Artykuł metodologiczny

Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)

21.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2664

⸱

8 czerwca 2011

 ,  , 
1School of Engineering, University of Vermont

W tym artykule

Podsumowanie

Wtórna spektrometria mas z jonizacją przez elektrorozpylanie (SESI-MS) umożliwia detekcję lotnych związków organicznych (LZO) bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Niniejszy protokół zawiera instrukcje dotyczące szybkiej (w ciągu kilku minut) charakteryzacji bakteryjnych LZO przy użyciu SESI-MS.

Streszczenie

Wtórna spektrometria mas z jonizacją z rozpylania elektrostatycznego (SESI-MS) jest metodą opracowaną do szybkiego wykrywania związków lotnych, bez konieczności wstępnego przygotowania próbek. Metoda ta została po raz pierwszy opisana przez Fenna i współpracowników1 i była stosowana do wykrywania nielegalnych narkotyków2 oraz materiałów wybuchowych3-4, charakterystyki substancji lotnych skóry5 oraz analizy wydychanego powietrza6-7.

Jonizacja SESI zachodzi poprzez reakcje przeniesienia protonu pomiędzy roztworem elektrospray a lotnym analitym, w związku z czym jest ona odpowiednia do analizy cząsteczek heteroorganicznych, podobnie jak w tradycyjnej jonizacji z rozpylaniem elektrostatycznym (ESI). Jednak w przeciwieństwie do standardowej metody ESI, proces przeniesienia protonu w SESI odbywa się w fazie par, a nie w roztworze (Rys. 1), dlatego SESI najlepiej nadaje się do wykrywania lotnych związków organicznych i aerozoli.

Rozszerzamy zastosowanie techniki SESI-MS na detekcję lotnych związków bakteryjnych jako metodę identyfikacji i charakterystyki bakterii8. Wykazaliśmy, że tworzenie odcisków palców lotnych związków za pomocą SESI-MS, w połączeniu z metodą analizy statystycznej, może być wykorzystywane do rozróżniania rodzajów, gatunków i kultur mieszanych bakterii w różnych pożywkach wzrostowych.8 W niniejszym opracowaniu przedstawiamy etapy uzyskiwania odcisków palców lotnych związków bakteryjnych przy użyciu SESI-MS, w tym parametry instrumentalne, które należy zoptymalizować, aby zapewnić wiarygodną identyfikację i charakterystykę bakterii.

Protokół

Schemat spektrometru mas SESI, konfiguracja wlotu CO2, analiza emisji, wyniki widma masowego.
Rycina 1. Schemat analizy lotnych związków bakteryjnych metodą SESI-MS. Gaz z przestrzeni nad kulturą bakterii jest wypierany przez CO2 (1) do komory reakcyjnej SESI (2). Przechodząc przez komorę reakcyjną SESI, substancje lotne przechodzą przez chmurę elektrosprayową i ulegają jonizacji (3). Po zjonizowaniu substancje lotne są zasysane do spektrometru mas w celu analizy (4). Nadmiar gazu nośnego i nieprzereagowane lotne związki bakteryjne przechodzą przez filtr 0,22 μm (5), jako dodatkowy środek ochronny, i są odprowadzane do dygestorium. Wstawka: Igła elektrosprayowa SESI to kapilara krzemionkowa (40 μm ID) z zaostrzoną końcówką igły.

W celu zademonstrowania zastosowania SESI-MS do charakterystyki lotnych związków bakteryjnych, szczepy E. coli K12 oraz P. aeruginosa PAO1 hodowano tlenowo przez 24 h w 50 mL pożywki LB-Lennox w temperaturze 37 °C, a następnie w ciągu 2 minut zarejestrowano widma SESI-MS lotnych związków z przestrzeni nad próbką. Jako gaz nośny do transportu związków lotnych do komory reakcyjnej zastosowano dwutlenek węgla (99,99 %) z przepływem 2 L/min. Komora reakcyjna SESI została zbudowana na zamówienie i zamontowana w urządzeniu API-3000 (SCIEX), zastępując oryginalne źródło jonizacji przez elektrorspray. Widma zbierano w trybie jonów dodatnich, wykorzystując roztwór do elektrorspray składający się z 0,1 % kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu i 94,9 % wody (v/v), podawany z prędkością 5 nL/s przez nieprzewodzącą kapilarę krzemionkową z zaostrzonym końcem igły (40 μm ID). Zastosowane napięcie wyniosło 2,5 kV. Do gromadzenia danych wykorzystano oprogramowanie Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems) z następującymi parametrami: zakres 20 – 500 Da, tryb MCA, 40 skanów, 3 s/skan oraz całkowity czas analizy wynoszący 2 min.

