Bezpośrednia obserwacja fagocytozy i tworzenia sieciy z neutrofili (NET) w zakażonych płucach przy użyciu mikroskopii dwufotonowej

Podsumowanie

Przedstawiamy sposób wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do obserwacji dynamiki granulocytów neutrofilnych w zainfekowanych płucach podczas fagocytowania patogenów lub wytwarzania zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NETs).

Streszczenie

Po przewodzie pokarmowym, płuca stanowią drugą pod względem powierzchni barierę oddzielającą organizm kręgowca od środowiska zewnętrznego. Musi w nich zachodzić efektywna wymiana gazowa, przy jednoczesnym unikaniu infekcji wywołanych przez liczne patogeny wdychane podczas normalnego oddychania. W celu osiągnięcia tego celu istnieje doskonały zestaw strategii obronnych łączących mechanizmy odporności humoralnej i komórkowej. Jedną z najskuteczniejszych metod ostrej obrony płuc jest rekrutacja neutrofili, które fagocytują wdychane patogeny lub zabijają je poprzez uwalnianie chemikaliów cytotoksycznych. Niedawnym uzupełnieniem arsenału neutrofili jest ich gwałtowne uwalnianie zewnątrzkomórkowego DNA – tzw. NETs, za pomocą których bakterie lub grzyby mogą zostać pochwycone lub unieczynnione, nawet po śmierci komórek uwalniających NETy. Przedstawiamy tutaj metodę pozwalającą na bezpośrednią obserwację neutrofili migrujących w niedawno zainfekowanych płucach, fagocytujących patogeny grzybicze, a także wizualizację rozległych NET-ów wytworzonych w zainfekowanej tkance. Metoda opisuje przygotowanie grubych, żywych skrawków płuc 7 godzin po infekcji wewnątrzoskrzelnej myszy konidiami pleśni Aspergillus fumigatus oraz ich badanie za pomocą wielokolorowej dwufotonowej mikroskopii time-lapse. Podejście to pozwala na bezpośrednie badanie obrony przeciwgrzybiczej w natywnej tkance płucnej, otwierając tym samym nową drogę do szczegółowego badania odporności płuc.

