Przedstawiamy publiczną stronę internetową służącą do obliczeniowej analizy sekwencji genomicznych. Pozwala ona na wykrywanie wzorców sekwencji DNA o różnych nieprzypadkowych składach nukleotydowych. Zasób ten generuje również sekwencje zrandomizowane o różnym stopniu złożoności.
Artykuł metodologiczny
Genomic MRI – publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w obrębie genomowego DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niekodujące regiony genomiczne u złożonych eukariontów, w tym obszary międzygenowe, introny oraz nietranslacyjne segmenty egzonów, wykazują głęboki brak przypadkowości w składzie nukleotydowym i składają się ze złożonego mozaiki wzorów sekwencji. Wzory te obejmują tak zwane regiony niejednorodności średniego zasięgu (MRI) – sekwencje o długości od 30 do 10 000 nukleotydów, które są wzbogacone w konkretną zasadę lub kombinację zasad (np. bogate w (G+T), bogate w puryny itp.). Regiony MRI są powiązane z nietypowymi strukturami DNA (innymi niż forma B), które często biorą udział w regulacji ekspresji genów, rekombinacji oraz innych procesach genetycznych (Fedorova & Fedorov 2010). Istnienie silnego błędu fiksacji w regionach MRI przeciwko mutacjom, które mają tendencję do zmniejszania niejednorodności ich sekwencji, dodatkowo potwierdza funkcjonalność i znaczenie tych sekwencji genomicznych (Prakash et al. 2009).
W niniejszym materiale prezentujemy ogólnodostępny zasób internetowy — pakiet programistyczny Genomic MRI — zaprojektowany do obliczeniowej analizy sekwencji genomicznych w celu znalezienia i scharakteryzowania w nich różnorodnych wzorców MRI (Bechtel et al. 2008). Pakiet ten umożliwia również generowanie zrandomizowanych sekwencji o różnych właściwościach i różnym stopniu zgodności z naturalnymi wejściowymi sekwencjami DNA. Głównym celem tego narzędzia jest ułatwienie badania rozległych obszarów niekodującego DNA, które są wciąż słabo poznane i wymagają szczegółowej eksploracji oraz rozpoznania.
Protokół
Wszystkie programy wykorzystane w pracy zostały napisane w języku perl, a wszystkie strony internetowe zostały stworzone przy użyciu PHP.
1. Punkt wyjścia:
Otwórz stronę główną internetowego pakietu Genomic MRI pod adresem http://mco321125.meduohio.edu/~jbechtel/gmri/. Zasób sieciowy zawiera również instrukcje i wyjaśnienia dotyczące programów w linku „Help (How-to/README)”, natomiast wszystkie opublikowane materiały na temat Genomic MRI oraz podobnych algorytmów wymienione są w linku „Links to relevant resources”.
2. Przygotowanie i przesyłanie sekwencji wejściowej/sekwencji wejściowych.
Aby rozpocząć sesję analizy GMRI, należy utworzyć plik zawierający sekwencję lub sekwencje w formacie FASTA. Każdej sekwencji nukleotydowej w tym formacie powinna poprzedzać pojedyncza linia zaczynająca się od znaku „>”, który służy jako identyfikator, a następnie krótki opis tej sekwencji w tej samej linii. Sekwencje nukleotydowe przeznaczone do analizy GMRI mogą zawierać również znaki takie jak R, Y, N, X itd. Jednak znaki inne niż A, T, C, G nie będą przetwarzane przez program i zostaną pominięte. Jako dane wejściowe można wykorzystać sekwencje, w których elementy powtarzalne zostały „zamaskowane” (zastąpione znakami „N”). Należy pamiętać, że znaki sekwencji nie są rozróżniane ze względu na wielkość liter.
- Rozpocznij sesję GMRI, klikając przycisk „Start or Resume” na stronie głównej Genomic MRI. Spowoduje to przejście do strony, na którą można przesyłać sekwencje nukleotydowe.
- Skopiuj i wklej sekwencje w formacie FASTA lub prześlij plik zawierający sekwencje z lokalnego komputera, korzystając z przycisku „choose file”.
- Kliknij przycisk „start new session with this file”. Nad oknem wprowadzania danych powinna pojawić się wiadomość potwierdzająca: „Your sequence has been successfully uploaded”. Otrzymasz również alfanumeryczny „identyfikator GMRI” [strona określa go jako „session label”] dla danej sesji (np. b16yMj), który można wykorzystać do odzyskania i kontynuowania sesji do dwóch tygodni po pierwszym użyciu.
UWAGA: Od tego momentu sekwencje wejściowe określane są jako „userfile”.