1. System hodowlany

  1. Wybierz odpowiednie naczynie do hodowli kultur, biorąc pod uwagę wymagania wzrostowe gatunków w Twoim eksperymencie (np. napowietrzanie, światło, temperaturę itp.) oraz wydajny dopływ lotnych związków do spektrometru mas. W tym przypadku wykorzystano standardowe butelki Pyrex o pojemności 100 mL z nakrętkami gwintowymi wyposażonymi w co najmniej dwa porty luer. Przez jeden port luer wprowadza się linię wlotową do doprowadzania gazu nośnego do butelki z próbką, a przez drugi port linię wylotową do transportu VOC do instrumentu (Rycina 1). Pozostałe porty zostają zatkane.
  2. Przed rozpoczęciem hodowli próbek należy poddać naczynia ciśnieniu i zanurzyć w wodzie w celu sprawdzenia szczelności. Wycieki gazu są główną przyczyną nietypowych wyników w postaci słabych lub nieobecnych sygnałów jonów lotnych.

2. Eksperyment biologiczny: konfiguracja i kwestie bezpieczeństwa

  1. Hoduj kultury w warunkach odpowiednich dla postawionej hipotezy. Zaleca się zastosowanie co najmniej dwóch powtórzeń biologicznych, z których każde obejmuje dwa powtórzenia techniczne dla każdej zmiennej.
  2. Przygotuj próbę ślepą dla każdego z warunków hodowli (pożywka, antybiotyki itp.) i inkubuj ją w tych samych warunkach co próbki.
  3. Stosuj środki ostrożności odpowiednie dla używanych czynników biologicznych, biorąc pod uwagę poziom bezpieczeństwa biologicznego danego gatunku.
  4. Aby zapobiec kontaminacji instrumentu oraz linii przesyłu gazu żywymi czynnikami biologicznymi, zainstaluj w linii gazu nośnego filtry o odpowiedniej wielkości porów. Filtry nie będą zakłócać transportu substancji lotnych do komory reakcyjnej SESI, ale mogą nieznacznie wpłynąć na wydajność transportu aerozolu.6
  5. Podczas mocowania nakrętki przesyłowej gazu do butelki z kulturą stosuj wtórne zabezpieczenie lub komorę z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić właściwą izolację w przypadku rozlania czynników biologicznych.
  6. Uruchamiaj i zatrzymuj przepływ gazu nośnego do butelki z próbką w sposób, który nie doprowadzi do wzrostu ciśnienia wewnątrz butelki.

3. Optymalizacja instrumentu

UWAGA: Metoda SESI-MS jest zaprojektowana specjalnie do pobierania próbek substancji lotnych, dlatego przed użyciem instrumentu należy ograniczyć stosowanie pachnących kosmetyków i artykułów higienicznych (np. wód kolońskich, płynów do płukania jamy ustnej, balsamów, płynów do płukania tkanin), żucia gumy, palenia papierosów itp. Wszystkie lotne odczynniki chemiczne w laboratorium powinny być szczelnie zamknięte, a podczas testów należy w maksymalnym stopniu kontrolować przeciągi w pomieszczeniu.

Następujące parametry aparatury, które wpływają na intensywność i stabilność sygnału, będą wymagały optymalizacji dla Twojego urządzenia i eksperymentu.

