Chromatografia powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (LIMACS): nowa metoda analizy interakcji białko-lipid

Podsumowanie

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, użyliśmy MACS i Aneksyny V-sprzężonych z kulkami magnetycznymi i pęcherzykami lipidowymi syntetyzowanymi z docelowego lipidu i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z docelowym lipidem są współoczyszczane i analizowane po wyelucji z kulek.

Streszczenie

Analiza interakcji białek lipidowych jest trudna, ponieważ lipidy są osadzone w błonach komórkowych i dlatego są niedostępne dla większości procedur oczyszczania. Alternatywnie, lipidy mogą być powlekane na płaskich powierzchniach, tak jak w przypadku spektroskopii lipidowej ELISA i spektroskopii rezonansu plazmonowego. Jednak lipidy powlekające powierzchnię nie tworzą struktur mikrodomenowych, co może mieć znaczenie dla właściwości wiązania lipidów. Co więcej, metody te nie pozwalają na oczyszczanie większych ilości białek wiążących się z docelowymi lipidami.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia w testowaniu interakcji białek lipidowych i oczyścić białka wiążące lipidy, opracowaliśmy nową metodę zwaną chromatografią powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych, wykorzystującą sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (LIMACS). W tej metodzie pęcherzyki lipidowe są przygotowywane z docelowym lipidem i fosfatydyloseryną jako lipidem kotwiczącym dla MACS aneksyny V. Fosfatydyloseryna jest wszechobecnym fosfolipidem błony komórkowej, który wykazuje wysokie powinowactwo do białka Aneksyny V. Za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z aneksyną V pęcherzyki lipidowe zawierające fosfatydyloserynę zwiążą się z kulkami magnetycznymi. Gdy pęcherzyki lipidowe są inkubowane z lizatem komórkowym, białko wiążące się z docelowym lipidem również zostanie związane z kulkami i może być współoczyszczane za pomocą MACS. Metoda ta może być również stosowana do sprawdzania, czy rekombinowane białka odtwarzają kompleks białkowy wiążący się z docelowym lipidem.

Użyliśmy tej metody, aby pokazać interakcję atypowego PKC (aPKC) z ceramidem sfingolipidowym i wspólnie oczyścić odpowiedź na apoptozę prostaty 4 (PAR-4), białko wiążące się z aPKC związanym z ceramidami. Zastosowaliśmy również tę metodę do rekonstytucji związanego z ceramidami kompleksu rekombinowanego aPKC z białkami związanymi z polaryzacją komórek Par6 i Cdc42. Ze względu na to, że pęcherzyki lipidowe mogą być przygotowywane z różnymi sfingolipidami lub fosfolipidami, LIMACS oferuje wszechstronny test interakcji lipid-białko w środowisku lipidowym, które bardzo przypomina środowisko błony komórkowej. Dodatkowe kompleksy białek lipidowych można zidentyfikować za pomocą analizy proteomicznej białka wiążącego lipidy oczyszczonego z pęcherzykami lipidowymi.

Protokół

1. Wprowadzenie

Chromatografia powinowactwa za pośrednictwem pęcherzyków lipidowych przy użyciu techniki sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (LIMACS) została opracowana w naszym laboratorium w celu izolowania kompleksów białkowych związanych z ceramidami ^1-3. Pierwotnie pęcherzyki lipidowe były zbudowane z ceramidu i fosfatydyloseryny, co pozwoliło na MACS przy użyciu magnetycznej aneksyny V sprzężonej z cząstkami magnetycznymi (wysoce afininy do fosfatydyloseryny) do izolacji pęcherzyków i związanych z nimi białek. Zastosowaliśmy technikę LIMACS do odtworzenia in vitro kompleksu polarności związanego z ceramidami oraz izolacji białek wiążących ceramidy z lizatów komórkowych ³. LIMACS może być modyfikowany przy użyciu innych partnerów interakcji do izolacji pęcherzyków (np. lektyn specyficznych dla glikolipidów lub przeciwciał lipidowych).

