Genomiczny rezonans magnetyczny - publiczny zasób do badania wzorców sekwencji w genomowym DNA

Summary

Prezentujemy publiczną stronę internetową do analizy sekwencji genomowych. Wykrywa wzorce sekwencji DNA z różnymi nielosowymi składami nukleotydów. Ten zasób generuje również losowe sekwencje o różnych poziomach złożoności.

Abstract

Niekodujące regiony genomowe u złożonych eukariontów, w tym obszary międzygenowe, introny i nietranslowane segmenty eksonów, są głęboko nielosowe w swoim składzie nukleotydowym i składają się ze złożonej mozaiki wzorców sekwencji. Wzorce te obejmują tak zwane regiony niejednorodności średniego zakresu (MRI) - sekwencje o długości 30-10000 nukleotydów, które są wzbogacone o określoną zasadę lub kombinację zasad (np. bogatych w (G + T), bogatych w puryny itp.). Regiony MRI są związane z nietypowymi (innymi niż B) strukturami DNA, które często biorą udział w regulacji ekspresji genów, rekombinacji i innych procesów genetycznych (Fedorova i Fedorov 2010). Istnienie silnego odchylenia fiksacji w regionach MRI wobec mutacji, które mają tendencję do zmniejszania niejednorodności sekwencji, dodatkowo potwierdza funkcjonalność i znaczenie tych sekwencji genomowych (Prakash i in. 2009).

Tutaj prezentujemy swobodnie dostępny zasób internetowy -- pakiet programu Genomic MRI -- przeznaczony do analizy obliczeniowej sekwencji genomowych w celu znalezienia i scharakteryzowania różnych wzorców MRI w ich obrębie (Bechtel et al. 2008). Pakiet ten umożliwia również generowanie randomizowanych sekwencji o różnych właściwościach i poziomie zgodności z naturalnymi wejściowymi sekwencjami DNA. Głównym celem tego zasobu jest ułatwienie badania rozległych regionów niekodującego DNA, które wciąż są słabo zbadane i czekają na dokładne zbadanie i rozpoznanie.

Protocol

Wszystkie użyte programy w artykule zostały napisane przy użyciu perla, a wszystkie strony internetowe zostały stworzone przy użyciu PHP.

1. Punkt wyjścia:

Otwórz stronę domową internetowego pakietu Genomic MRI pod adresem http://mco321125.meduohio.edu/~jbechtel/gmri/ . Zasób internetowy zawiera również instrukcje/wyjaśnienia dotyczące programów w linku "Help (How-to/README)", podczas gdy wszystkie opublikowane materiały na temat genomicznego rezonansu magnetycznego i podobnych algorytmów są wymienione w linku "Linki do odpowiednich zasobów".

2. Przygotowanie i przesyłanie sekwencji wejściowych.

Utwórz plik z sekwencjami w formacie FASTA, aby rozpocząć sesję analizy GMRI. Każda sekwencja nukleotydowa w tym formacie powinna być poprzedzona pojedynczym wierszem rozpoczynającym się od znaku ">" reprezentującego identyfikator, po którym w tym samym wierszu następuje krótki opis tej sekwencji. Sekwencje nukleotydowe do analizy GMRI dopuszczają również znaki takie jak R, Y, N, X itp. Niezależnie od tego, znaki inne niż A, T, C, G nie będą przetwarzane przez program i zostaną pominięte. Sekwencje, w których powtarzające się elementy zostały "zamaskowane" (zastąpione przez "N") mogą być używane jako dane wejściowe. Należy pamiętać, że w znakach sekwencji nie jest rozróżniana wielkość liter.