  1. Roztwór do elektrorozpylania i szybkość przepływu: Wybierz odpowiedni roztwór do elektrorozpylania dla klasy cząsteczek, które chcesz analizować, biorąc pod uwagę polaryzację instrumentu (tryb jonów dodatnich lub ujemnych) oraz charakter chemiczny związków docelowych. W tym doświadczeniu roztwór do elektrorozpylania to 0,1% kwasu mrówkowego, 5,0% metanolu, 94,9% wody (v/v), co zwiększa intensywność sygnału mniej polarnych cząsteczek, zapewniając jednocześnie dobrą stabilność sygnału. Roztwór jest podawany z szybkością przepływu 5 nL/s.
  2. Szybkość przepływu gazu nośnego: Szybkość przepływu gazu nośnego może wpływać na stabilność elektrorozpylania i intensywność sygnału. W tym przypadku stosuje się CO2 (≥ 99,99%) z szybkością przepływu 2 L/min.
  3. Kształt i pozycja igły: Kształt końcówki igły i jej pozycja silnie wpływają na intensywność i stabilność sygnału. Podczas instalacji nowej igły należy zoptymalizować jej pozycję, aby uzyskać równowagę między niskim tłem, wysoką intensywnością sygnału analitycznego a stabilnością sygnału. Aby odtworzyć widma SESI po wymianie igły, konieczne jest okresowe gromadzenie widm podczas regulacji pozycji igły, aż do momentu dopasowania obserwowanego widma do zapisów. Odległość od końcówki igły do elektrorozpylania do wlotu spektrometru mas wynosi 1 – 5 mm.
  4. Przyłożone napięcie: Napięcie przyłożone do układu wpływa na intensywność jonów sygnału oraz stabilność stożka Taylora w procesie elektrorozpylania. Ponadto optymalne napięcie zależy od zastosowanego roztworu do elektrorozpylania i kształtu końcówki igły. Na początku serii doświadczeń należy określić napięcie, które zapewnia optymalne widmo i stabilność sygnału dla danego układu, a następnie stosować to napięcie we wszystkich kolejnych badaniach. W naszym układzie napięcia w zakresie 2,0 - 5,0 kV zapewniają optymalną intensywność sygnału i stabilność elektrorozpylania. W tym doświadczeniu zastosowano napięcie 2,5 kV.

4. Włączanie i strojenie układu SESI-MS do analizy

  1. Zacznij od upewnienia się, że zasilacz jest wyłączony, a system jest rozładowany elektrycznie. Zrób to poprzez: 1) sprawdzenie, czy kontrolki na zasilaczu są wyłączone, 2) upewnienie się, że multimetr wskazuje wartość zero oraz 3) uziemienie przewodów elektrycznych.
  2. Wprowadź odpowiedni roztwór do elektrosprayu dla swojego eksperymentu.
  3. Włącz gaz nośny i ustaw przepływ na wartość odpowiednią dla Twojego eksperymentu.
  4. Przyłoż ciśnienie do zbiornika elektrosprayu, aby rozpocząć podawanie roztworu do komory reakcyjnej.
  5. Włącz zasilacz i dostosuj napięcie do wartości odpowiedniej dla Twoich eksperymentów.

UWAGA: Na tym etapie metalowe powierzchnie źródła jonizacji mogą doprowadzić do niebezpiecznego porażenia prądem. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z urządzeniem po włączeniu zasilania wysokiego napięcia.

  1. Skonfiguruj metodę strojenia w celu monitorowania widma SESI-MS podczas wprowadzania precyzyjnych korekt przyłożonego napięcia. Użyj parametrów akwizycji, które zostały zoptymalizowane dla Twojego systemu i eksperymentu. Odznacz pole wyboru Multiple Channel Acquisition (MCA) (jeśli jest dotyczy), aby każdy skan generował niezależne widmo, ustaw czas akwizycji na 10 – 15 min i rozpocznij pomiar. Powinny być teraz widoczne widma tła gazu nośnego.
  2. Wprowadź precyzyjne korekty przyłożonego napięcia, aby uzyskać stabilny całkowity chromatogram jonowy (TIC) oraz powtarzalne skany zgodne ze skanami CO2 z poprzednich eksperymentów. Po dokonaniu korekt napięcia kontynuuj zbieranie widm i TIC przez pięć minut, aby upewnić się, że instrument uległ stabilizacji.
  3. Po zapewnieniu stabilności instrumentu skonfiguruj metodę akwizycji odpowiednio dla Twoich próbek, dostosowując czas akwizycji, zakres danych oraz wybór MCA zgodnie z potrzebami. Zbierz widmo tła gazu nośnego do dokumentacji.