Protokół

1. Zakażanie

1. Opuchnięte konidia pleśni Aspergillus fumigatus (szczep ATCC 4645) są otrzymywane poprzez preinkubację w pożywce RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlin, Niemcy) z dodatkiem 5% FCS (v/v). 2x10⁷ spoczywające konidia resuspenduje się w 5 ml pożywki i inkubuje w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek (TPP AG; Trasadingen, Szwajcaria, nr katalogowy 9206) przez 7 h w temperaturze 37°C.
2. Po okresie pęcznienia zarodniki są znakowane fluorescencyjnie poprzez dodanie 10 μl roztworu stokowego calcofluor white (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Niemcy, katalog nr F3543; [25 mg/ml] w DMSO) do każdego Aspergillus zawierająca studnię w płytce 6-studzienkowej, osiągając końcowe stężenie calcofluoru wynoszące 50 μg/ml RPMI. Po delikatnym zmieszaniu zarodniki inkubuje się przez dodatkowe 15 min w 37 °C.
3. W następnym kroku zarodniki są zbierane poprzez filtrację przez 70 μm sitko do komórek (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy). Po jednorazowym przemyciu 10 ml PBS (centryfugowanie przy 90xg przez 5 min w temperaturze pokojowej) osad resuspensuje się w 2 ml PBS, a całkowitą liczbę napęczniałych konidiów określa poprzez liczenie przy użyciu komory Neubauera. Na koniec zawiesinę zarodników wiruje się przy 90xg przez 5 min w temperaturze pokojowej, ostrożnie usuwa nadpłyn, a osad resuspensuje do końcowego stężenia 1x107 zarodników na 100 μl PBS.
4. W przypadku infekcji, 100 μl roztworu zarodników podaje się wewnątrztachealnie samicom myszy (C57/BL6, w wieku 8–10 tygodni, Harlan, Niemcy). Jeśli planowana jest również obserwacja neutrofili, należy zastosować myszy Lys-EGFP, u których białko EGFP znajduje się pod promotorem lizozymu¹ zaleca się. Należy rozpocząć od znieczulenia zwierzęcia pojedynczym wstrzyknięciem doprzewłonowym (i.p.) 150 μl Roztwór ketaminy/Rompunu (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Niemcy (ketamina) i Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy (Rompun), 1 ml ketaminy [50 mg/ml] + 0,5 ml Rompunu [2%] + 3,5 ml sterylnego NaCl [0,9%]). Po 5 minutach znieczuloną mysz można przymocować za pomocą elastycznej opaski za zęby do rampy (tj. powierzchni pochyłej), aby ułatwić intubację (rysunek dodatkowy 1). Za pomocą pęsety odsuwa się język na bok, a następnie, przy stałym oświetleniu lampą typu „gęsia szyja”, można delikatnie wprowadzić do tchawicy kaniulę do dostępów żylnych 2G (B. Braun AG, Melsungen, Niemcy, Vasofix Braunüle). Prawidłowe wprowadzenie kaniuli potwierdza się, obserwując regularne ruchy klatki piersiowej zwierzęcia zgodnie z częstotliwością pracy respiratora mechanicznego. Po potwierdzeniu pomyślnej intubacji, 100 μl zawiesinę zarodników nanosi się za pomocą 100 μl mikropipetą. Objętość ta powinna zostać wchłonięta przez zwierzę bez dodatkowej pomocy w ciągu 1–2 s. Zwiększoną dystrybucję cząstek grzybów w płucach osiąga się poprzez mechaniczną wentylację zakażonego zwierzęcia przez 2 minuty przy użyciu respiratora dla małych zwierząt (MiniVent, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Niemcy) z częstotliwością 250 oddechów na minutę i objętością wdechową wynoszącą 300 μl na każdy oddech (rycina dodatkowa 2). Po zakażeniu zwierzęta są umieszczane z powrotem w klatkach i obserwowane co 5 minut, aż do odzyskania zdolności poruszania się. Myszy nie wykazują żadnych oznak bólu ani stresu podczas następującego po tym okresu inkubacji.

2. Przygotowanie płuc

1. 7 h po zakażeniu zarodnikami zwierzę zostaje uśpione poprzez przedawkowanie izofluranu (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Niemcy) aż do momentu ustania ruchów i oddechu na ponad 30 sekund. Następnie przeprowadza się torakotomię jako wtórną metodę potwierdzenia śmierci klinicznej oraz umożliwienia wizualizacji i dostępu do tchawicy i płuc. Następnie klatka piersiowa jest ostrożnie otwarta, aby odsłonić płuco i górne drogi oddechowe. Wówczas do tchawicy, zaczynając od odsłoniętej nagłośki, wprowadza się kolejny kaniulowany cewnik żylny 2G. Poprzez tę rurkę płuca są wypełniane 1 ml uprzednio ogrzanej agarozy niskotopliwej (2 % w/v, Promega, Mannheim, Niemcy) przy użyciu strzykawki 1 ml Omnifix (B.Braun). Gdy tylko płuca zostaną wypełnione, tchawica zostaje podwiązana krótkim kawałkiem nici chirurgicznej, a całe zwierzę zostaje umieszczone w lodówce w temperaturze 4 °C.
2. 15 min później, po zestaleniu się agarozy, cały płuc zostaje wycięty, zaczynając od tchawicy. Za pomocą ostrych nożyczek z czubkiem usuwany jest następnie prawy płat płuca; jego dolną powierzchnię krótko osuszono na arkuszu ręcznika papierowego, a następnie cały płat przyklejono do bloku preparacyjnego wibrotomu (Campden Instruments, UK, 752M Vibroslice) za pomocą kropli kleju tkankowego do fiksacji (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy, Roti-Coll 1). Po 1 min blok zostaje zainstalowany w komorze tnącej wibrotomu, która jest wypełniona schłodzonym (4°C) PBS. Wibrotom ustawiono na średnie wibracje (5 z max. 10) oraz umiarkowaną prędkość (5 z max. 10), tak aby uzyskać poziomy przekrój poprzeczny płuca. Górna połowa organu zostaje następnie przeniesiona do małej plastikowej płytki Petriego (5 cm średnicy), gdzie zostaje odwrócona i zamocowana za pomocą wykonanej samodzielnie płaskiej podkładki (1 cm średnicy wewnętrznej) przykrytej zestawem równoległych nici nylonowych, rozmieszczonych co 1 mm (rysunek dodatkowy 3). Na koniec płytkę Petriego wypełnia się 10 ml PBS z dodatkiem 10 μl barwnika DNA Sytox Orange [5 mM] (Invitrogen, Niemcy), co daje końcowe stężenie barwnika 5 μM.