2. Procedury eksperymentalne

Przygotowanie pęcherzyków lipidowych i testów aPKCBinding

1. Pęcherzyki lipidowe otrzymuje się z wysuszonych mieszanin równomolowych ilości fosfatydyloseryny (105 μg) i ceramidu C16 (85 μg) zgodnie ze zmodyfikowanymi procedurami dla preparatu dużych liposomów ^1,4-7.
2. Mieszaniny lipidów są następnie ponownie zawieszane i sonikowane przez 1 godzinę w 100 μl buforu pęcherzykowego składającego się z 50 mM Tris/HCl (pH 7,5) i 150 mM NaCl.
3. Po dodaniu 300 μl buforu pęcherzykowego uzupełnionego 0,1 mM MnCl₂, próbki odwirowuje się przy 12 000 μg przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
4. Osad (duże pęcherzyki lipidowe) zawiesza się ponownie w 100 μl buforu pęcherzykowego i inkubuje z 1 nmol Vybrant CM-diI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu uwidocznienia frakcji pęcherzyków po oddzieleniu MACS. Vybrant CM-diI to czerwony barwnik fluorescencyjny specjalnie wbudowujący się w błony lipidowe.
5. Wolny od detergentów lizat komórkowy jest wytwarzany przez sonikację/homogenizację komórek w 300 μl hipotonicznego buforu (10 mM Tris/HCl (pH 7,0) z inhibitorami proteazy i fosfatazy), a następnie usunięcie błoniastych szczątków przez odwirowanie. Należy dodać etap wirowania przy 100 000 xg przez 1 godzinę, aby uniknąć zanieczyszczenia lizatu komórkowego endogennymi błonami zawierającymi fosfatydyloserynę.
6. Oczyszczony lizat dodaje się do zawiesiny pęcherzyków lipidowych i mieszaninę inkubuje się przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Mieszaninę reakcyjną uzupełnia się 20 μl 20x buforu wiążącego anektynę V i 50 μl roztworu zawierającego kulki magnetyczne sprzężone z aneksyną V, a następnie inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
8. MACS jest wykonywany zgodnie z protokołem producenta (Miltenyi Biotec, Inc.). Obecność i ilość pęcherzyków lipidowych określa się poprzez monitorowanie fluorescencji Vybrant CM-diI we frakcjach przepływowych i elucyjnych za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytki.
9. Liniowa korelacja między ilością lipidów pęcherzykowych a intensywnością fluorescencji związanego z pęcherzykami Vybrant CM-diI jest weryfikowana za pomocą ilościowej wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) mieszaniny lipidowej zastosowanej do MAC na bazie aneksyny V.
10. Specyficzność reakcji wiązania aPKC lub innych białek z pęcherzykami ceramidu/fosfatydyloseryny weryfikuje się za pomocą testu konkurencji przeciwciał przy użyciu 1 μg króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-PKCζ w celu inkubacji lizatu komórkowego przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przed inkubacją z pęcherzykami lipidowymi.
11. Wiązanie białka z pęcherzykami ceramidu/fosfatydyloseryny w eluacie MACS jest analizowane za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu.