5. Uzyskiwanie profilu lotnych związków organicznych hodowli bakteryjnej

  1. Aby zarejestrować widmo tła, skieruj przepływ gazu nośnego przez linie obejściowe, a następnie podłącz próbkę tła (przy zamkniętych zaworach) do linii przesyłowych gazu w urządzeniu.
  2. Otwórz zawory prowadzące do butelki z próbką i zamknij zawory linii obejściowych.
  3. Pozostaw system do wyrównania przez 30 s, podczas których wilgotność w komorze reakcyjnej ulega stabilizacji. Ten okres wyrównywania jest niezbędny do uzyskania powtarzalnych widm. Aby upewnić się, że system osiągnął stan równowagi, można monitorować TIC, który będzie ulegał zmianom w okresie wyrównywania, a następnie ustabilizuje się.
  4. Po wyrównaniu systemu rozpocznij rejestrację widma.
  5. Po zarejestrowaniu widma usuń butelkę z próbką, najpierw otwierając linie obejściowe gazu nośnego, następnie zamykając zawory próbki i na koniec odłączając butelkę z próbką. Przepłucz system gazem nośnym przez 2 – 4 min, aby usunąć wilgoć i zaadsorbowane substancje lotne z linii przesyłowych, co zapobiegnie przenoszeniu zanieczyszczeń między próbkami.
  6. Powtórz kroki 5.2 - 5.5 dla każdej próbki bakteryjnej, okresowo rejestrując dodatkowe widma tła, aby zapewnić dokładne odjęcie tła. Niepełne odjęcie tła doprowadzi do pojawienia się w przetworzonym widmie pików tła chemicznego, które są powszechne w technikach jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (np. ftalany, silikony itp.).9
  7. Podczas rejestracji widm upewnij się, że sygnały jonowe nie przekraczają liniowych limitów detekcji urządzenia, co można określić na podstawie TIC i maksymalnej intensywności poszczególnych pików. Jony przekraczające górne limity detektora urządzenia mogą generować piki artefaktowe, które nie są reprezentatywne dla próbki.

6. Reprezentatywne wyniki

Jako przykład widm SESI-MS, które można uzyskać dla lotnych związków bakteryjnych, przedstawiono odciski palców substancji lotnych w trybie jonów dodatnich dla E. coli oraz P. aeruginosa hodowanych tlenowo w pożywce LB-Lennox przez 24 h w temperaturze 37 °C (Ryc. 2). W widmie lotnych związków E. coli dominuje indol przy m/z = 118, który nadaje kulturom E. coli charakterystyczny zapach, podczas gdy widmo P. aeruginosa zawiera większą różnorodność pików podatnych na protonowanie.

Należy pamiętać, że względne intensywności pików w widmie substancji lotnych zależą od parametrów instrumentalnych opisanych w Sekcji 3. Parametry te muszą być ściśle kontrolowane pomiędzy poszczególnymi eksperymentami, aby uzyskać powtarzalne widma.

Analiza spektrometrii masowej; E. coli vs P. aeruginosa; intensywność vs m/z; wykres porównawczy.
Rysunek 2. Widma SESI-MS w trybie jonów dodatnich (20 – 150 m/z) po odjęciu tła dla substancji lotnych E. coli K12 i P. aeruginosa PAO1 po 24 h wzrostu tlenowego w podłożu LB-Lennox w temperaturze 37 °C. Więcej szczegółów na temat pików zaobserwowanych w widmach SESI znajduje się w pracy Zhu, et al. 8.

Dyskusja

Bakterie produkują różne kombinacje związków lotnych, które mogą być wykorzystywane do identyfikacji bakteryjnej10-12 oraz oceny stanu metabolicznego. Opisana tutaj metoda SESI-MS umożliwia szybką charakterystykę lotnych związków bakteryjnych (w czasie dwóch minut lub krócej) bez konieczności przygotowania próbek, generując bakteryjny „odcisk palca” służący do identyfikacji gatunków.8 W ciągu ostatnich kilku dekad do charakterystyki związków lotnych stosowano inne techniki spektrometrii mas z jonizacją pod ciśnieniem atmosferycznym, w tym spektrometrię mas z selektywnym przepływem jonów w rurce (SIFT) oraz spektrometrię mas z reakcją przeniesienia protonu (PTR). Wyraźną przewagą SESI nad tymi innymi metodami jonizacji jest możliwość fragmentacji konkretnych pikuów (pod warunkiem zastosowania odpowiedniego typu spektrometru mas dostosowanego do SESI), co stanowi istotne narzędzie w identyfikacji związków. W powyższym protokole nie omówiono fragmentacji pikuów; przykłady wykorzystania informacji o fragmentacji w charakterystyce lotnych związków bakteryjnych można znaleźć w pracy Zhu, et al.8

SESI-MS znajduje bezpośrednie zastosowanie w detekcji bakteryjnych infekcji płuc in situ poprzez analizę wydychanego powietrza, ale może być również stosowane w każdym środowisku, w którym możliwe jest pobieranie próbek lotnych substancji. Na przykład analizy związków lotnych w moczu, krwi i oddechu, które są istotne w diagnostyce zaburzeń metabolicznych, chorób żołądkowo-jelitowych, nowotworów oraz ekspozycji na czynniki środowiskowe, są odpowiednie dla metody SESI-MS.13,14 SESI-MS posiada również szeroki zakres pozaklinicznych zastosowań w określaniu „odcisków palców” (fingerprinting) LZO, w tym szybką analizę żywności pod kątem charakterystycznych substancji lotnych związanych z dojrzewaniem, starzeniem się lub psuciem produktów.15-18

