1. Przygotowanie do immunofluorescencji:
- Aby przygotować powierzchnię do sekcji, wlej elastomer silikonowy Sylgard 184 Silicone Elastomer Base do małej płytki hodowlanej. Upewnij się, że płytka nie jest wypełniona całkowicie, tak aby obszar sekcji znajdował się poniżej krawędzi.
- Przytnij piny sekcyjne do długości około 3.5mm, aby ułatwić manipulację; przygotuj co najmniej 6 pinów na jedną larwę.
- Będziesz potrzebować pęsety tępym końcem, która umożliwi chwytanie pinów podczas sekcji.
2. Disekcja larw:
- Wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium, które pełzają po ściankach fiolki i nie rozpoczęły jeszcze przepocierania.
- Umieść larwę na powierzchni do sekcji pod stereomikroskopem. Nadmiar wilgoci usuń za pomocą chusteczki Kimwipe.
- Ułóż każdą larwę tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry. Powinny być widoczne dwie tchawki – białe linie wzdłuż grzbietu larwy. Postaraj się wycentrować je w miarę możliwości, ponieważ wyznaczają one linię środkową grzbietu.
- Umieść szpilkę nr 1 tuż powyżej haczyków gębowych (Rysunek 1).
- Umieść szpilkę nr 2 w odwłoku, tuż nad przetchlinkami między tchawkami.
- Dodaj niewielką ilość PBS do larw, aby zapobiec wysychaniu kutykuli.
- Powtórz powyższe kroki dla wszystkich larw, dbając o przestrzenne oddzielenie genotypów poprzez umieszczenie szpilki pomiędzy każdym z nich.
- Wykonaj małe cięcie poprzeczne tuż nad szpilką nr 2, przecinając obie tchawki (Rysunek 1).
- Wsuń nożyczki w pierwsze cięcie i tnij wzdłuż linii środkowej grzbietu między tchawkami, aż do miejsca powyżej szpilki nr 1.
- Należy wykonać dodatkowe małe cięcia na samej górze i na samym dole każdej strony kutykuli, tak aby lewa i prawa strona mogły się rozłożyć, co pozwoli na ich przypięcie bez naciągania kutykuli.
- Umieść szpilki nr 3, 4, 5 i 6 w każdym z narożników.
- Utrwal próbkę w 4% PFA przez 20-25 minut w temperaturze pokojowej.
- Odlej PFA i wypłucz PBS 3-4 razy, odlewając płyn po każdym razie.
3. Usuwanie tkanki:
- Zacznij od usunięcia tkanek z końca tylnego, ponieważ zazwyczaj należy chronić obszar, w którym znajduje się mózg.
- Korzystając ze stereomikroskopu i utrzymując larwy w kropli PBS, najpierw chwyć koniec tylny jednej z tchawic i wyciągnij ją, co może spowodować jednoczesne usunięcie części ciała tłuszczowego. Powtórz czynność dla drugiej tchawicy.
- Chwyć część tylnego ciała tłuszczowego lub jelita i usuń je z preparatu. Po usunięciu większości tkanek tylnych skup się na usunięciu małych tkanek wokół mózgu. Jeśli interesują Cię wyłącznie mięśnie lub morfologia NMJ, możesz usunąć również mózg.
- Usunięcie mózgu pozwala na lepszą wizualizację mięśnia 31, który jest pomocniczym markerem orientacji segmentu brzusznego.
4. Immunofluorescence dla stref aktywnych:
- Do preparatów wypreparowanych w naczyniu do sekcji dodać czynnik blokujący (5% Normal Goat Serum w PBS). Inkubować w celu blokowania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jeśli chcą Państwo przygotować tylko jeden roztwór do blokowania i rozcieńczania przeciwciał, należy dodać 0,1% TritonX-100 do czynnika blokującego w celu permeabilizacji tkanki.
- Nanieść przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w odczynniku blokującym z 0,1% TritonX-100. Przeciwciało przeciwko strefie aktywnej jest dostępne w Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Należy użyć przeciwciała referencyjnego (np. koniugatu peroksydazy chrzanowej z Cy3) do znakowania błony NMJ i aksonów.
- Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4°C przez noc. Aby zapobiec odparowaniu roztworu przeciwciał z powodu niskiej wilgotności w lodówce, należy stworzyć komorę wilgotnościową, wlewając niewielką ilość wody na dno zużytego pudełka na końcówki do pipet. Przezroczystą pokrywę należy przykryć folią aluminiową, aby ograniczyć fotobleaching fluorescencji. Umieścić preparat na szkiełku w komorze wilgotnościowej, a całe pudełko włożyć do inkubatora w temperaturze 4°C na noc.
