Artykuł metodologiczny

Charakterystyka bakteryjnych substancji lotnych za pomocą spektrometrii mas z jonizacją wtórną i rozpylaniem (SESI-MS)

DOI:

10.3791/2664

⸱

8 czerwca 2011

 ,  , 
1School of Engineering, University of Vermont

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas z jonizacją wtórną (SESI-MS) umożliwia wykrywanie lotnych związków organicznych (LZO) bez potrzeby wstępnej obróbki próbki. Protokół ten zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakterystyki bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas z jonizacją wtórną (SESI-MS) to metoda opracowana do szybkiego wykrywania związków lotnych, bez potrzeby wstępnej obróbki próbki. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Fenna i współpracowników1 i została zastosowana do wykrywania nielegalnych narkotyków2 i materiałów wybuchowych3-4, charakterystyki substancji lotnych na skórze5 oraz analizy oddechu6-7.

Jonizacja SESI zachodzi w wyniku reakcji transferu protonów między roztworem elektrorozpylania a lotnym analitem, a zatem nadaje się do analizy cząsteczek heteroorganicznych, tak jak w tradycyjnej jonizacji elektronrozpylającej (ESI). Jednak w przeciwieństwie do standardowego ESI, proces przenoszenia protonów w SESI zachodzi w fazie gazowej, a nie w roztworze (rys. 1), dlatego SESI najlepiej nadaje się do wykrywania organicznych substancji lotnych i aerozoli.

Rozszerzamy zastosowanie SESI-MS do wykrywania substancji lotnych bakterii jako metody identyfikacji i charakterystyki bakterii8. Wykazaliśmy, że lotne odciski palców SESI-MS, w połączeniu z metodą analizy statystycznej, mogą być wykorzystywane do różnicowania rodzajów bakterii, gatunków i mieszanych kultur w różnych pożywkach wzrostowych. 8 W tym miejscu przedstawiamy etapy uzyskiwania bakteryjnych lotnych odcisków palców za pomocą SESI-MS, w tym parametry instrumentalne, które należy zoptymalizować, aby zapewnić solidną identyfikację i charakterystykę bakterii.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat analizy substancji lotnych w SESI-MS. Przestrzeń nad powierzchnią kultury bakteryjnej jest przemieszczana przez CO2 (1) do komory reakcyjnej SESI (2). Gdy substancje lotne przechodzą przez komorę reakcyjną SESI, przechodzą przez chmurę elektrorozpylania i ulegają jonizacji (3). Po zjonizowaniu substancje lotne są wciągane do spektrometru mas w celu analizy (4). Nadmiar gazu nośnego i nieprzereagowane substancje lotne bakteryjne są przepuszczane przez filtr 0,22 μm (5), jako dodatkowy środek ochrony, i odprowadzane do okapu chemicznego. Wstawka: Igła do elektrorozpylania SESI to kapilara krzemionkowa (40 μm ID) z zaostrzoną końcówką igły.

Jako demonstracja użycia SESI-MS do charakterystyki substancji lotnych bakterii, E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1 są hodowane tlenowo przez 24 godziny w 50 ml LB-Lennox w temperaturze 37 °C, a widma SESI-MS substancji lotnych w przestrzeni nad powierzchnią są zbierane w ciągu 2 minut. Dwutlenek węgla (99,99 %) o natężeniu przepływu 2 l/min jest używany jako gaz nośny do dostarczania substancji lotnych do komory reakcyjnej. Komora reakcyjna SESI została zbudowana na zamówienie i zamontowana w API-3000 (SCIEX), zastępując oryginalne źródło jonów elektrorozpylania. Widma są zbierane w trybie jonów dodatnich przy użyciu 0,1% kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu i 94,9% wody (v/v) jako roztworu elektrorozpylania, dostarczanego z prędkością 5 nL/s przez nieprzewodzącą kapilę krzemionkową z zaostrzoną końcówką igły (40 μm ID). Przyłożone napięcie wynosi 2,5 kV. Oprogramowanie Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems) służy do zbierania danych o następujących parametrach: 20 – 500 Da, tryb MCA, 40 skanów, 3 s/skan i 2 min całkowity czas analizy.