3. Wyznacz rozkład częstotliwości oligonukleotydów dla sekwencji wejściowych (opcjonalnie).
Kliknij kartę „SRI Analyzer” (górny rząd), aby otrzymać rozkład częstotliwości oligonukleotydów dla całego zestawu sekwencji wejściowych. Akronim SRI oznacza krótkozasięgową niejednorodność (short-range inhomogeneity). W tym momencie użytkownik może określić maksymalną długość oligonukleotydów (od 2 do 9 nukleotydów, domyślnie 6 nts), dla których obliczone zostaną częstotliwości. Wybór ten dokonuje się poprzez kliknięcie żądanej opcji w liście rozwijanej „Maximum oligomer size”. Następnie należy nacisnąć przycisk „Analyze File”, aby rozpocząć obliczenia. Przybliżone przedstawienie składu sekwencji wejściowej pojawi się natychmiast w formie krótkiej tabeli na środku strony internetowej i będzie dostępne do pobrania jako „userfile.comp.tbl”. Tabela ta przedstawia jedynie najczęściej i najrzadziej występujące oligonukleotydy w sekwencjach wejściowych.
Pełna tabela częstotliwości dla wszystkich możliwych oligonukleotydów jest generowana jako plik o nazwie „userfile.comp”, który można pobrać za pomocą łącza „Pobierz plik składu”.
UWAGA: Analizator SRI zlicza cały zestaw wszystkich nakładających się oligonukleotydów.
4. Generowanie losowych sekwencji o tym samym składzie oligonukleotydów co w sekwencjach wejściowych (opcjonalnie).
(Do wykonania tego zadania wymagane jest ukończenie kroku 3 protokołu).
- Kliknij kartę „SRI Generator” (górny rząd), aby otworzyć nową stronę internetową służącą do tworzenia losowych sekwencji. Za pomocą listy rozwijanej na tej stronie wybierz liczbę próbek losowych sekwencji do wygenerowania. Każdy z tych plików próbek będzie zawierał losowe sekwencje o takiej samej liczbie i długości, jak sekwencje wejściowe w pliku „userfile”. Ponadto, jeśli sekwencja wejściowa zawiera znaki inne niż A, T, C lub G, sekwencja losowa będzie posiadać litery „N” dokładnie w tych samych pozycjach, co w sekwencji wejściowej.
- Wybierz maksymalną długość oligonukleotydów, dla których częstotliwości będą przybliżane w sekwencjach losowych. Można to zrobić, zaznaczając przycisk radiowy dla pożądanego poziomu oligomerów (np. „4-mers” dla oligonukleotydów czterozasadowych) w tabeli w centrum ekranu. Należy odnotować, że sekwencje losowe będą składać się nie tylko z przybliżonych częstotliwości na wybranym poziomie oligomerów, ale także z odpowiadających im częstotliwości dla krótszych poziomów oligomerów, analogicznie jak w sekwencjach wejściowych. Ze względu na zastosowanie modelu Markowa w procesie generowania sekwencji losowych możliwe są niewielkie wahania częstotliwości oligonukleotydów w sekwencjach wejściowych i losowych.
- Uruchom program, klikając przycisk „Generate File”. W przypadku dużych sekwencji wejściowych generowanie sekwencji losowych może potrwać kilka minut. Użytkownik powinien zatem poczekać, aż na dole strony pojawią się niebieskie łącza „Download”. Losowe zestawy są zapisywane w plikach o nazwach takich jak „userfile.randX_Y”, gdzie X oznacza numer zestawu losowego, a Y wybrany poziom oligomerów (np. „userfile_rand2_4”).
5. Analiza niejednorodności średniego zakresu (MRI) sekwencji wejściowych i losowych.
- Kliknij w „Analizator MRIzakładka (górny rząd), która otwiera nową stronę internetową służącą do analizy średniomieszkaniowej niejednorodności składu nukleotydowego sekwencji.
- Wybierz sekwencję do analizy z „Plik do analizypole wyboru (tutaj można dokonać wyboru pomiędzy sekwencją wejściową a wygenerowanymi zestawami sekwencji losowych).
- Wybierz typ treści obrazów MRI, które zostaną przeanalizowane za pomocą dostarczonego pola listy. (Dostępnych jest siedem opcji zawartości: G+C; G+A; G+T; A; G; C lub T).
- Należy wybrać długość okna, dla którego sekwencje bogate w treść i ubogie w treść zostaną przeanalizowane za pomocą Wielkość okna pole wyboru (domyślnie 50 nukleotydów; dopuszczalny zakres wynosi od 30 do 1000).
