Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Podsumowanie

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Streszczenie

Analiza oddziaływań między lipidami a białkami jest trudna, ponieważ lipidy są osadzone w błonach komórkowych, co czyni je niedostępnymi dla większości procedur oczyszczania. Jako alternatywę można zastosować powlekanie płaskich powierzchni lipidami, co wykorzystuje się w testach lipid ELISA oraz spektroskopii rezonansu plazmonowego. Jednak lipidy powlekające powierzchnię nie tworzą struktur mikrodomen, które mogą mieć istotne znaczenie dla właściwości wiązania lipidów. Ponadto metody te nie pozwalają na oczyszczenie większych ilości białek wiążących się z ich docelowymi lipidami.

Aby przezwyciężyć ograniczenia w badaniu oddziaływań białek z lipidami oraz w celu oczyszczania białek wiążących lipidy, opracowaliśmy nową metodę nazwaną chromatografią powinowactwa wspomaganą pęcherzykami lipidowymi z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS). W tej metodzie pęcherzyki lipidowe przygotowuje się z lipidem docelowym oraz fosfatydyloseryną, która służy jako lipid kotwiczący dla MACS z użyciem Annexiny V. Fosfatydyloseryna jest powszechnie występującym fosfolipidem błon komórkowych, który wykazuje wysokie powinowactwo do białka Annexina V. Dzięki zastosowaniu kulek magnetycznych sprzężonych z Annexiną V pęcherzyki lipidowe zawierające fosfatydyloserynę wiążą się z tymi kulkami. Podczas inkubacji pęcherzyków lipidowych z lizatem komórkowym białko wiążące lipid docelowy zostanie również przywiązane do kulek i może zostać współoczyszczone przy użyciu MACS. Metoda ta może być również wykorzystana do sprawdzenia, czy białka rekombinowane odtwarzają kompleks białkowy wiążący lipid docelowy.

Metodę tę wykorzystaliśmy do wykazania interakcji atypowej PKC (aPKC) ze sphingolipidem ceramidą oraz do współoczyszczania białka prostate apoptosis response 4 (PAR-4), które wiąże się z aPKC związaną z ceramidą. Zastosowaliśmy również tę metodę do rekonstrukcji kompleksu rekombinowanej aPKC związanej z ceramidą z białkami Par6 i Cdc42, które biorą udział w regulacji polarności komórkowej. Ponieważ pęcherzyki lipidowe można przygotować z różnymi sfingolipidami lub fosfolipidami, LIMACS stanowi wszechstronne narzędzie do badania interakcji białko-lipid w środowisku lipidowym, które ściśle przypomina błonę komórkową. Dodatkowe kompleksy białkowo-lipidowe można zidentyfikować za pomocą analizy proteomicznej białek wiążących lipidy, współoczyszczonych z pęcherzykami lipidowymi.

Protokół

1. Wstęp

Technika chromatografii powinowactwa z wykorzystaniem pęcherzyków lipidowych i magnetycznego sortowania komórek (LIMACS) została opracowana w naszym laboratorium w celu izolacji kompleksów białkowych związanych z ceramidami ^1-3. Pierwotnie pęcherzyki lipidowe tworzono z ceramidu i fosfatydyloseryny, co umożliwiało zastosowanie MACS z użyciem cząsteczek magnetycznych sprzężonych z Aneksyną V (wykazującą wysokie powinowactwo do fosfatydyloseryny) w celu izolacji pęcherzyków i powiązanych z nimi białek. Technikę LIMACS wykorzystaliśmy do rekonstrukcji in vitro kompleksu polarności związanego z ceramidami oraz do izolacji białek wiążących ceramidy z lizatów komórkowych ³. Metodę LIMACS można modyfikować, stosując inne partnery interakcyjne do izolacji pęcherzyków (np. lektyny specyficzne dla glikolipidów lub przeciwciała przeciwlipidowe).