1. System hodowli

  1. Wybierz odpowiednie naczynie do uprawy kultur, biorąc pod uwagę wymagania dotyczące wzrostu gatunków w eksperymencie (np. napowietrzanie, światło, temperatury itp.), a także wydajne dostarczanie substancji lotnych do spektrometru masowego. Butelki hodowlane, które wybieramy, to standardowe 100 ml Pyrex Butelki z mediami wyposażone w gwintowane nakrętki, które mają co najmniej dwa porty Luer. Przez jeden port luer wprowadza się przewód dolotowy w celu doprowadzenia gazu nośnego do butelkę z próbką i przewód wylotowy wprowadza się przez inny port w celu dostarczenia LZO do urządzenia (rysunek 1). Wszystkie dodatkowe porty są podłączone.
  2. Przed hodowlą próbek należy zwiększyć ciśnienie w naczyniach i zanurzyć je w wodzie, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych Skutkuje to słabymi lub nieobecnymi sygnałami jonów lotnych.

2. Eksperyment biologiczny: konfiguracja i względy bezpieczeństwa

  1. Uprawiajcie swoje kultury w warunkach odpowiednich dla waszej hipotezy. Zaleca się, aby dla każdej zmiennej stosować co najmniej dwie kontrpróby biologiczne, z których każda składa się z dwóch kontrprób technicznych.
  2. Przygotować ślepą próbę dla każdego warunku hodowli (pożywka, antybiotyki itp.) i inkubować ślepą próbę w tych samych warunkach, co próbki.
  3. Stosuj środki ostrożności, które są odpowiednie dla używanych czynników biologicznych, biorąc pod uwagę poziom bezpieczeństwa biologicznego danego gatunku.
  4. Aby zapobiec zanieczyszczeniu instrumentu i przewodów przesyłowych gazu żywymi czynnikami biologicznymi, należy zainstalować filtry o odpowiedniej wielkości porów w przewodzie gazu nośnego. Filtry nie będą przeszkadzać w przenoszeniu substancji lotnych do komory reakcyjnej SESI, ale mogą nieznacznie wpłynąć na efektywność transferu aerozoli. 6
  5. Podczas zakładania nasadki do przenoszenia gazu do butelki hodowlanej należy użyć wtórnej hermetyzacji lub komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić prawidłowe zabezpieczenie w przypadku rozlania środków biologicznych.
  6. Zainicjuj i zakończ przepływ gazu nośnego do butelki z próbką w taki sposób, aby nie wytwarzać ciśnienia wewnątrz butelki.

3. Optymalizacja urządzeń

UWAGA: SESI-MS jest specjalnie zaprojektowany do pobierania próbek substancji lotnych, więc ogranicz używanie pachnących artykułów higieny osobistej (np. wód kolońskich, płynu do płukania ust, płyny, płyn do zmiękczania tkanin), guma do żucia, papierosy itp. przed użyciem instrumentu. Szczelnie zakryj wszystkie lotne chemikalia w laboratorium i kontroluj przeciągi powietrza tak bardzo, jak to tylko możliwe. możliwe podczas testów.

Następujące parametry instrumentalne, które wpływają na intensywność i stabilność sygnału, będą musiały zostać zoptymalizowane dla twojego instrumentu i eksperymentu.