- Wybierz górna granica i niższy próg odpowiednio dla regionów bogatych i ubogich w treść. Progi te mogą być zdefiniowane przez dokładną liczbę konkretnych nukleotydów w aktualnym oknie (wykorzystując) według numeru opcja w polu listy) lub według procentowej zawartości tych nukleotydów w oknie (używając procentowo opcja)
- Po dokonaniu wszystkich pięciu wyborów (na przykład: Sekwencja = "**Tytuł: Oznaczanie aktywności enzymatycznej peroksydazy chrzanowej (HRP) w próbkach białka** **Opis** Peroksydaza chrzanowa (HRP) jest powszechnie stosowanym enzymatem w badaniach biomedycznych, pełniąc rolę znacznika w testach immunoenzymatycznych (ELISA), immunocytochemii i western blotingu. Pomiar aktywności enzymatycznej HRP jest kluczowy dla zapewnienia optymalnej czułości i powtarzalności tych analiz. W niniejszym protokole przedstawiono metodę ilościowego oznaczania aktywności HRP z wykorzystaniem substratu kolorystycznego, TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny), w obecności nadtlenku wodoru ($\text{H}_2\text{O}_2$). Reakcja katalizowana przez HRP prowadzi do utlenienia TMB, co skutkuje powstaniem niebieskiego produktu, który po zatrzymaniu reakcji kwasem staje się żółty i może być mierzony spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm. Metoda ta pozwala na precyzyjne określenie jednostek aktywności enzymatycznej w próbkach białka oczyszczonego lub ekstraktach tkankowych. **Słowa kluczowe** peroksydaza chrzanowa, HRP, aktywność enzymatyczna, TMB, spektrofotometria, test kolorystyczny, kinetyka enzymatyczna, analiza białek; Treść = GC; Rozmiar okna = 50; Górny próg = 35; Dolny próg = 15), uruchom program, naciskając Analiza pliku przycisk. Program skanuje kolejno wszystkie sekwencje z wybranego pliku wejściowego. Na każdym etapie program pobiera segment aktualnej sekwencji o długości odpowiadającej określonej wielkości okna i oblicza, czy liczba lub procent nukleotydów o wybranej zawartości przekracza górny próg lub znajduje się poniżej progu dolnego. Jeśli okno nie spełnia żadnego z tych kryteriów, do analizy wybierane jest następne nakładające się okno (przesunięte o jeden nukleotyd). Po znalezieniu okna, w którym sekwencja spełnia jeden z wymogów progowych dla składu bogatego lub ubogiego w daną zawartość, program zapisuje sekwencję tego okna w pliku wyjściowym i generuje pik na wykresie. Następnie program przeskakuje do kolejnego, niezakładającego się okna sąsiedniego i wznawia proces skanowania aż do osiągnięcia końca sekwencji.
- Po zakończeniu programu pojawi się link do pliku wyjściowego (o nazwie "Plik użytkownika GC_50_35..15(dla powyższego przykładu) pojawia się, a graficzna reprezentacja wyników jest wyświetlana na środku strony internetowej (patrz: Rysunek 1). Na tym wykresie wszystkie wprowadzone sekwencje z Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. zostają połączone w jeden ciąg i przedstawione jako pozioma czarna linia na osi X, z podaną poniżej długością w kilobazach (kb). Wszystkie regiony bogate w treść wzdłuż sekwencji wejściowych są oznaczone niebieskimi „w górę” kolcami, a regiony ubogie w treść – czerwonymi „w dół” kolcami. Całkowita liczba okien bogatych i ubogich w treść jest podana w nawiasach w legendzie u dołu tej ryciny (odpowiednio 32 i 19). Rycina ta służy do zilustrowania względnej liczności i rozmieszczenia regionów MRI. Tymczasem szczegółowe dane są przedstawione w pliku wyjściowym (patrz rycina 3). W pliku tym wszystkie segmenty sekwencji nukleotydowej spełniające kryteria bogatości lub ubóstwa treści wraz z ich współrzędnymi są dostępne dla użytkownika w formie listy zgodnie z ich kolejnością w pliku wejściowym.
- Po zakończeniu analizy MRI dla wybranej sekwencji użytkownik może rozpocząć nowy proces na tej samej stronie internetowej, zmieniając parametry i/lub pliki wejściowe. Na przykład, aby przebadać wcześniej wygenerowaną próbkę losową nr 1 z tymi samymi parametrami MRI, użytkownik musi jedynie zmienić Plik do analizyopcja i wybierz „userfile_rand1_4" plik, a następnie naciśnij Analiza pliku przycisk ponownie. Nowy plik i wyświetlacz graficzny zastąpią poprzednie. Wyniki i ryciny ze WSZYSTKICH badań przypisanych do każdej „etykiety sesji” (identyfikatora GMRI) zostaną zapisane i będą dostępne przez dwa tygodnie od ostatniej aktywności. Aby na stałe zapisać wyniki/ryciny, użytkownik powinien wybrać „Pobierz plikizakładka (górny rząd) i pobierz całą sesję lub poszczególne pliki, zgodnie z potrzebami.
