Artykuł metodologiczny

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

17.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2661

⸱

1 lutego 2011

 , 
1Applications and Product Development, New England Biolabs

W tym artykule

Podsumowanie

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Streszczenie

Hydroksymetylacja DNA jest znaną od dawna modyfikacją DNA, która jednak w ostatnim czasie stała się przedmiotem intensywnych badań epigenetycznych. DNA ssaków jest enzymatycznie modyfikowane na pozycji 5ego węgla reszt cytozyny (C) do 5-mC, głównie w obrębie dinukleotydów CpG. 5-mC ulega enzymatycznemu utlenieniu do 5-hmC przez enzymy z rodziny Tet, które uważa się za zaangażowane w procesy rozwojowe oraz patogenezę chorób. Obecnie biologiczna rola 5-hmC nie jest w pełni poznana, jednak budzi duże zainteresowanie ze względu na swój potencjał jako biomarkera. Wynika to z kilku przełomowych badań, w których zidentyfikowano 5-hydroksymetylocytozynę w embrionalnych komórkach macierzystych (ES) oraz komórkach neuronalnych myszy.

Techniki badawcze, w tym metody sekwencjonowania z konwersją bisyfitową, nie pozwalają na łatwe rozróżnienie między 5-mC a 5-hmC. Istnieje kilka protokołów umożliwiających pomiar globalnej ilości 5-hydroksymetylocytozyny w genomie, w tym chromatografia cieczowa sprzężona z analizą spektrometrii mas lub chromatografia cienkowarstwowa pojedynczych nukleozydów uzyskanych z trawienia DNA genomowego. Dostępne są również przeciwciała skierowane przeciwko 5-hydroksymetylocytozynie, które mogą być wykorzystane w analizie dot blot, immunofluorescencji lub wytrącaniu hydroksymetylowanego DNA, jednak przeciwciała te nie zapewniają rozdzielczości na poziomie pojedynczej zasady. Ponadto rozdzielczość zależy od wielkości immunoprecypitowanego DNA, a w przypadku eksperymentów z mikromacierzami – od projektu sondy. Ponieważ nie jest dokładnie znane, w których miejscach genomu występuje 5-hydroksymetylocytozyna ani jaka jest jej rola w regulacji epigenetycznej, konieczne są nowe techniki umożliwiające identyfikację hydroksymetylacji specyficznej dla konkretnych locusów. Zestaw EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit stanowi rozwiązanie pozwalające na rozróżnienie tych dwóch modyfikacji w określonych locusach.

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC to prosta i niezawodna metoda identyfikacji i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w konkretnym locus DNA. To podejście enzymatyczne wykorzystuje różną wrażliwość na metylację izoschizomerów MspI i HpaII w prostym, 3-stopniowym protokole.

Badane DNA genomiczne poddaje się działaniu T4-BGT, co prowadzi do przyłączenia reszty glukozy do 5-hydroksymetylocytozyny. Reakcja ta jest niezależna od sekwencji, zatem wszystkie 5-hmC zostaną glukozylowane; DNA niemodyfikowane lub zawierające 5-mC nie ulegnie zmianom.

Następnie po glukozylacji przeprowadza się trawienie endonukleazą restrykcyjną. MspI i HpaII rozpoznają tę samą sekwencję (CCGG), lecz wykazują różną wrażliwość na stan metylacji. HpaII przecina tylko całkowicie niemodyfikowane miejsce: każda modyfikacja (5-mC, 5-hmC lub 5-ghmC) przy którejkolwiek z cytozyn blokuje cięcie. MspI rozpoznaje i przecina 5-mC oraz 5-hmC, ale nie 5-ghmC.

Trzecią częścią protokołu jest analiza locus za pomocą PCR. Można wykorzystać ilość DNA wejściowego wynoszącą zaledwie 20 ng. Przeprowadzana jest amplifikacja eksperymentalnego (glukozylowanego i trawionego) oraz kontrolnego (pozornie glukozylowanego i trawionego) docelowego DNA za pomocą starterów flankujących interesującą sekwencję CCGG (100-200 bp). Jeśli miejsce CpG zawiera 5-hydroksymetylocytozynę, po glukozylacji i trawieniu zostanie wykryty prążek, który nie pojawi się w kontrolnej reakcji bez glukozylacji. PCR w czasie rzeczywistym pozwoli na przybliżone określenie ilości hydroksymetylocytozyny w tym konkretnym miejscu.