  1. Roztwór do elektrorozpylania i natężenie przepływu: Wybierz odpowiedni roztwór elektrorozpylania dla klasy cząsteczek, na które chcesz celować, biorąc pod uwagę polarność przyrządu operacyjnego (tryb jonów dodatnich lub ujemnych) i charakter molekularny związków docelowych. W tym eksperymencie roztwór elektrorozpylania składa się z 0,1% kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu, 94,9% wody (v/v), co zwiększa intensywność sygnału mniej polarnych cząsteczek, zapewniając jednocześnie dobrą stabilność sygnału. Roztwór jest dostarczany z natężeniem przepływu 5 nL/s.
  2. Natężenie przepływu gazu nośnego: Natężenie przepływu gazu nośnego może wpływać na stabilność elektrorozpylania i intensywność sygnału. Stosowany jest przy tym CO2 (≥ 99,99%) przy natężeniu przepływu 2 l/min.
  3. Kształt i położenie igły: Kształt i położenie końcówki igły silnie wpływają na intensywność i stabilność sygnału. Podczas instalowania nowej igły pozycja igły musi być zoptymalizowana, aby stworzyć równowagę między niskim tłem, wysoką intensywnością sygnału analitu i stabilnością sygnału. Aby odtworzyć widma SESI po zmianie igły, konieczne jest okresowe zbieranie widm podczas dostosowywania pozycji igły, aż będziesz w stanie dopasować obserwowane widmo do swoich zapisów. Odległość od końcówki igły do elektrorozpylania do otworu o określonej masie będzie wynosić 1 – 5 mm.
  4. Przyłożone napięcie: Napięcie, które jest przyłożone do systemu, wpływa na intensywność jonów sygnału i stabilność stożka Taylora elektrorozpylania. Dodatkowo, optymalne napięcie zależy od roztworu elektrorozpylania i kształtu końcówki igły. Na początku serii eksperymentów określ napięcie, które zapewnia optymalne widmo i stabilność sygnału dla twojego systemu, a następnie użyj tego napięcia do wszystkie kolejne eksperymenty. W naszym systemie zastosowane napięcia 2,0 - 5,0 kV zapewniają optymalną intensywność sygnału i stabilność elektrorozpylania. W tym eksperymencie stosuje się napięcie 2,5 kV.

4. Włączanie i dostrajanie SESI-MS do analizy

  1. Zacznij od upewnienia się, że voltage zasilanie jest wyłączone i że system jest rozładowany z energii elektrycznej. Zrób to, 1) upewniając się, że lampki kontrolne na zasilaniu są wyłączone, 2) upewniając się, że napięcie na multimetrze wynosi zero i 3) uziemiając przewody elektryczne.
  2. Zainstaluj odpowiedni roztwór elektrorozpylania do swojego eksperymentu.
  3. Włącz gaz nośny i ustaw przepływ na szybkość odpowiednią dla Twojego eksperymentu.
  4. Zastosować ciśnienie w zbiorniku elektrorozpylania, aby zainicjować dostarczanie roztworu elektrorozpylania do komory reakcyjnej.
  5. Włącz zasilanie napięciem i dostosuj napięcie do odpowiedniej wartości dla swoich eksperymentów.

UWAGA: W tym momencie metalowe powierzchnie źródła jonizacji są w stanie wywołać niebezpieczne uderzenie. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy przy instrumencie po włączeniu zasilania.

  1. Ustaw metodę dostrajania do monitorowania widma SESI-MS podczas dokonywania precyzyjnych regulacji przyłożonego napięcia. Użyj parametrów pozyskiwania, które zostały zoptymalizowane dla systemu i eksperymentu. Wyczyść pole wyboru Multiple Channel Acquisition (MCA) (jeśli dotyczy), aby każde skanowanie generowało niezależne widmo, ustaw czas akwizycji na 10–15 minut i rozpocznij akwizycję. Widma tła gazu nośnego powinny być teraz obserwowane.
  2. Dokonaj precyzyjnych regulacji przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny chromatogram jonów całkowitych (TIC) i powtarzalne skany, które pasują do   skanów CO2 dla poprzednich eksperymentów. Po dokonaniu regulacji napięcia kontynuuj zbieranie widm i TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument jest ustabilizowany.
  3. Po zapewnieniu stabilności instrumentalnej skonfiguruj metodę akwizycji odpowiednią dla swoich próbek, dostosowując czas akwizycji, zakres danych i wybór MCA zgodnie z potrzebami. Zbierz widmo tła gazu nośnego do swojej dokumentacji.