- Z tym Analizator MRI strona internetowa, którą użytkownik może przestudiować
- regiony bogate w (G+C) i regiony bogate w (A+T)
- Regiony bogate w puryny (A+G) i regiony bogate w pirymidyny (C+T)
- Regiony bogate w keto (G+T) oraz regiony bogate w amino (A+C)
- regiony bogate w A i ubogie w A
- Regiony bogate w G i ubogie w G
- Regiony bogate i ubogie w tyminę
- Obszary bogate w C i ubogie w C
- Najnowsza wersja Genomowe MRI oferuje nową możliwość badania regionów bogatych w wzorce naprzemienne puryn(R)/pirymidyn(Y), które mogą tworzyć konformacje Z-DNA. Obecnie opcja ta jest dostępna pod linkiem „Z-DNAi działa ono na tej samej zasadzie, co pozostałe wspomniane obszary MRI. Użytkownik powinien wybrać górny i dolny próg dla liczby nakładających się dinukleotydów (RY+YR) w oknie skanującym. Program generuje podobny wynik graficzny oraz plik z segmentami DNA wzbogaconymi i zubożonymi w naprzemienne puryny i pirymidyny. Domniemane regiony Z-DNA muszą być silnie wzbogacone w naprzemienne zasady R/Y (patrz przegląd F&F 2011).
6. Dodatkowe programy w pakiecie Genomic MRI (opcjonalnie).
Zasób Genomic MRI oferuje również dwie zaawansowane opcje generowania bardzo specyficznych sekwencji losowych. Są one dostępne w zakładkach „MRI Generator” oraz „CDS Generator” w górnym rzędzie.
- generator obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) tworzy zrandomizowane sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydowym jak w pliku wejściowym (podobnie do generator SRI). Jednak ponadto zrandomizowane sekwencje naśladują określony wzorzec MRI wskazany przez użytkownika. Na tej stronie internetowej użytkownik powinien wybrać z rozwijanej listy konkretny wzorzec MRI, który ma zostać naśladowany. Lista rozwijana zawiera wszystkie wzorce, które zostały zbadane w tej sesji przez Analizator MRI (np. „userfile_GC_50_35..15")Losowa sekwencja wygenerowana przy użyciu tej opcji będzie miała taki sam skład oligonukleotydowy jak wybrany plik wejściowy, a także te same wzorce regionów bogatych i ubogich w GC, jakie widoczne są w „userfile_GC_50_35..15".
- generator CDS służy do randomizacji sekwencji kodujących białka. Zachowuje ona taką samą sekwencję aminokwasów, jak ta zakodowana w określonej przez użytkownika sekwencji wejściowej. Ponadto program zachowuje te same preferencje kodonów i dikodonów, które określono w wybranej przez użytkownika tabeli wejściowej. Wersja online programu Generator CDS program przyjmuje również sekwencję białkową jako dane wejściowe. Wszystkie pozostałe opcje programu są oferowane wyłącznie w formie samodzielnych skryptów Perl, dostępnych do pobrania z głównej strony internetowej Genomic MRI.
7. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół umożliwia badanie niejednorodności składu sekwencji nukleotydowych. Co istotne, wspiera on również generowanie różnorodnych sekwencji zrandomizowanych, których skład oligonukleotydowy jest zbliżony do składu sekwencji wejściowych. Zazwyczaj sekwencje genomiczne złożonych eukariontów nie są jednorodne pod względem składu, lecz stanowią złożoną mozaikę segmentów sekwencji wzbogaconych w konkretne nukleotydy (na przykład bogatych w puryny, bogatych w (G+T), bogatych w (A+T) itd.). Wzorce te w skali średniej (30–1000 bp) są wizualizowane za pomocą graficznego wyniku analizator MRI co obrazuje wybrane segmenty bogate w treść jako górne niebieskie piki oraz segmenty ubogie w treść jako dolne czerwone piki (patrz Rycina 1 i 2). Zazwyczaj liczba regionów bogatych i ubogich w treść w sekwencji naturalnej (Rycina 1) jest o rzędy wielkości większa niż liczba regionów tego samego typu w odpowiadających im sekwencjach randomizowanych (Rycina 2) o takim samym składzie oligonukleotydowym. Te segmenty sekwencji o średnim stopniu niejednorodności składu nukleotydowego mogą być interesujące dla użytkownika. Są one dostępne z Genomowy rezonans magnetyczny (MRI) pliki wyjściowe do dalszych analiz.
