
- Obserwować skurcze EB pod mikroskopem po 7. dniu; w razie potrzeby kardiogenezę można dalej charakteryzować za pomocą RT-PCR, immunobarwienia i innych metod.
Dyskusja
Metoda wiszącej kropli jest konwencjonalną metodą stosowaną do tworzenia ciał embrynoidalnych (EB) i różnicowania in vitro. Jest ona jednak pracochłonna i ogranicza elastyczność eksperymentalną ze względu na kwestie logistyczne. Równie istotne jest to, że wyniki są trudniejsze do walidacji, ponieważ umiejętności eksperymentatora są kluczowe dla sukcesu tworzenia i manipulowania EB w wiszących kroplach. Prostszą metodą jest tworzenie EB w płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem jako proces jednoczynnościowy. Taki format pozwala na standaryzację różnicowania in vitro i umożliwia zastosowanie większej liczby warunków eksperymentalnych dzięki łatwości tworzenia EB i późniejszych manipulacji (np. dodawaniu lub usuwaniu modulatorów). Ponadto format płytki 96-dołkowej może zostać zoptymalizowany jako wydajne narzędzie przesiewowe dla komórek ES myszy.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty Veterans Affairs oraz NIH 5U01HL100398 i 1R01HL104040.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Głównie stosuje się mysie komórki CGR8. | |||
| Pożywka ES: pożywka GMEM uzupełniona o 10% inaktywowanego ciepłem FBS, 2 mM L-glutaminy, 0,05 mM 2-merkapto–etanolu oraz 200 U/ml mysiego LIF. | |||
| Pożywka EB: przygotować pożywkę IMDM z 20% inaktywowanego ciepłem FBS, 1,6 mM L-glutaminy, 0,08 mM 2-merkapto–etanolu oraz 1X roztworem nieessentialnych aminokwasów MEM. |
Bibliografia
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
Przedruki i uprawnienia