5. Uzyskanie lotnego odcisku palca swojej kultury bakteryjnej

  1. Aby zebrać widmo ślepej próby, skieruj przepływ gazu nośnego przez przewody obejściowe, a następnie podłącz ślepą próbkę (zawory zamknięte) do przewodów przesyłowych gazu przyrządu.
  2. Otwórz zawory do butelki z próbką i zamknij zawory przewodów obejściowych.
  3. Pozwól systemowi zrównoważyć się przez 30 sekund, w tym czasie wilgotność w komorze reakcyjnej stabilizuje się. Ten okres równowagi jest niezbędny do uzyskania powtarzalnych widm. Aby upewnić się, że system jest zrównoważony, możesz chcieć monitorować TIC, który zmieni się w okresie równowagi, a następnie ustabilizuje się.
  4. Gdy system zostanie zrównoważony, rozpocznij zbieranie widma.
  5. Po zebraniu widma wyjmij butelkę z próbką, najpierw otwierając przewody obejściowe gazu nośnego, następnie zamykając zawory próbki, a na końcu wyjmując butelkę z próbką. Przepłukać system gazem nośnym przez 2 – 4 minuty, usuwając wilgoć i zaadsorbowane substancje lotne z przewodów przesyłowych, zapobiegając przenoszeniu próbki do próbki.
  6. Powtórz kroki 5.2 - 5.5 dla każdej próbki bakteryjnej, sporadycznie zbierając dodatkowe widma ślepe, aby zapewnić dokładne odejmowanie ślepej próby. Niepełne odejmowanie ślepej próby doprowadzi do pojawienia się pików tła chemicznego w przetwarzanym spektrum, które są powszechne w technikach jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (np. ftalany, silikony itp.). 9
  7. Podczas zbierania widm upewnij się, że sygnały jonowe nie przekraczają liniowych limitów detekcji twojego instrumentu, określonych przez TIC i maksymalną intensywność poszczególnych pików. Jony przekraczające górne limity detektora urządzenia mogą generować piki artefaktów, które nie są reprezentatywne dla próbki.

6. Reprezentatywne wyniki

Jako przykład widm SESI-MS, które można uzyskać dla substancji lotnych bakterii, pokazane są lotne odciski palców E. coli i P. aeruginosa w trybie jonów dodatnich uprawianych tlenowo w LB-Lennox przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (Rys. 2). Widmo lotne E. coli jest zdominowane przez indol w m/z = 118, co nadaje kulturom E. coli charakterystyczny zapach, podczas gdy widmo P. aeruginosa zawiera większą różnorodność pików protonacyjnych.

Proszę zauważyć, że względne intensywności pików w widmie lotnym są zależne od parametrów instrumentalnych opisanych w sekcji 3. Parametry te muszą być ściśle kontrolowane z eksperymentu na eksperyment w celu uzyskania powtarzalnych widm.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Widma SESI-MS w trybie ślepych jonów dodatnich (20 – 150 m/z) substancji lotnych E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1 po 24 godzinach wzrostu tlenowego w LB-Lennox w temperaturze 37 °C. Więcej szczegółów na temat pików obserwowanych w widmach SESI można znaleźć w artykule Zhu i in. 8.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie wytwarzają różne kombinacje substancji lotnych, które można wykorzystać do identyfikacji bakterii10-12 i oceny metabolizmu stan. Opisana tutaj metoda SESI-MS umożliwia szybkie scharakteryzowanie substancji lotnych bakterii (w czasie dwóch minut lub krótszym) bez konieczności przygotowania próbki, generowanie bakteryjnego "odcisku palca" w celu identyfikacji gatunku. 8 W ciągu ostatnich kilku dekad inne techniki jonizacji MS pod ciśnieniem atmosferycznym zostały zastosowane do charakterystyki związków lotnych, w tym spektrometrii mas z selektywnym przepływem jonów (SIFT) i reakcji transferu protonów (PTR). Charakterystyczną przewagą SESI nad innymi metodami jonizacji jest to, że możliwe jest fragmentowanie określonych pików (pod warunkiem typ spektrometru mas został dostosowany do SESI), który jest ważnym narzędziem do identyfikacji związków. Trybunał nie odniósł się do szczytowego rozdrobnienia protokół wymieniony powyżej, ale przykłady wykorzystania informacji o fragmentacji w charakterystyce lotnych substancji bakteryjnych można znaleźć w Zhu i wsp.8