Rycina 1. Przykład graficznego wyniku z analizatora MRI z kroku 5.7. Wyniki uzyskano na próbce 44 ludzkich intronów. Niebieskie słupki reprezentują pozycje regionów bogatych w GC wzdłuż tych intronów. Czerwone słupki reprezentują regiony MRI ubogie w GC (lub bogate w AT). Oś y zawiera górne i dolne progi dla danego typu zawartości.
Rysunek 2.Wynik analizy MRI dla losowej sekwencji „userfile.rand1_4”.
Graficzna reprezentacja MRI w obrębie losowo wygenerowanej sekwencji z zastosowaniem programu generatora SRI.
Rysunek 3.Przykład początku tekstowego pliku wyjściowego z programu MRI analyzer.
Wszystkie sekwencje bogate w treść i ubogie w treść wykryte przez program są przedstawione w ostatniej (czwartej) kolumnie. Ich względne położenia, mierzone w liczbie okien, pokazano w pierwszej kolumnie. Druga i trzecia kolumna stanowią wskaźniki odpowiednio dla regionów bogatych w treść i ubogich w treść.
Dyskusja
Regiony o niejednorodnym składzie nukleotydowym w skalach średniego zasięgu (30-1000 nukleotydów) występują obficie w genomach złożonych eukariotów i mogą znajdować się w dowolnym miejscu (regiony międzygenowe, introny, niekodyjące regiony egzonów, elementy repetytywne). Regiony te są często powiązane z nietypowymi konformacjami DNA. Na przykład sekwencje bogate w puryny/pirymidyny mają tendencję do tworzenia potrójnych helis DNA (H-DNA); sekwencje z naprzemiennymi zasadami purynowymi i pirymidynowymi są powiązane z konformacjami Z-DNA; regiony bogate w (G+C) wykazują nieprawidłowości strukturalne w B-DNA i mogą być podatne na pękanie szkieletu cukrowo-fosforanowego; regiony bogate w (A+T) mogą tworzyć nietypową strukturę – element rozplatania DNA; itd. (przegląd Fedorov & Fedorova 2010). Niektóre z tych wzorców średniego zasięgu (np. regiony bogate w (G+T)) są słabo zbadane i wciąż oczekują na szczegółową eksplorację i rozpoznanie. Głównym celem naszego zasobu internetowego Genomic MRI jest pomoc użytkownikom w identyfikacji tych regionów MRI w celu ich dalszej analizy eksperymentalnej oraz badania ich potencjalnych funkcji. Wiedza o regionach MRI mogłaby zostać włączona do nowej generacji programów do predykcji genów (Shepard 2010), co usprawniłoby ich działanie i poszerzyło nasze zrozumienie funkcji oraz właściwości genomu.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Samuelowi Shepardowi, Peterowi Bazeleyowi i Johnowi Davidowi Bellowi za administrację stronami internetowymi Genomic MRI. Praca ta była wspierana przez grant National Science Foundation Career award „Investigation of intron cellular roles” [numer grantu MCB-0643542].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komputer z dostępem do Internetu | |||
| Pliki z sekwencjami nukleotydowymi do analizy |
Bibliografia
- Bechtel, J. M., Wittenschlaeger, T., Dwyer, T., Song, J., Arunachalam, S., Ramakrishnan, S. K., Shepard, S., Fedorov, A. Genomic mid-range inhomogeneity correlates with an abundance of RNA secondary structures. BMC Genomics. 9, 284-284 (2008).
- Prakash, A., Shepard, S., Mileyeva-Biebesheimer, O., He, J., Hart, B., Chen, M., Amarachiniha, S., Bechtel, J., Fedorov, A. Molecular forces shaping human genomic sequence at mid-range scales. BMC Genomics. 10, 513-513 (2009).
- Fedorov, A., Fedorova, L. Chapter 3: An Intricate Mosaic of Genomic Patterns at Mid-range Scale. Advances in Genomic Sequence Analysis and Pattern Discovery. , 65-91 (2010).
- Shepard, S. S. Chapter 4: Binary-abstracted Markov models and their application to sequence classificatio. The characterization and utilization of middle-range sequence patterns within human genome [dissertation]. , The University of Toledo. 57-157 (2010).
Przedruki i uprawnienia