1. Rozpocznij sesję GMRI, klikając przycisk "Rozpocznij lub Wznów " na stronie głównej Genomic MRI. Spowoduje to przeniesienie użytkownika na stronę, na której można przesłać sekwencje nukleotydów.
2. Skopiuj i wklej sekwencje w formacie FASTA lub prześlij plik zawierający sekwencje z komputera lokalnego za pomocą przycisku "wybierz plik".
3. Kliknij przycisk "rozpocznij nową sesję z tym plikiem". Nad oknem wprowadzania powinien pojawić się komunikat potwierdzający informujący, że "Twoja sekwencja została pomyślnie przesłana", a także powinieneś otrzymać alfanumeryczny "identyfikator GMRI" [strona nazywa go "etykietą sesji"] dla swojej sesji (np. b16yMj), którego można użyć do pobrania i kontynuowania sesji przez okres do dwóch tygodni po pierwszym użyciu.

UWAGA: Odtąd sekwencje wejściowe są określane jako "plik użytkownika".

3. Uzyskaj rozkład częstotliwości oligonukleotydów sekwencji wejściowych (opcjonalnie).

Kliknij na zakładkę "Analizator SRI" (górny wiersz), aby uzyskać rozkład częstości oligonukleotydów dla całego zestawu sekwencji wejściowych. Akronim SRI oznacza niejednorodność krótkiego zasięgu. W tym momencie użytkownik może określić największą długość oligonukleotydów (od 2 do 9 nukleotydów, domyślnie 6 nt), dla których będą obliczane częstotliwości. Wyboru tego dokonuje się poprzez kliknięcie żądanej opcji w polu listy "Maksymalny rozmiar oligomeru". Następnie naciśnij przycisk "Analizuj plik", aby rozpocząć obliczenia. Przybliżona reprezentacja kompozycji sekwencji wejściowej natychmiast pojawi się w postaci krótkiej tabeli w środku tej strony internetowej i będzie do pobrania jako "userfile.comp.tbl". Ta tabela przedstawia tylko najwięcej i najmniej obfitych oligonukleotydów w sekwencjach wejściowych.

Cała tabela częstości dla wszystkich możliwych oligonukleotydów jest generowana jako plik o nazwie "userfile.comp", który można uzyskać za pomocą linku "Pobierz plik kompozycji".

UWAGA: Analizator SRI zlicza cały zestaw wszystkich nakładających się oligonukleotydów.

4. Generuj losowe sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydów jak w sekwencjach wejściowych (opcjonalnie).

(Do tego zadania wymagane jest wykonanie kroku 3 protokołu).

1. Kliknij zakładkę "SRI Generator" (górny rząd), aby otworzyć nową stronę internetową, która tworzy losowe sekwencje. Wybierz liczbę próbek losowych sekwencji, które mają zostać wygenerowane, korzystając z listy na tej stronie internetowej. Każdy z tych przykładowych plików będzie zawierał losowe sekwencje o tej samej liczbie i długości, co sekwencje wejściowe w "userfile". Co więcej, jeśli sekwencja wejściowa zawiera znaki inne niż A, T, C lub G, sekwencja losowa będzie miała "N" dokładnie w tych samych pozycjach, co w sekwencji wejściowej.
2. Wybierz najdłuższą długość oligonukleotydów, dla których częstotliwości będą przybliżone w losowych sekwencjach. Można to wybrać, zaznaczając przycisk radiowy dla żądanego poziomu oligomerów (np. "4-mers" dla oligonukleotydów czterozasadowych) w tabeli na środku ekranu. Należy tutaj zauważyć, że sekwencje losowe będą składać się nie tylko z przybliżonych częstotliwości na wybranym poziomie oligomerów, ale także z odpowiadających im częstotliwości krótszych poziomów oligomerów, jak w sekwencjach wejściowych. Niewielkie wahania częstości oligonukleotydów sekwencji wejściowych i losowych są możliwe dzięki procedurze Modelu Markowa zastosowanej do generowania sekwencji losowych.
3. Uruchom program, klikając przycisk "Generuj plik". Jeśli sekwencje wejściowe są duże, wygenerowanie losowych sekwencji może potrwać kilka minut. Dlatego użytkownik powinien poczekać, aż na dole tej strony pojawią się niebieskie linki "Pobierz". Zestawy losowe umieszcza się w plikach o nazwach takich jak "userfile.randX_Y", gdzie X to numer zbioru losowego, a Y to wybrany poziom oligomerów (np. "userfile_rand2_4").