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta jest finansowana z grantu NIH P20 RR021905-01, grantu CF RPD STANTO07R0 oraz grantu NASA NNH09ZNE002C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Potrójny kwadrupol API-3000InstrumentSCIEXZakupiono wraz z oprogramowaniem Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
Źródło jonów SESIInstrumentWykonany na zamówienie; patrz odnośnik 6
Przepływomierz gazuSprzętCole-ParmerEW-03217-74
Dwutlenek węglaWyposażenieAirgasCD I300≥ o czystości 99,99%
AzotSprzętAirgasNI UHP300Ultra wysoka czystość
szklane butelki na pożywki o pojemności 100 mlSprzętVWR International89012-114gwinty GL45
Korki do butelek z portami LuerSprzętBio Chem Fluidics00945T-3Zespół nakrętki
Zatyczki do portów LueraSprzętBio Chem Fluidics009LPZestaw nakrętki
Przewód 1/4" (OD) x 1/8" (ID)SprzętCole-ParmerEW-95875-02Zespół nakrętki &linie przesyłowe gazów i wzmacniacz
Przewód 1/8" (OD) x 1/16" (ID)SprzętCole-ParmerEW-06605-27Zespół nasadki
Zawory dwudrożneSprzętCole-Parmer07391-04Zespół zakrętki
Filtr, stopień AAQWyposażenieFiltry Balston9922-05
Kwas mrówkowy, stopień czystości LC/MSOdczynnikFisher ScientificA117-05AMPRoztwór do elektrosprayu
Metanol, stopień LC/MSOdczynnikFisher ScientificA456-500Roztwór do rozpylania elektrosprayowego
Woda, stopień LC/MSOdczynnikFisher ScientificW6-500Roztwór do elektrosprayu

Bibliografia

  1. Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. ESI-MS in the analysis of trace species in gases. Proceedings of the 47th ASMS Conference on Mass Spectrometry Allied Topics, Dallas, TX, , (1999).
  2. Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs. Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).
  3. Tam, M., Hill, H. H. Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection. Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).
  4. Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).
  5. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. On-line detection of human skin vapors. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1060-1063 (2009).
  6. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F. Electrospray ionization of volatiles in breath. Int. J. Mass Spectrom. 265, 68-72 (2007).
  7. Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. F., F, J. Direct analysis of fatty acid vapors in breath by electrospray ionization and atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Anal. Chem. 80, 8210-8215 (2008).
  8. Guo, X. H., Bruins, A. P., Covey, T. R. Characterization of typical chemical background interferences in atmospheric pressure ionization liquid chromatography-mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3145-3150 (2006).
  9. Rudzinski, C. M., Herzig-Marx, R., Lin, J., Szpiro, A., Johnson, B. Pathogen detection using headspace analysis. , Department of the Air Force. 16-16 (2004).
  10. Lechner, M., Fille, M., Hausdorfer, J., Dierich, M., Rieder, J. Diagnosis of bacteria in vitro by mass spectrometric fingerprinting: A pilot study. Curr. Microbiol. 51, 267-269 (2005).
  11. Schulz, S., Dickschat, J. S. Bacterial volatiles: The smell of small organisms. Nat. Prod. Rep. 24, 814-842 (2007).
  12. Ligor, T. Analytical methods for breath investigation. Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 2-12 (2009).
  13. Cao, W. Q., Duan, Y. X. Breath analysis: Potential for clinical diagnosis and exposure assessment. Clin. Chem. 52, 800-811 (2006).
  14. Law, W. S. Rapid characterization of complex viscous liquids at the molecular level. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 8277-8280 (2009).
  15. Wu, Z. Sampling analytes from cheese products for fast detection using neutral desorption extractive electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1549-1556 (2010).
  16. Fleming-Jones, M. E., Smith, R. E. Volatile organic compounds in foods: A five year study. J. Agric. Food Chem. 51, 8120-8127 (2003).
  17. Calkins, C. R., Hodgen, J. M. A fresh look at meat flavor. Meat Sci. 77, 63-80 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odcisk palca substancji lotnychprzepływ gazu nośnegoroztwór do elektrorozpylaniaparametry instrumentalnewidmo tłaanaliza headspacedetekcja substancji lotnych
Charakterystyka lotnych związków bakteryjnych z wykorzystaniem spektrometrii mas z wtórną jonizacją przez elektroryzację (SESI-MS)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.