- Następnego ranka przemyć PBST (PBS z 0,2% Triton-X-100) 5-10 razy, przez 5-10 minut podczas każdego mycia.
- Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (np. Invitrogen Alexa Goat anti-Mouse-488) rozcieńczonym w odczynniku blokującym z 0,1% TritonX-100 w temperaturze pokojowej przez 2-4 godziny w przykrytej komorze wilgotnościowej. Jeśli chcą Państwo zidentyfikować położenie jądra w mięśniach lub mózgu, należy dodać barwnik jądrowy (np. DAPI) do przeciwciała drugorzędowego.
- Przemyć PBST (PBS z 0,02% Triton-X-100) 5-10 razy, przez 5-10 minut podczas każdego mycia.
5. Montowanie próbek larwalnych na szkiełkach:
- Zlej i odsącz resztki ostatniego przemycia w PBST.
- Nalej pipetą około 1 mL 80% gliceryny, aby przykryć przytwierdzone skórki larwalne.
- Usuń 5 z 6 szpilek ze wszystkich larw.
- Gdy będziesz gotowy do umieszczenia pierwszego genotypu na szkiełku, usuń ostatnią szpilkę ze wszystkich larw tego genotypu.
- Przygotuj szkiełko do „płukania”, nakładając dwie krople medium montażowego na czyste szkiełko. Ten krok jest istotny, aby usunąć z larw roztwór wodny przed montażem w celu uzyskania wyraźniejszych obrazów.
- Chwyć jedną larwę za ogon za pomocą pęsety tępej, przesuń larwę w glicerynie, a następnie wzdłuż suchych krawędzi naczynia sekcyjnego, aby usunąć większość gliceryny. Umieść larwy w pierwszej kropli medium montażowego.
- Powtórz krok 6 dla wszystkich larw tego samego genotypu.
- Gdy wszystkie larwy znajdą się w pierwszej kropli medium montażowego, chwyć pierwszą larwę za ogon i przeciągnij ją przez kroplę, a następnie wzdłuż suchych krawędzi naczynia, aby usunąć większość medium. Następnie umieść larwy w drugiej kropli medium montażowego.
- Powtórz krok 8 dla wszystkich larw tego samego genotypu.
- Przygotuj końcowe szkiełko, opisując je i nakładając na nie niewielką ilość medium montażowego w kształcie litery „T”.
- Podobnie jak w kroku 5.8, chwyć larwę za ogon; przeciągnij skórkę przez drugą kroplę medium montażowego, a następnie wzdłuż suchych boków szkiełka do „płukania”. Po usunięciu większości medium umieść skórkę larwalną w medium montażowym na końcowym szkiełku.
- Powtórz czynność dla wszystkich skórek larwalnych.
- Upewnij się, że wszystkie skórki larwalne są ułożone zgodnie z życzeniem, tak aby strona kutykuli była skierowana w dół, a odsłonięte mięśnie w górę.
- Połóż na szkiełku szkiełko nakrywkę, aby przykryć zdysekowane larwy, zaczynając od górnej krawędzi litery „T”.
- Połóż niewielki ciężarek (np. baterię 9 V) na szkiełku nakrywce, upewniając się, że medium montażowe całkowicie rozprowadziło się pod nią.
- Aby zminimalizować możliwe gaszenie fluorescencji, umieść szkiełko w szufladzie lub ciemnym miejscu, aż medium montażowe zastygnie.
- Usuń medium montażowe, które wypłynęło poza krawędzie szkiełka nakrywki. Nadmiar zaschniętego medium na szkiełku nakrywce lub szkiełku przedmiotowym usuń 70% etanolem.
- W celu stworzenia końcowej szczelności, zabezpiecz brzegi lakierem do paznokci.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przykład preparatu z wypreparowanymi i poddanymi immunobarwieniu larwami przedstawiono na rysunku 2. Przy prawidłowym przeprowadzeniu dyssekcji, barwienia i montażu preparatu, użytkownik może zidentyfikować interesujące go mięśnie larwy (rysunek 3) w segmentach A2-A6. Hoanget al. przedstawiają szczegółowy opis położenia mięśni oraz charakterystykę specyficznych butonów synaptycznych (Hoang and Chiba, 2001). Korzystając z obiektywu o dużym powiększeniu, użytkownik może skupić się na pojedynczej synapsie i wykonać obraz z serii z-stack. Przedstawiono reprezentacyjny obraz z maksymalnej projekcji fragmentu synapsy 6/7 (rysunek 4). Następnie, przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, można ilościowo ocenić strefy aktywne pod kątem cech charakterystycznych dla danego fenotypu mutanta. Przykłady cech, które mogą być zmienione w konkretnym fenotypie mutanta, obejmują całkowitą liczbę, intensywność fluorescencji oraz odstępy między strefami aktywnymi.