5. Analiza niejednorodności średniego zakresu (MRI) sekwencji wejściowych i losowych.

1. Kliknij zakładkę "MRI Analyzer" (górny rząd), która otwiera nową stronę internetową, która analizuje niejednorodność składu nukleotydowego sekwencji w średnim zakresie.
2. Wybierz sekwencję do analizy z listy "Plik do analizy" (w tym miejscu można dokonać wyboru między sekwencją wejściową a wygenerowanymi zestawami sekwencji losowych).
3. Wybierz typ zawartości MRI, która ma być analizowana, za pomocą podanego pola listy. (Dostępnych jest siedem opcji zawartości: G + C; G+A; G+T; A; G; C; lub T.)
4. Wybierz długość okna, dla którego będą badane sekwencje bogate i ubogie w treść, za pomocą listy "Rozmiar okna" (domyślnie 50 nukleotydów; prawidłowy zakres to od 30 do 1000).
5. Wybierz odpowiednio górny i dolny próg dla regionów bogatych i ubogich w zawartość. Progi te można zdefiniować na podstawie dokładnej liczby poszczególnych nukleotydów w bieżącym oknie (za pomocą opcji według numeru w polu listy) lub na podstawie procentu tych nukleotydów w oknie (przy użyciu opcji procentowej)
6. Po dokonaniu wszystkich pięciu wyborów (na przykład: Sekwencja = "plik użytkownika"; Zawartość = GC; Rozmiar okna = 50; Górny próg = 35; Dolny próg = 15), wywołaj program, naciskając przycisk Analizuj plik. Program skanuje kolejno wszystkie sekwencje z wybranego wejścia. Na każdym kroku uzyskuje segment bieżącej sekwencji o długości równej określonemu rozmiarowi okna i oblicza, czy liczba lub procent nukleotydów o wybranej zawartości jest powyżej górnego progu, czy poniżej dolnego progu. Jeśli okno nie spełnia żadnego z kryteriów, do tej samej analizy wybierany jest następny nakładający się zakres (przesunięty o jeden nukleotyd). Gdy zostanie znalezione okno, w którym sekwencja spełnia jedno z wymagań progowych dla kompozycji bogatej w zawartość lub ubogą, program zapisuje sekwencję tego okna w pliku wyjściowym i generuje skok na graficznym wyjściu. Następnie program przeskakuje do następnego sąsiedniego okna, które nie nakłada się na siebie, i wznawia proces skanowania, aż do osiągnięcia końca sekwencji.
7. Po zakończeniu programu pojawia się link do pliku wyjściowego (o nazwie "userfile_GC_50_35..15" dla powyższego przykładu), a w środku strony internetowej wyświetlana jest graficzna reprezentacja wyników (patrz Rysunek 1). Na tym graficznym wyświetlaczu wszystkie sekwencje wejściowe z pliku użytkownika są łączone w jeden ciąg znaków i prezentowane jako pozioma linia na osi X, o długości w kilopodstawach (kb) pokazanej poniżej. Wszystkie regiony bogate w zawartość wzdłuż sekwencji wejściowych są oznaczone jako niebieskie skoki "w górę", a regiony o niskiej zawartości jako czerwone skoki "w dół". Łączna liczba okien bogatych i ubogich w zawartość jest pokazana w nawiasach w legendzie u dołu tego rysunku (odpowiednio 32 i 19). Rysunek służy do zilustrowania względnej obfitości i rozmieszczenia obszarów MRI. Tymczasem szczegółowe informacje są prezentowane w pliku wyjściowym (patrz rysunek 3). W tym pliku wszystkie segmenty sekwencji nukleotydów, które spełniają kryteria bogate lub ubogie w treść, oraz ich współrzędne są dostępne dla użytkownika jako lista zgodnie z ich kolejnymi pozycjami w pliku wejściowym.
8. Po zakończeniu analizy MRI dla wybranej sekwencji, użytkownik może rozpocząć nowy proces na tej samej stronie internetowej, wprowadzając zmiany w parametrach i/lub plikach wejściowych. Na przykład, aby zbadać wcześniej wygenerowaną próbkę losową #1 o tych samych parametrach MRI, użytkownik musi jedynie zmienić opcję Plik do analizyi wybrać plik "userfile_rand1_4", a następnie ponownie nacisnąć przycisk Analizuj plik. Nowy plik i wyświetlacz graficzny zastąpią stary. Wyniki i dane liczbowe ze WSZYSTKICH egzaminów w ramach każdej "etykiety sesji" (identyfikator GMRI) zostaną zapisane i będą dostępne przez dwa tygodnie od ostatniej aktywności. W celu trwałego zapisania wyników/rysunków, użytkownik powinien wybrać zakładkę "Pobierz pliki" (górny wiersz) i pobrać całą sesję lub poszczególne pliki, w zależności od potrzeb.
9. Dzięki tej stronie internetowej MRI Analyzer użytkownik może uczyć się
   • Regiony bogate w (G+C) i (A+T)
   • Regiony bogate w puryny (A+G) i pirymidyny (C+T)
   • Regiony bogate w keto (G + T) i aMino (A + C)
   • Regiony A-bogate i A-biedne
   • Regiony bogate w G i ubogie w G
   • Regiony bogate w T i ubogie w T
   • Regiony bogate w C i ubogie w C
10. Najnowsza wersja Genomic MRI ma nową opcję do badania regionów bogatych w wzorce przemian puryny(R)/pirymidyny(Y), które mogą tworzyć konformacje Z-DNA. Obecnie opcja ta jest dostępna z linku "Z-DNA" i działa na tej samej zasadzie, co inne wyżej wymienione regiony MRI. Użytkownik powinien wybrać górny i dolny próg liczby nakładających się na siebie dinukleotydów (RY+YR) w oknie skanowania. Program generuje podobny wynik graficzny i plik segmentów DNA wzbogaconych i zubożonych przez naprzemienne puryny i pirymidyny. Przypuszczalne regiony Z-DNA muszą być wysoce wzbogacone przez naprzemienne zasady R/Y (patrz przegląd F&F 2011).