3. Mikroskopia laserowa dwufotonowa

1. Szalkę Petri z próbką płuca umieszcza się następnie pod obiektywem mikroskopu, aby bufor mógł zostać podgrzany do 37°C za pomocą grzejnika sterowanego czujnikiem temperatury (rycina dodatkowa 4). Następnie przeprowadza się mikroskopię dwufotonową całej powierzchni cięcia przy użyciu mikroskopu Zeiss LSM 710 NLO na stojaku Axio Examiner wyposażonym w obiektyw zanurzeniowy 20xNA1.0 (Zeiss, Jena, Niemcy). W celu obrazowania skanuje się różne obszary wzdłuż przekroju do głębokości 40 μm przy długości fali oświetlenia 80 nm, wykrywając fluorescencję zieloną (530 nm) i czerwoną (580 nm), a także sygnał generacji drugiej harmonicznej (SHG) i niebieską fluorescencję calcofluoru (emisja 40–470 nm) za pomocą zewnętrznych detektorów niedeskanowanych (NDD). Poza obrazami 2D i filmami time-lapse (1 obraz co 5-10 sekund), pojedyncze lub powtarzalne stosy obrazów trójwymiarowych mogą być następnie renderowane jako rendery wokselowe, obrazy z rozszerzoną głębokością ostrości lub dane 4D (3D w czasie) przy użyciu różnych pakietów oprogramowania. Taki układ mikroskopowy pozwala na obserwację zachowania komórek w niemal nienaruszonym środowisku, które, stanowiąc port wejściowy dla wielu patogenów przenoszonych drogą powietrzną, ma ogromne znaczenie immunologiczne. W tych warunkach in situ można łatwo badać mobilność komórek, fagocytozę oraz produkcję NET przez endogenne neutrofile po zakażeniu pleśnią Aspergillus fumigatus.

4. Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym wykonaniu obrazowanie pozwoli na wygenerowanie slajdów lub filmów dwu- lub trójkolorowych. Chociaż kolorowanie odbywa się w procedurze postprocesowania i jest zatem w pełni modyfikowalne, zazwyczaj wybieramy schemat kolorów odzwierciedlający naturalny kolor barwnika/sygnału wykrywanego w odpowiednim kanale. W ten sposób barwniki Sytox przedstawiono w kolorze czerwonym, grzyba oraz sygnał SHG w kolorze niebieskim, a w przypadku ich obecności, komórki znakowane EGFP w kolorze zielonym. W pierwszym przykładzie (Rys. 1) niebieski sygnał SHG obrazuje włókna tkankowe nieinfected płuca, a czerwony sygnał Sytox jest generowany przez jądra komórek rezydentnych płuc przeciętych wibrotomem. W drugim przykładzie (Rys. 2) przedstawiono zainfekowane płuco, w którym zarówno struktury pęcherzykowe, jak i masy grzybicze pojawiają się w kolorze niebieskim, natomiast jądra komórkowe i NETy są zabarwione na czerwono. Trzeci przykład (Rys. 3) pochodzi od zwierzęcia transgenicznego Lys-EGFP, gdzie oprócz struktur niebieskich i czerwonych widoczne są również zielone neutrofile. Migracja neutrofili oraz ich fagocytoza poszczególnych elementów grzyba w sekwencjach poklatkowych została przedstawiona w filmie uzupełniającym.