2. Procedury eksperymentalne

Przygotowanie pęcherzyków lipidowych i testy wiązania aPKC

1. Pęcherzyki lipidowe otrzymuje się z wysuszonych mieszanin ekvimolarnych ilości fosfatydyloseryny (105 μg) i ceramidu C16 (85 μg) zgodnie z zmodyfikowanymi procedurami przygotowania dużych liposomów ^1,4-7.
2. Mieszaniny lipidowe są następnie resuspensowane i poddawane sonikacji przez 1 h w 100 μl buforu do pęcherzyków składającego się z 50 mM Tris/HCl (pH 7.5) i 150 mM NaCl.
3. Po dodaniu 300 μl buforu do pęcherzyków uzupełnionego o 0.1 mM MnCl₂, próbki są wirowane przy 12,000 μg przez 20 min w 4 °C.
4. Osad (duże pęcherzyki lipidowe) jest resuspensowany w 100 μl buforu do pęcherzyków i inkubowany z 1 nmol Vybrant CM-diI przez 1 h w 37 °C w celu wizualizacji frakcji pęcherzyków po separacji MACS. Vybrant CM-diI jest czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym, który specyficznie wbudowuje się w membrany lipidowe.
5. Lizat komórkowy wolny od detergentów przygotowuje się poprzez sonikację/homogenizację komórek w 300 μl buforu hipotonicznego (10 mM Tris/HCl (pH 7.0) z inhibitorami proteaz i fosfataz), a następnie usuwa się szczątki błonowe poprzez wirowanie. Należy dodać etap wirowania przy 100,000xg przez 1 h, aby uniknąć zanieczyszczenia lizatu komórkowego endogennymi błonami zawierającymi fosfatydyloserynę.
6. Oczyszczony lizat dodaje się do zawiesiny pęcherzyków lipidowych, a mieszaninę inkubuje przez 2 h w 4 °C.
7. Mieszaninę reakcyjną uzupełnia się o 20 μl 20-krotnego buforu wiążącego Anneksynę V oraz 50 μl roztworu zawierającego kulki magnetyczne sprzężone z Anneksyną V, a następnie inkubuje przez 1 h w 4 °C.
8. Procedurę MACS przeprowadza się zgodnie z protokołem producenta (Miltenyi Biotec, Inc.). Obecność i ilość pęcherzyków lipidowych określa się poprzez monitorowanie fluorescencji Vybrant CM-diI we frakcjach przepływowych i elucyjnych przy użyciu mikro płytkowego czytnika fluorescencji.
9. Liniową korelację między ilością lipidów pęcherzykowych a intensywnością fluorescencji Vybrant CM-diI związanego z pęcherzykami weryfikuje się za pomocą ilościowej cienkowarstwowej chromatografii wysokosprawnej (HPTLC) mieszaniny lipidowej zastosowanej w MACS opartej na Anneksynie V.
10. Specyficzność reakcji wiązania aPKC lub innych białek do pęcherzyków ceramid/fosfatydyloseryna jest weryfikowana za pomocą testu konkurencji przeciwciał, stosując 1 μg króliczego poliklonalnego przeciwciała anty-PKCζ do inkubacji lizatu komórkowego przez 1 h w 4 °C przed inkubacją z pęcherzykami lipidowymi.
11. Wiązanie białek do pęcherzyków ceramid/fosfatydyloseryna w eluacie MACS analizuje się za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu.