6. Dodatkowe programy w pakiecie Genomic MRI (opcjonalnie).

Zasób Genomic MRI posiada również dwie zaawansowane opcje generowania bardzo specyficznych sekwencji losowych. Są one dostępne w zakładkach "Generator MRI" i "Generator CDS" w górnym rzędzie.

1. Generator MRI tworzy losowe sekwencje o takim samym składzie oligonukleotydowym jak plik wejściowy (podobnie jak generator SRI). Jednak dodatkowo losowe sekwencje naśladują określony wzorzec MRI określony przez użytkownika. Na tej stronie internetowej użytkownik powinien określić z listy konkretny wzór MRI, który ma być naśladowany. Pole listy zawiera wszystkie wzorce, które zostały zbadane w tej sesji za pomocą analizatora MRI (np. "userfile_GC_50_35..15"). Losowa sekwencja wygenerowana za pomocą tej opcji będzie miała taki sam skład oligonukleotydowy jak wybrany plik wejściowy, a także te same wzorce bogate i ubogie w GC, jak widać w "userfile_GC_50_35..15".
2. Generator CDS służy do randomizacji sekwencji kodujących białka. Zachowuje tę samą sekwencję aminokwasów, która jest kodowana przez dane wejściowe określone przez użytkownika. Ponadto program zachowuje te same odchylenia kodonów i dikodonów, jak określono w tabeli wejściowej wybranej przez użytkownika. Wersja online generatora CDS akceptuje również sekwencję białka jako dane wejściowe. Wszystkie inne opcje programu są oferowane tylko za pośrednictwem samodzielnych skryptów Perla, które można pobrać z głównej strony internetowej Genomic MRI.

