Opisujemy prosty test immunoenzymatyczny służący do pomiaru produkcji cytokin prozapalnych, takich jak IL-1 beta, u pacjentów prezentujących fenotypy autozapalne. Poprzez aktywację komórek w hodowlach krwi pełnej za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami, a konkretnie lipopolisacharydu, wydzielanie cytokin można w wygodny sposób ocenić w nadsączach krwi pełnej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dokładny i prosty pomiar cytokiny prozapalnej IL-1β z wykorzystaniem testu stymulacji krwi pełnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Procesy zapalne wynikające z wydzielania rozpuszczalnych mediatorów przez komórki odpornościowe prowadzą do różnych manifestacji w skórze, stawach i innych tkankach, a także do zaburzeń homeostazy cytokin. Wrodzony układ odpornościowy odgrywa kluczową rolę w rozpoznawaniu patogenów oraz innych endogennych bodźców zagrożenia. Jedną z głównych cytokin uwalnianych przez komórki odporności wrodzonej jest interleukina (IL)-1. W związku z tym wykorzystujemy test stymulacji krwi pełnej w celu pomiaru wydzielania cytokin zapalnych, a w szczególności prozapalnej cytokiny IL-1β 1, 2, 3.
Pacjenci z dysfunkcjami genetycznymi wrodzonego układu odpornościowego wywołującymi zespoły autozapalne wykazują nadmierne uwalnianie dojrzałej IL-1β po stymulacji samym LPS. Aby ocenić komponent wrodzonej odpowiedzi odpornościowej u pacjentów z patologiami związanymi ze stanami zapalnymi, stosujemy specyficzny test immunoologiczny do wykrywania komórkowych odpowiedzi immunologicznych na wzorce molekularne związane z patogenami (PAMPs), takie jak endotoksyna bakterii gram-ujemnych, lipopolisacharyd (LPS). PAMPs te są rozpoznawane przez receptory rozpoznające patogeny (PRRs), które znajdują się na komórkach wrodzonego układu odpornościowego 4, 5, 6, 7. Do aktywacji inflamasomu, czyli wielobiałkowego kompleksu przetwarzającego pro-IL-1β do jego dojrzałej, bioaktywnej formy, niezbędny jest sygnał pierwotny, LPS, w połączeniu z sygnałem wtórnym, ATP 4, 5, 6, 8, 9, 10.
Analiza krwi pełnej wymaga minimalnej manipulacji próbkami w celu oceny produkcji cytokin w porównaniu z innymi metodami, które wymagają pracochłonnej izolacji i hodowli specyficznych populacji komórek. Metoda ta różni się od innych testów stymulacji krwi pełnej; zamiast rozcieńczać próbki w określonym stosunku do pożywki RPMI, wykonujemy pomiar liczby białych krwinek bezpośrednio z rozcieńczonej krwi pełnej, a w konsekwencji stymulujemy znaną liczbę leukocytów w hodowli 2. Wyniki tej konkretnej analizy krwi pełnej demonstrują nową technikę użyteczną w charakteryzowaniu kohort pacjentów prezentujących autozapalne patofizjologie.
Protokół
1. Pobieranie krwi pełnej
- Należy pobrać minimum 10 mL krwi obwodowej od osób chorych oraz od zdrowych kontroli dobranych pod względem wieku i płci. Krew żylną należy pobrać do probówek vacutainer z heparyną sodową, zamiast stosować inne przeciwkrzepliwe środki, takie jak EDTA, a następnie kilkukrotnie odwrócić probówki, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie krwi z heparyną sodową. Należy pamiętać, że 10 mL to minimalna objętość krwi pełnej wymagana do naniesienia próbek w duplikacie dla tego konkretnego testu.
- W celu uzyskania najlepszych wyników próbki powinny zostać przetworzone tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. Niemniej jednak krew heparynowana może być przechowywana w temperaturze pokojowej, przy słabym oświetleniu, do 24 godzin do momentu rozpoczęcia przetwarzania (2).
2. Przygotowanie krwi pełnej
- Wszystkie próbki krwi odwiruj przy 3000 rpm (z wyłączonym hamulcem) przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Bez naruszania warstwy leukocytów (buffy coat), z góry można zebrać osocze i przechowywać je do innych celów eksperymentalnych. Próbki osocza można przechowywać tymczasowo w temperaturze -20°C lub długoterminowo w -80°C
- Po zebraniu osocza przemyj próbki, resuspendując pellet erytrocytów (RBC) oraz warstwę leukocytów w pożywce RPMI 1640 bez surowicy (niepełnej) (w temperaturze otoczenia). Delikatnie wymieszaj zawiesinę w probówkach zbiorczych za pomocą pipety i przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 mL.
- Uzupełnij objętość do 50 mL niepełną pożywką hodowlaną RPMI 1640 i delikatnie odwróć probówki, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Odwiruj próbki przy 3000 rpm (z wyłączonym hamulcem) przez dziesięć minut. Upewniając się, że nastąpiło wyraźne rozdzielenie, odessaj nadsącz, uważając, aby nie naruszyć warstwy leukocytów. Powtórz tę procedurę 2-4 razy, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczenia i związane cytokiny zostały usunięte przed stymulacją.
- Po ostatnim przemyciu resuspenduj pellet erytrocytów i warstwę leukocytów w niepełnej pożywce RPMI 1640 tak, aby całkowita objętość wyniosła 20 mL (dla początkowo pobranej objętości 10 mL krwi pełnej). Całkowitą objętość można dostosować w zależności od objętości krwi pobranej na początku.