Potencjalne problemy:
Ocena immunofluorescencyjna larwalnego złącza nerwowo-mięśniowego jest cennym systemem, który może dostarczyć istotnych informacji na temat biologii synaptycznej, choć istnieją potencjalne pułapki mogące ograniczyć użyteczność tej metody. Przykładowo, często pożądane jest obrazowanie wzorca barwienia dla dwóch lub więcej przeciwciał pierwszorzędowych w tej samej próbce. Kluczem do sukcesu jest wybór odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych, właściwych fluoroforów oraz stosownych kontroli negatywnych.
W przypadku obrazowania dwóch antygenów w eksperymencie należy upewnić się, że przeciwciała pierwotne pochodzą z różnych gatunków, aby każde z badanych białek można było jednoznacznie zidentyfikować za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego. Zalecanym sposobem redukcji tła jest zastosowanie środka blokującego zawierającego normalne surowicę gatunku, z którego pochodzą przeciwciała wtórne (np. należy użyć normalnej surowicy koziej jako środka blokującego przy stosowaniu przeciwciał wtórnych kozich przeciw króliczym lub przeciw mysim).
Po zaplanowaniu przeciwciał pierwotnych i wtórnych, których będziesz używać w eksperymencie, należy również rozważyć uwzględnienie kontroli w zestawach do barwienia, aby upewnić się, że obserwowany sygnał fluorescencyjny jest rzeczywisty, a nie stanowi jedynie tła. Jeśli to możliwe, należy uwzględnić próbki kontrolne ujemne, które nie zawierają białka docelowego. W badaniach nad egzogenną nadekspresją transgenu można to łatwo osiągnąć, dołączając zwierzę typu dzikiego, ale w niektórych przypadkach możliwe jest wykorzystanie homozygoty mutanta białka docelowego. Inną niezbędną kontrolą ujemną, przydatną do pomiaru poziomu tła sygnału fluorescencyjnego, jest zastosowanie przeciwciała wtórnego bez dodawania przeciwciała pierwotnego. Podczas obrazowania otrzymanych preparatów ważne jest zrozumienie, że nie cały obserwowany sygnał fluorescencyjny może być rzeczywisty; może on wynikać z tła generowanego przez przeciwciała wtórne lub z endogennego tła tkankowego. Podczas analizy zmian natężenia fluorescencji może być konieczna normalizacja obrazów w celu uwzględnienia fluorescencji tła.
Wybór fluoroforu również musi być dokonany z rozwagą. Rozważenie widm wzbudzenia i emisji dla każdego fluoroforu oraz zdolność do jednoznacznego wykrywania każdego sygnału są niezbędne, aby uniknąć przenikania sygnałów między kanałami (bleed through). W przypadku jakichkolwiek wątpliwości prostym sposobem określenia zakresu przenikania sygnałów jest przeprowadzenie immunostainingu z użyciem jednego przeciwciała znakowanego pojedynczym fluoroforem na raz i sprawdzenie obrazu w każdym kanale, który będzie wykorzystywany w końcowym eksperymencie. Powinno to wykazać, czy w przypadku posiadanego zestawu filtrów mikroskopowych występuje zjawisko przenikania sygnałów.

Rysunek 1. Schemat blokowy nacinania kutykuli i rozmieszczenia szpilek 1-6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz

Rysunek 2. Umieszczenie larw na końcowym szkiełku. Należy upewnić się, że preparaty larw są ułożone stroną mięśniową do góry, a stroną kutykularną do dołu. Należy zachować odstęp co najmniej o szerokości ciała jednej larwy pomiędzy poszczególnymi próbkami.

Rysunek 3. Podczas obrazowania zlokalizuj interesujące Cię mięśnie i segmenty. Typowe złącza neuromięśniowe charakteryzują mięśnie 6/7, mięsień 13, mięsień 12 lub mięsień 4. Po przeciwnej stronie linii środkowej brzusznej znajduje się lustrzane odbicie struktury mięśniowej pokazanego hemi-segmentu. Wykorzystaj mięsień 31 jako marker do identyfikacji obrazowanego segmentu. Obrazuj te same synapsy i segmenty w pozostałych próbkach, zbierając wiele obrazów synaptycznych dla każdego genotypu, które posłużą do kwantyfikacji.

Rysunek 4. Przedstawiono reprezentatywny obraz maksymalnej projekcji fragmentu połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) unerwiającego mięsień 6/7. Barwienie NC82 (Bruchpilot) pokazano w kolorze zielonym. Presynaptyczne barwienie HRP pokazano w kolorze czerwonym. Zwrócono uwagę na punkty strefy aktywnej, które mogą zostać dodatkowo ilościowo określone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.