W tym eksperymentie przeanalizujemy zawartość 5-hydroksymetylocytozyny w próbce mózgu myszy Babl/C za pomocą końcowej PCR.

Protokół

1. Glukozylacja DNA i reakcje kontrolne

  1. W probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, w warunkach chłodzenia na lodzie, zmieszać 5-10 µg genomicznego DNA (do uzyskania stężenia końcowego 30 µg/ml), 12,4 µl UDP-glukozy (do uzyskania stężenia końcowego 80 µM), 31 µl NEBuffer 4 oraz uzupełnić wodą wolną od nukleaz do objętości końcowej 310 µl.
  2. Podzielić tę mieszaninę reakcyjną do dwóch probówek po 155 µl każda.
  3. Następnie do jednej z probówek dodać 30 jednostek (lub 3 µl) T4-β-glukozylotransferazy. Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół. Druga probówka służy jako reakcja kontrolna, dlatego zamiast T4-BGT należy dodać 3 µl wody.
  4. Inkubować obie probówki w temperaturze 37 °C przez 12 do 18 godzin; w tym czasie T4-BGT przyłączy glukozę do grupy hydroksylowej grup 5-hydroksymetylocytozyny w próbce.

2. Trawienie enzymami restrykcyjnymi

  1. Oznakuj trzy probówki z pasków PCR o pojemności 0.2 ml numerami od 1 do 3. Do każdej z nich odmień 50 µl mieszaniny reakcyjnej.
  2. Oznakuj trzy probówki z pasków PCR o pojemności 0.2 ml numerami od 4 do 6. Do każdej z nich odmień 50 µl mieszaniny kontrolnej.
  3. Do probówek 1 i 4 dodaj 100 jednostek, czyli 1 µl, MspI. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  4. Do probówek 2 i 5 dodaj 50 jednostek, czyli 1 µl, HpaII. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół.
  5. Do probówek 3 i 6 nie dodawaj niczego, ponieważ służą one jako kontrole.
  6. Inkubuj wszystkie 6 probówek w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.
  7. Do każdej probówki dodaj 1 µl Proteinazy K i inkubuj w temperaturze 40 °C przez 30 minut.
  8. Znieczyń Proteinazę K poprzez inkubację w temperaturze 95 °C przez 10 minut.

3. Analiza DNA za pomocą PCR/qPCR

W niniejszym protokole wykorzystano polimerazę LongAmp Taq firmy NEB do końcowej reakcji PCR, która wykazała wysoką skuteczność. Można zastosować inne protokoły PCR.

  1. Do probówki PCR o pojemności 0,2 ml na lodzie dodać następujące składniki: 10 µL 5X LongAmp Taq Reaction Buffer, 1,5 µL 10 mM dNTPs, 1 µL 10 µM Forward Primer, 1 µL 10 µM Reverse Primer, 3 µL matrycowego DNA z poprzednich etapów, 1 µL LongAmp Taq DNA Polymerase oraz wodę wolną od nukleaz do objętości 50 µL. Objętości te mogą ulec zmianie w zależności od stosowanego protokołu PCR.
  2. Delikatnie wymieszać reakcję. W razie potrzeby zebrać cały płyn na dnie probówki poprzez krótkie wirowanie.
  3. Przykryć próbkę olejem mineralnym, jeśli używany termocykler nie posiada grzanej pokrywy.
  4. Przenieść probówki PCR z lodu do termocyklera z blokiem wstępnie podgrzanym do 94 °C i uruchomić program cykli. W przypadku rutynowego 3-etapowego PCR należy zastosować jeden wstępny etap denaturacji w 94 °C przez 30 s, a następnie 30 cykli składających się z denaturacji w 94 °C przez 15 s, przyłączania w temperaturze od 55 do 65 °C przez 30 s oraz elongacji w 65 °C przez 20 s lub 50 s na kb. Następnie należy przeprowadzić jedną końcową elongację w 65 °C przez 5 min. W celu ilościowego oznaczenia zawartości 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny można również przeprowadzić PCR w czasie rzeczywistym. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji produktu dostępnej na stronie neb.com.