SESI-MS ma bezpośrednie zastosowanie do wykrywania in situ bakteryjnych zakażeń płuc za pomocą analizy wydychanego powietrza, ale może również stosuje się do wszelkich warunków, w których możliwe jest pobieranie próbek z substancji lotnych. Na przykład analizy substancji lotnych w moczu, krwi i oddechu, które są istotne w diagnostyce zaburzeń metabolicznych, chorób żołądkowo-jelitowych, nowotworów i narażenia środowiskowego, dobrze nadają się do SESI-MS. Pytania z kategorii 13,14 SESI-MS posiada również szeroki zakres nieklinicznych zastosowań odcisków palców LZO, w tym szybką analizę żywności pod kątem tej cechy substancje lotne związane z dojrzewaniem, starzeniem się lub psuciem. 15-18

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez grant NIH P20 RR021905-01, grant CF RPD STANTO07R0 oraz grant NASA NNH09ZNE002C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
API-3000 Potrójny instrument kwadrupolowySCIEXzakupiony z Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
Instrumentźródła jonów SESIwykonany na zamówienie; Patrz odniesienie 6
Przepływomierz gazuSprzętCole-ParmerEW-03217-74
Dwutlenek węglaSprzętAirgasCD I300≥ Sprzęt 99,99% czystego
azotuAirgasNI UHP300Ultra wysokiej czystości
100 ml szklane butelki na mediaWyposażenieVWR international89012-114GL45 gwinty
Kapsle do butelek z portami typu luerSprzętBio Chem Fluidics00945T-3Zespół nasadki
Zaślepki portu LuerSprzętBio Chem Fluidics009LPZespół nasadki
Rurka 1/4" (OD) x 1/8" (ID)SprzętCole-ParmerEW-95875-02Zespół nasadki i linie przesyłu gazu
Rurki 1/8" (OD) x 1/16" (ID)WyposażenieCole-ParmerEW-06605-27Zespół nasadki
Zawory dwudrogoweWyposażenieCole-Parmer07391-04Zespół nasadki
Filtr, klasa AAQSprzętBalston Filters9922-05
Kwas mrówkowy, odczynnik klasy LC/MSFisher ScientificA117-05AMPRoztwór do elektrorozpylania
Metanol, odczynnik klasy LC/MSFisher ScientificA456-500Roztwór do elektrorozpylania
Woda, odczynnik klasy LC/MSFisher ScientificW6-500Roztwór do elektrorozpylania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).
  2. Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs. Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).
  3. Tam, M., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection. Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).
  4. Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).
  5. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. On-line detection of human skin vapors. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).
  6. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).
  7. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).
  8. Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).
  9. Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. Pathogen detection using headspace analysis. , Department of the Air Force. 16-16 (2004).
  10. Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study. Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).
  11. Schulz, S., Dickschat, J. S. Bacterial volatiles: The smell of small organisms. Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).
  12. Ligor, T. Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).
  13. Cao, W. Q., Duan, Y. X. Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment. Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).
  14. Law, W. S. Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).
  15. Wu, Z. Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).
  16. Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. Volatile organic compounds in foods: A five year study. J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).
  17. Calkins, C. R., Hodgen, J. M. A fresh look at meat flavor. Meat Sci. 77, 63-80 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Volatile FingerprintingCarrier Gas FlowElectrospray SolutionInstrumental ParametersBlank SpectrumHeadspace AnalysisVolatile Detection

Powiązane artykuły