Rycina 1. Wygląd niezinfekowanego skrawka płuca w dwukolorowej mikroskopii dwufotonowej. Przygotowano przekrój płuca z niezinfekowanej myszy C57/BL6, a następnie wykonano obrazowanie zgodnie z opisanym protokołem. Przedstawiono tutaj sygnał SHG struktury tkanki pęcherzykowej (A), sygnał Sytox jąder komórkowych uszkodzonych podczas przygotowania przekroju płuca (B) oraz nałożenie obu kanałów (C). Obszar zaznaczony ramką w (C) pokazano w powiększeniu w (D). Należy zwrócić uwagę na tkankę włóknistą w dolnej części przekroju płuca w porównaniu z wyraźną organizacją pęcherzykową w obszarach płuca aktywnych oddechowo znajdujących się powyżej.

Rycina 2. Wygląd skrawka płuca z Aspergillus zainfekowane zwierzę typu dzikiego w dwukolorowej mikroskopii dwufotonowej. przekrój płuca myszy C57/BL6 zainfekowanej 7 h wcześniej za pomocą A. fumigatus przygotowano i zobrazowano zgodnie z opisem w protokole. Przedstawiono połączoną strukturę grzybni i sygnał SHG tkanki pęcherzyków płucnych (A), sygnał Sytox dla NET-ów DNA oraz jąder komórkowych odsłoniętych podczas przygotowywania skrawka płuca (B) oraz nałożenie obu kanałów (C). Obszar zaznaczony ramką w (C) pokazano w powiększeniu w (D). Należy zwrócić uwagę, że wyraźnie odróżnialne obszary mas grzybni, pęcherzyków płucnych i struktur NET są oznaczone odpowiednio literami F, A i N.

Rycina 3. Wygląd przekroju płuca zwierzęcia Lys-EGFP zainfekowanego Aspergillus w trójkolorowej mikroskopii dwufotonowej. Przekrój płuca myszy Lys-EGFP zakażonej 7 h wcześniej A. fumigatus przygotowano i obrazowano zgodnie z opisem w protokole. Przedstawiono połączony obraz struktury grzyba i SHG tkanki pęcherzyków płucnych (kolor niebieski), sygnał Sytox jąder komórkowych i NET (kolor czerwony) oraz liczne neutrofile (kolor zielony).

Rycina dodatkowa 1. Unieruchomienie myszy do intubacji. W znieczuleniu ketaminą i Rompunem zwierzę zostaje unieruchomione za pomocą elastycznej opaski przy zębach, aby ułatwić intubację za pomocą cewnika dożylnego 2G.

Rycina uzupełniająca 2. Wentylacja mechaniczna myszy. Intubowaną mysz zakażono poprzez aplikację i.t. 1x10⁷ zarodniki resuspendowane w 100 μl PBS. Lepszą dystrybucję cząsteczek grzybów wewnątrz płuca uzyskuje się poprzez mechaniczną wentylację zakażonej myszy przy użyciu respiratora dla małych zwierząt.

Rycina dodatkowa 3. Fixacja płatów płuca. Po przygotowaniu prawego płata płuca organ unieruchamia się w szalce Petriego za pomocą wykonanej w laboratorium płaskiej podkładki, która jest pokryta zestawem równoległych nici nylonowych.