7. Reprezentatywne wyniki

Ten protokół pozwala użytkownikowi badać niejednorodność składu sekwencji nukleotydowych. Co ważne, wspiera również generowanie różnorodnych randomizowanych sekwencji o składzie oligonukleotydowym zbliżonym do sekwencji wejściowych. Zwykle sekwencje genomowe złożonych eukariontów nie są jednorodne pod względem składu, ale raczej reprezentują złożoną mozaikę segmentów sekwencji wzbogaconych o określone nukleotydy (na przykład bogate w puryny, bogate w (G + T), (A + T) itp.). Te wzorce w średniej skali zakresu (30-1000 pz) są wizualizowane przez graficzne dane wyjściowe analizatora MRI, które pokazują wybrane segmenty bogate w treść jako górne niebieskie kolce, a segmenty o niskiej zawartości jako dolne czerwone skoki (patrz rysunki 1 i 2). Zazwyczaj liczba dowolnych regionów bogatych i ubogich w treść w naturalnej sekwencji (ryc. 1) jest o rząd razy wyższa niż liczba tych samych typów regionów w odpowiednich randomizowanych sekwencjach (ryc. 2) o tym samym składzie oligonukleotydowym. Te segmenty sekwencji ze średnią niejednorodnością składu nukleotydów mogą być interesujące dla użytkownika. Są one dostępne w plikach wyjściowych Genomic MRI do dalszych badań.

Rysunek 1. Przykład graficznego wyjścia analizatora MRI z kroku 5.7. Wyniki uzyskano na próbie 44 ludzkich intronów. Niebieskie słupki reprezentują pozycje regionów bogatych w GC wzdłuż tych intronów. Czerwone słupki reprezentują regiony MRI ubogie w GC (lub bogate w AT). Oś y zawiera górny i dolny próg dla danego typu zawartości.

Rysunek 2.Wyjście analizatora MRI dla sekwencji losowej "userfile.rand1_4".
Graficzna reprezentacja MRI w sekwencji wygenerowanej losowo za pomocą programu generatora SRI.

Rysunek 3.Przykład początku tekstowego pliku wyjściowego z analizatora MRI.
Wszystkie sekwencje bogate i ubogie w treść wykryte przez program są przedstawione w ostatniej (czwartej) kolumnie. Ich względne położenie, mierzone liczbą okien, przedstawiono w pierwszej kolumnie. Druga i trzecia kolumna to wskaźniki odpowiednio dla regionów bogatych i ubogich w treść.

Discussion

Regiony o niejednorodnym składzie nukleotydów w średnich skalach (30-1000 nukleotydów) są nadmierne w genomach złożonych eukariontów i można je znaleźć wszędzie (regiony międzygenowe, introny, nieulegające translacji regiony eksonów, powtarzające się elementy). Regiony te są często związane z nietypowymi konformacjami DNA. Na przykład sekwencje bogate w puryny/pirymidyny mają tendencję do tworzenia tripleksów DNA (H-DNA); sekwencje z naprzemiennymi zasadami purynowymi / pirymidynowymi są związane z konformacjami Z-DNA; Regiony bogate w (G + C) wykazują nieprawidłowości strukturalne w B-DNA i mogą być podatne na rozszczepienie kręgosłupa; Regiony bogate w (A+T) mogą tworzyć niezwykłą strukturę - element rozwijający DNA; itd. (zrecenzowane przez Fedorov & Fedorova 2010). Niektóre z tych wzorców średniego zakresu (np. regiony bogate w (G+T)) są prawie niezbadane i nadal czekają na dokładne zbadanie i rozpoznanie. Głównym celem naszego zasobu internetowego Genomic MRI jest pomoc użytkownikom w identyfikacji tych regionów MRI w celu ich dalszej analizy eksperymentalnej i zbadania ich możliwych funkcji. Wiedza na temat regionów MRI może zostać włączona do nowej generacji programów predykcyjnych genów i udoskonalić je (Shepard 2010) oraz pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji i właściwości genomu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komputer z plikami internetowymi
z sekwencjami nukleotydowymi do badania