4. Reprezentatywne wyniki:

Wyniki elektroforezy żelowej analizy metylacji i wykresy słupkowe porównujące liczbę kopii DNA w tkankach.
Rycina 1.Porównanie ilości 5-hydroksymetylocytozyny w locus 12 w różnych próbkach tkanek myszy Balb/C. (A), PCR punktowy. (B), PCR w czasie rzeczywistym.

Przeanalizowano DNA z czterech tkanek myszy. W celach porównawczych dane z PCR w czasie rzeczywistym znormalizowano względem niepociętego DNA. Do wyznaczenia liczby kopii wykorzystano krzywą wzorcową. Próbki można było znormalizować, dzieląc liczbę kopii w próbkach nr 1-6 przez liczbę kopii w kontroli niepoddanej trawieniu (nr 5). Obramowana ścieżka żelu pokazuje zmienność obecnego 5-hmC.

Dyskusja

Podczas przygotowywania tego eksperymentu należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kwestii. Po pierwsze, ważne jest, aby glukozylacja genomowego DNA została przeprowadzona do końca. Specyficzność sekwencyjna T4-BGT nie jest znana i wydaje się, że enzym ten nie wykazuje preferencji co do sekwencji substratu. W związku z tym w niektórych przypadkach może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji. Po drugie, trawienie za pomocą MspI i HpaII musi być całkowite, aby uniknąć sygnału tła. W przypadku tych enzymów restrykcyjnych zalecamy czas inkubacji wynoszący 4 godziny, jednak w razie zaobserwowania niepełnego cięcia można przeprowadzić dłuższą inkubację. Po trzecie, ilość wprowadzonego DNA można dostosować w zależności od dostępności, ponieważ do PCR końcowego można wykorzystać 20 ngs DNA. Na koniec zalecamy stosowanie dostarczonego kontrolnego DNA, które może być analizowane równolegle z genomowym DNA w celu ilościowego oznaczenia 5-mC i 5-hmC.

Oświadczenia

Zarówno Ted, jak i Romas, autorzy tego artykułu, są pracownikami firmy NEB; Romas jest głównym opracowawcą zestawu, natomiast Ted pełni funkcję dyrektora działu aplikacji i rozwoju, który nadzorował opracowanie tego zestawu.

Podziękowania

Sriharsa Pradhan, Shannon Morey Kinney, Hang Gyeong Chin, Jurate Bitinaite, Yu Zheng, Pierre Olivier Esteve, Romualdas Vaisvila, laboratorium Stevena E. Jacobsena, UCLA. Praca ta została częściowo sfinansowana przez NIH 1R44GM095209-01.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do analizy 5-hmC i 5-mC EpiMark™New England BiolabsE3317
Primery specyficzne dla locus, flankujące interesującą sekwencję CCGGDostosowane do eksperymentu; dostarczone przez użytkownika
Polimeraza DNA LongAmp® TaqNew England BiolabsM0323
dNTPNew England BiolabsN0447
woda klasy biologii molekularnej

Bibliografia

  1. Sadri, R. Nucleic Acids Res. 24, 4987-4989 (1996).
  2. Mathur, E. J. Gene. 108, 1-6 (1991).
  3. Butkus, V., Petrauskiene, L., Maneliene, Z., Klimasaukas, S., Laucys, V., Janulaitis, A. Nucleic Acids Res. 15, 7091-7102 (1987).
  4. Kriaucionis, S., Heintz, N. Science. 324, 929-930 (2009).
  5. Tahiliani, M., Koh, K. P., Shen, Y., Pastor, W. A., Bandukwala, H., Brudno, Y., Agarwal, S., Lyer, L. M., Liu, D. R. Science. 324, 930-935 (2009).
  6. Huang, Y., Pastor, W. A., Shen, Y., Tahiliani, M., Liu, D. R., Rao, A. PLoS One. 5 (1), e8888-e8888 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza hydroksymetylacji DNAzestaw EpiMark 5 hmCtrawienie z restrykcj glukozylacjir nicowanie MspI i HpaIIilo ciowe oznaczanie specyficzne dla locusanaliza ko cowym PCRilo ciowe oznaczanie w czasie rzeczywistym real time PCRtkanka m zgu myszyalternatywa dla sekwencjonowania z bisulfitowaniem

Powiązane artykuły