Rycina dodatkowa 4. Układ obrazowania dwufotonowego. Szalka Petri zawierająca prawy płat płuca zostaje umieszczona na macie grzejnej pod mikroskopem dwufotonowym po dodaniu barwnika DNA Sytox Orange.

Film uzupełniający: Neutrofile migrujące i fagocytujące elementy grzyba w płucach zainfekowanych Aspergillus, obserwowane za pomocą dwufotonowej mikroskopii poklatkowej żywego skrawka płuca 7 h po infekcji grzybiczej. Neutrofile są koloru zielonego, elementy grzyba oraz SHG są niebieskie, a jądra komórkowe oraz struktury NET są przedstawione w kolorze czerwonym. Rzeczywisty czas trwania eksperymentu jest wyświetlany w prawym dolnym rogu. Pasek skali odpowiada 50 μm.Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo

Dyskusja

Dwufotonowa mikroskopia obrazowania w czasie rzeczywistym in vivo lub w nienaruszonych organach zyskała ogromne znaczenie w badaniach nad fizjologią komórek odpornościowych w ciągu ostatnich 10 lat. To właśnie dzięki tej technice po raz pierwszy widoczne stały się kluczowe zdarzenia, takie jak dynamika aktywacji limfocytów T w węzłach chłonnych^2-4. W ostatnim czasie badacze zaczęli również wykorzystywać to podejście do analizy specyficznych funkcji komórkowych, takich jak pierwsze etapy powstawania komórek efektorowych w tkankach limfatycznych⁵.

Jednakże, mimo że dzięki tej metodzie odkryto szereg nowych koncepcji biologicznych, wciąż istnieją trudne i istotne pytania, dla których do tej pory nie opublikowano żadnych badań z obrazowania intravitalnego. Dotyczy to w szczególności płuc ssaków. Interesujący aspekt tego organu, będącego bramą wlotową dla wielu patogenów przenoszonych drogą powietrzną, czyni go jedną z najważniejszych powierzchni, na których w organizmie ssaków zachodzą procesy immunologiczne. Z każdym oddechem przez całe życie wdychane są niepożądane cząstki, z których niektóre mają potencjał wywoływania infekcji zagrażających życiu⁶. Jest oczywiste, że w tak wrażliwym i narażonym miejscu musi istnieć gęsta sieć mechanizmów obronnych wykazujących cały repertuar odpowiedzi immunologicznych. Z drugiej strony bardzo ważne jest, aby indukowana walka immunologiczna przeciwko potencjalnym patogenom w tak „zanieczyszczonym” miejscu była ściśle kontrolowana. Przesadne reakcje układu odpornościowego niosą ze sobą wysokie ryzyko uszkodzenia własnego organizmu poprzez masywne uszkodzenie tkanki narządu w wyniku stymulacji nieswoistych działań komórek odpornościowych^7,8.

W świetle tych rozważań niezwykle interesująca i pomocna byłaby możliwość zbadania zachowania komórek w płucach ssaków w rzeczywistych warunkach in vivo. Jednak fakt, że taki system nie został dotąd pomyślnie wdrożony, wyraźnie wskazuje na ogromne trudności, które należy rozwiązać przy opracowywaniu działającego protokołu. Największym wyzwaniem jest prawdopodobnie stabilność ogniska. Płuco, jako organ odpowiedzialny za oddychanie, znajduje się w nieustannym ruchu we wszystkich trzech kierunkach przestrzeni w celu realizacji wdechu. Ta okoliczność sama w sobie powoduje poważne problemy z obrazowaniem i może być uznana za „koszmar” osób zajmujących się obrazowaniem intravitalnym. Już niewielki ruch w dowolnym wymiarze przestrzeni ma ogromny, pogarszający wpływ na obraz mikroskopowy, który musi być stabilny z dokładnością do mikrometra, aby można było wygenerować sensowne obrazy⁹. Ze względu na immanentnie wąską płaszczyznę ogniskowania¹⁰, mikroskopia dwufotonowa jest jeszcze bardziej wrażliwa na niestabilność ogniska, ponieważ przesunięcie danej struktury o zaledwie kilka mikrometrów w kierunku Z jest równoznaczne z całkowitą utratą ostrości, a tym samym z niepowodzeniem eksperymentu.