- Używając Cellometer Vision, można policzyć rozcieńczoną krew bez lizy erytrocytów, wybierając opcję zliczania białych krwinek z użyciem pomarańczowej akrydyny (AO). Połącz jedną część rozcieńczonej krwi z jedną częścią AO i nanieś 20 μL mieszaniny 1:1 do jednorazowej komory zliczającej. Końcowe stężenie AO po rozcieńczeniu powinno wynosić 1 μg/mL.
- Dostosuj odpowiednio niepełną pożywką RPMI 1640 do końcowego stężenia komórek 2.0 x 106 cells/mL.
3. Stymulacja krwi pełnej
- Test wymaga zastosowania co najmniej czterech warunków (każdy wykonany w dubletach): brak stymulacji, dodatek samego LPS, dodatek samego ATP oraz dodatek LPS i ATP jednocześnie. Do odpowiedniej studni 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej należy dodać 1 mL przygotowanej krwi pełnej rozcieńczonej do stężenia 2.0 x 106 komórek/mL.
- Stymulatory należy zrekonstytuować i doprowadzić do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem testu stymulacyjnego. Liofilizowany LPS i ATP należy zrekonstytuować zgodnie z instrukcjami producenta. Po rekonstytucji LPS i ATP można dodatkowo rozcieńczyć do odpowiedniego stężenia roztworu zapasowego, używając niepełnego medium RPMI 1640.
- Dodaj LPS do studni z samym LPS oraz do studni z LPS i ATP w taki sposób, aby końcowe stężenie robocze LPS wynosiło 1 μg/mL. Całkowity czas stymulacji wynosi 3 godziny. Jednak krew pełna jest stymulowana LPS przez 2 godziny i 40 minut. Próbki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
- ATP dodaje się podczas pozostałych 20 minut 3-godzinnego okresu stymulacji. Dodaj ATP do studni z samym ATP oraz do studni z LPS i ATP, a następnie umieść próbki w inkubatorze. Końcowe stężenie robocze ATP wynosi 2mM.
- Po 3-godzinnym okresie inkubacji należy zebrać nadsączniki, przenosząc każdą próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL, a następnie wirując próbki przy 10000 rpm przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Nadsączniki należy przenieść do innego zestawu probówek do mikrocentryfugi 1.5 mL.
- Próbki można poddać natychmiastowej analizie lub przechowywać tymczasowo w -20°C bądź w -80°C w przypadku przechowywania długoterminowego.
4. Analiza cytokin
- Próbki zamrożone muszą osiągnąć temperaturę pokojową przed przystąpieniem do analizy. Stężenia cytokin dla IL-1β można oceniać za pomocą różnych metod. W niniejszej pracy wykorzystujemy zestaw Bio-plex Pro human cytokine x-plex assay wraz z systemem Bio-Plex 200, zgodnie z instrukcjami producenta. W tym protokole mierzymy konkretnie IL-1β; korzystamy jednak z tego multipleksowego testu cytokinowego, aby jednocześnie oznaczać wiele cytokin w jednym badaniu, co pozwala na zastosowanie małej objętości próbki.
5. Reprezentatywne wyniki
Analiza produkcji IL-1β po skutecznej stymulacji LPS i ATP wykazuje odpowiedź dawkową zależną od liczby stymulowanych komórek. Ustaliliśmy, że stężenie 2.0 x 106 komórek/mL jest wystarczające do uzyskania optymalnego i mierzalnego stężenia IL-1β oraz innych cytokin (Rycina 2).
Analizy krwi pełnej są przydatne w badaniu pacjentów wykazujących objawy autozapalne. U pacjentów tych może występować defekt wrodzonego układu odpornościowego, który charakteryzuje się nadprodukcją IL-1β (w porównaniu z grupą kontrolną) po stymulacji samym LPS (Rysunek 3).
Rysunek 1. Reprezentatywny obraz barwienia AO leukocytów jądrowych, wykorzystany w celu określenia stężenia komórek w rozcieńczonych próbkach krwi pełnej.
Rysunek 2. Produkcja IL-1β mierzona w supernatantach krwi pełnej od zdrowego dawcy po stymulacji LPS przy zwiększających się stężeniach komórek. Próbki analizowano w trzech powtórzeniach.
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki wydzielania IL-1β zmierzonego w nadsączach z krwi pełnej od dwóch zdrowych osób kontrolnych, a także od dwóch pacjentów z autoinflamacyjnymi objawami związanymi z IL-1β.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany test z krwi pełnej jest prostą metodą, która w większym stopniu naśladuje warunki fizjologiczne w porównaniu z innymi technikami wymagającymi izolacji komórek oraz rozległego przetwarzania i manipulowania próbkami. Metoda ta wykorzystuje urządzenie Cellometer Vision z barwnikiem AO do zliczania leukocytów w krwi pełnej, a zatem umożliwia dokładną standaryzację próbek w oparciu o liczbę komórek.
Należy zauważyć, że w przypadku tego testu krew pełną należy pobierać do probówek z heparyn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez Wewnętrzny Program Badawczy Narodowego Instytutu Chorób Stawów, Układu Kostno-Mięśniowego i Chorób Skóry Narodowych Instytutów Zdrowia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki do pobierania krwi z heparyną sodową | BD Biosciences | 366480 | |
| Pożywka RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Pomarańcz akrydynowy | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Skontaktuj się z firmą w celu uzyskania informacji o urządzeniu | |
| Komory do liczenia komórek Cellometer | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-dołkowa płytka do hodowli tkanek | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Hydrat soli sodowej 5´-trifosforanu adenozyny | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| System Bio-plex 200 | Bio-Rad | Skontaktuj się z firmą w celu uzyskania informacji o urządzeniu | |
| Test Bio-Plex Pro human cytokine x-plex | Bio-Rad | Testy x-plex są wykonywane na zamówienie zgodnie z określonymi cytokinami zainteresowania |
Bibliografia
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