In vitro kompleks polarności lipidowo-białkowej

1. Rekonstytucja in vitro kompleksu polarności lipidowo-białkowego jest przeprowadzana zgodnie z procedurą LIMACS opisaną w poprzedniej sekcji. W skrócie: fosfatydyloserynę (420 μg) i ceramid C16 (107 μg) wysusza się z rozpuszczalnika organicznego.
2. Wysuszone lipidy resuspenduje się podczas sonikacji w 500 μl buforu pęcherzykowego (50 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl).
3. Dodaje się pięć μl 10 mM MnCl2, 1 μl Vybrant CM-diI oraz 500 ng PKCζ (rekombinowany ludzki), a mieszaninę reakcyjną inkubuje się przy łagodnym mieszaniu przez 60 min w 4 °C.
4. Pęcherzyki fosfatydyloseryny/ceramidu znakowane barwnikiem Vybrant CM-diI odzyskuje się poprzez wirowanie przy 12,000xg przez 60 min w 4 °C.
5. Osad (różowy) resuspenduje się w 100 μl buforu Tris i uzupełnia o γS-GTP (100 μM), GDP (1 mM), GST-Par6 (100 ng) lub GST-Cdc42 (500 ng), a następnie inkubuje przez 3 h w 4 °C (w tym miejscu można zastosować dowolną inną kombinację interesujących białek rekombinowanych).
6. Dodaje się bufor do Anneksyny V (5 μl roztworu stokowego 20x) oraz kulki magnetyczne sprzężone z Anneksyną V (50 μl), a mieszaninę reakcyjną inkubuje przy łagodnym mieszaniu przez kolejne 30 min w 4 °C.
7. Procedurę Annexin V-MACS przeprowadza się zgodnie z protokołem dostawcy opisanym wcześniej.
8. Frakcję elucyjną (1 ml) uzupełnia się o 10 μg czystej owalbuminy jako czynnika wspomagającego wytrącanie. Białko zagęszcza się metodą wytrącania Wessel-Flugge i analizuje za pomocą SDS-PAGE/immunoblottingu zgodnie z wcześniejszym opisem ⁸.
9. Ilość eluowanych pęcherzyków lipidowych określa się poprzez detekcję Vybrant CM-diI (kolor różowy) w fazie organicznej (chloroform/metanol) reakcji wytrącania Wessel Flugge. Ilość analizowanego białka normalizuje się względem równych ilości pęcherzyków lipidowych.

3. Wyniki

Oczyszczanie PKCζ-EGFP oraz domeny wiążącej ceramid C20ζ-EGFP metodą LIMACS

Lizat komórek MDCK niezawierający detergentu, wyrażający pełnowymiarowy PKCζ z C-końcowym połączeniem z zielonym białkiem fluorescencyjnym (FLζ-EGFP) lub domenę wiążącą ceramid na C-końcu PKCζ (C20ζ-EGFP), inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu zgodnie z opisem w Procedurach Eksperymentalnych. Po elucji z kolumny MACS białko analizowano za pomocą immunoblottingu, stosując przeciwciała przeciwko PKCζ oraz EGFP w celu wykrycia elucjowanego białka ².

Rysunek 1. LIMACS PKCζ znakowanej EGFP oraz jej fragmentu C-końcowego C20ζ z wykorzystaniem pęcherzyków fosfatydyloserynowych/ceramidowych.

Lizaty komórek MDCK niezawierające detergentów, wykazujące ekspresję EGFP (jako kontrolę niewiążącą), pełnej białka PKCζ-EGFP lub wiążącego ceramid fragmentu C-końcowego C20ζ-EGFP, inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu zgodnie z opisem w sekcji Procedury Eksperymentalne. Po zastosowaniu metody LIMACS białko eluowano buforem do próbek SDS i analizowano za pomocą SDS-PAGE oraz immunoblottingu. Lewy panel pokazuje, że EGFP nie wiązało się z pęcherzykami zatrzymanymi przez magnetyczne kulki sprzężone z Aneksyną V. Środkowy i prawy panel pokazują, że pełne PKCζ-EGFP oraz C20ζ-EGFP zostały zatrzymane w wyniku wiązania z ceramidem.

Dyskusja

Badanie specyficznej interakcji między lipidem a jego białkiem wiążącym jest utrudnione przez osadzenie lipidów w błonie komórkowej. Błona komórkowa składa się z mieszaniny kilku lipidów i białek i jest zorganizowana w lipidowe mikrodomeny lub tratwy. W związku z tym wspólne oczyszczanie mikrodomen i białek nie pozwala jednoznacznie rozstrzygnąć, czy białko wiąże się bezpośrednio z lipidem, czy jest jedynie wzbogacone w strukturze mikrodomeny. Inne metody z wykorzystaniem określonych lipidów naniesionych na powierzchnie,...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kuleczki magnetyczne sprzężone z Anneksyną V oraz mikrokolumny i minikolumny MACS	Miltenyi Biotec
Lipidy (o najwyższej czystości)	Avanti Polar Lipid, Inc