Protokół przedstawiony w niniejszym badaniu do obserwacji komórek odpornościowych w płucach myszy nie jest jeszcze zastosowaniem in vivo, lecz stanowi bliską aproksymację sytuacji w funkcjonalnie nienaruszonym płucu¹¹. Wykazano, że podejścia ex vivo do obrazowania limfocytów, np. w wypreparowanych węzłach chłonnych, dają wyniki równoważne z rzeczywistymi obserwacjami in vivo¹², a zatem są one wysoce istotne⁵. Obserwacje in situ w skrawkach płuca, które są możliwe wyłącznie dzięki naszemu podejściu, odbywają się w zakażonym płucu krótko po wycięciu. Integralność 3D podczas procesu cięcia jest zapewniona przez matrycę agarozową, co jest niezbędnym etapem umożliwiającym precyzyjnie kontrolowany proces cięcia płuca. Chociaż konieczne jest krótkotrwałe schłodzenie wypreparowanego płuca, aby umożliwić zestalenie matrycy agarozowej, po przecięciu i ponownym ogrzaniu tkanki możliwe jest powrót do warunków bliskich fizjologicznym dla komórek. Wyraźnie pokazują to nasze dane, które dowodzą, że w tych warunkach neutrofile są bardzo aktywne i wykazują pełny potencjał jako zwinne fagocyty, które są niezbędne do skutecznego usunięcia infekcji Aspergillus fumigatus. Patrolują one tkankę płucną, przenikając przez bariery nabłonkowe, aby dotrzeć do wewnętrznych części pęcherzyków płucnych, a ponadto aktywnie pochłaniają zarodniki grzybów 11. Kluczowym odkryciem w tej pracy było pojawienie się struktur przypominających zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) w organie zakażonym Aspergillus. NETs są niedawnym odkryciem nowego mechanizmu obronnego neutrofili¹³. Jednak od czasu ich pierwszego opisu w 2004 roku, liczba warunków fizjologicznych lub patologicznych w modelach zwierzęcych lub u ludzi, w których zjawisko to zaobserwowano lub stwierdzono jego brak, gwałtownie rośnie^14-16. Co ciekawe, mimo że tak wiele pracy nad tymi strukturami zostało wykonanych przez tak wiele różnych grup, większość doniesień wciąż znajduje się na poziomie bardzo opisowym i niewiele wiadomo o mechanizmie uwalniania NET oraz jego regulacji. Dzięki naszemu protokołowi po raz pierwszy udało nam się ukazać włókna NET w zakażonym płucu. Ponadto mogliśmy wykazać znaczenie świeżo zrekrutowanych neutrofili, a także cząsteczkowych struktur grzyba dla ich powstawania lub hamowania¹¹. Wyraźnie pokazuje to potencjał naszej metody do bardziej szczegółowego badania poszczególnych etapów formowania NET. Można by na przykład rozważyć wykorzystanie neutrofili z odpowiednich myszy knock-out, aby zaobserwować ich zdolność do formowania NET w eksperymentach z transferem adopcyjnym.

Zatem, mimo że bezpośrednia obserwacja imigracji neutrofili z krwi obwodowej nie jest możliwa w tym systemie ze względu na brak ukrwienia po eksplantacji narządu, uważamy, że nasz protokół stanowi wartościowe i stosunkowo łatwe w obsłudze podejście, które umożliwia obrazowanie wczesnych lub późnych etapów odpowiedzi immunologicznej przeciwko infekcjom płuc. Jest to zatem istotny krok w kierunku badania tego zjawiska w oddychającym płucu żywych zwierząt.