Kompleks polaryzacji lipidowo-białkowej in vitro

1. Rekonstytucję in vitro kompleksu polarności lipidowo-białkowego przeprowadza się zgodnie z procedurą LIMACS, jak opisano w poprzednim rozdziale. Krótko mówiąc, fosfatydyloseryna (420 μg) i ceramid C16 (107 μg) są suszone z rozpuszczalnika organicznego.
2. Wysuszone lipidy są ponownie zawieszane pod wpływem sonikacji w 500 μl buforu pęcherzykowego (50 mM Tris/HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl).
3. Dodaje się pięć μl 10 mM MnCl2, 1 μl Vybrant CM-diI i 500 ng PKCζ (rekombinantu ludzkiego), a mieszaninę reakcyjną inkubuje się pod delikatnym mieszaniem przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
4. Barwione pęcherzyki fosfatydyloseryny/ceramidu Vybrant CM-diI są odzyskiwane przez odwirowanie w temperaturze 12 000 xg przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
5. Osad (różowy) zawiesza się ponownie w 100 μl buforze Tris i uzupełnia γS-GTP (100 μM), GDP (1 mM), GST-Par6 (100 ng) lub GST-Cdc42 (500 ng) i dalej inkubuje przez 3 godziny w temperaturze 4 °C (można tu zastosować dowolną inną kombinację białek rekombinowanych).
6. Dodaje się bufor V aneksyny (5 μl 20-krotnego roztworu podstawowego) i kulki magnetyczne sprzężone z anektyną V (50 μl), a mieszaninę reakcyjną inkubuje się pod delikatnym mieszaniem przez kolejne 30 minut w temperaturze 4 °C.
7. Aneksyna V-MACS jest wykonywana zgodnie z protokołem dostawcy, jak opisano powyżej.
8. Frakcję elucyjną (1 ml) uzupełnia się 10 μg czystej albuminy jaja kurzego jako środka wspomagającego wytrącanie. Białko jest zagęszczane przez wytrącanie Wessela-Flugge'a i analizowane za pomocą SDS-PAGE/immunoblotting, jak opisano wcześniej ⁸.
9. Ilość wymytych pęcherzyków lipidowych określa się ilościowo przez wykrycie Vybrant CM-diI (różowy) w fazie organicznej (chloroform/metanol) reakcji wytrącania Wessel Faggige. Ilość analizowanego białka jest normalizowana na równych ilościach pęcherzyków lipidowych.

3. Wyniki

LIMACS oczyszczanie PKCζ-EGFP i domeny wiążącej ceramidy C20ζ-EGFP

Bezdetergentowy lizat komórek MDCK, wyrażający na całej długości PKCζ C-terminal połączony z białkiem zielonej fluorescencji (FLζ-EGFP) lub domeną wiążącą ceramid na C-końcu PKCζ (C20ζ-EGFP) inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu, jak opisano w Procedurach Eksperymentalnych. Po elucji kolumny MACS białko analizowano za pomocą immunoblottingu i przeciwciał przeciwko PKCζ i EGFP w celu wykrycia eluowanego białka ².

Rysunek 1. LIMACS PKCζ znakowanego EGFP i jego C-końcowego fragmentu C20ζ przy użyciu pęcherzyków fosfatydyloseryny/ceramidu.

Wolne od detergentów lizaty komórek MDCK wyrażających EGFP (jako niewiążącą kontrolę), PKCζ-EGFP o pełnej długości lub wiążący ceramidy, C-końcowy fragment C20ζ-EGFP inkubowano z pęcherzykami fosfatydyloseryny/ceramidu, jak opisano w sekcji Procedury eksperymentalne. Po zastosowaniu LIMACS białko eluowano buforem próbki SDS i analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. Lewy panel pokazuje, że EGFP nie związał się z pęcherzykami zatrzymanymi za pomocą kulek magnetycznych połączonych z aneksyną V. Środkowy i prawy panel pokazuje, że PKCζ-EGFP i C20ζ-EGFP na całej długości zostały zachowane ze względu na wiązanie z ceramidem.

Dyskusja

Badanie specyficznej interakcji między lipidem a jego białkiem wiążącym jest utrudnione przez osadzanie się lipidów w błonie komórkowej. Błona komórkowa składa się z mieszaniny kilku lipidów i białek i jest zorganizowana w mikrodomeny lipidowe lub tratwy. W związku z tym jednoczesne oczyszczanie mikrodomen i białek nie może jednoznacznie rozróżnić, czy białko wiąże się bezpośrednio z lipidem, czy jest wzbogacone tylko w strukturę mikrodomeny. Inne metody wykorzystujące zdefiniowane lipidy powleczone na powierzchniach, ta...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aneksyna V-sprzężone kulki magnetyczne oraz mikro i minikolumny MACS	Miltenyi Biotec
Lipids (o najwyższej czystości)	Avanti Polar Lipid, Inc