Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Podsumowanie

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Streszczenie

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) larw Drosophila stanowi doskonały model do badania struktury i funkcji synaptycznych. Drosophila jest znana z łatwości przeprowadzania potężnych manipulacji genetycznych, a układ nerwowy larwy okazał się szczególnie użyteczny w badaniu nie tylko prawidłowych funkcji, ale także zaburzeń towarzyszących niektórym chorobom neurologicznym (Lloyd and Taylor, 2010). Wiele kluczowych cząsteczek synaptycznych występujących u Drosophila znajduje się również u ssaków; podobnie jak większość pobudzających synaps OUN u ssaków, NMJ Drosophila jest glutaminergiczne i wykazuje zależną od aktywności przebudowę (Kohet al. , 2000). Ponadto neurony Drosophila można identyfikować indywidualnie, ponieważ ich wzorce unerwienia są stereotypowe i powtarzalne, co umożliwia badanie zidentyfikowanych zakończeń synaptycznych, takich jak te między neuronami ruchowymi a włóknami mięśni ściany ciała, które one unerwiają (Keshishian and Kim, 2004). Istnienie ewolucyjnie konserwatywnych składników synapsy wraz z łatwością manipulacji genetycznych i fizycznych sprawia, że model Drosophila jest idealny do badania mechanizmów leżących u podstaw funkcji synaptycznych (Budnik, 1996).

Strefy aktywne w zakończeniach synaptycznych są szczególnie interesujące, ponieważ to w nich dochodzi do uwalniania neuroprzekaźników. NC82 jest przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym białko Bruchpilot (Brp) u Drosophila, należące do rodziny CAST1/ERC i będące istotnym składnikiem strefy aktywnej (Waghet al. , 2006). Wykazano, że Brp bezpośrednio kształtuje strukturę T-bar strefy aktywnej i odpowiada za efektywne grupowanie kanałów Ca²⁺ pod gęstością T-bar (Fouquetet al. , 2009). Mutanty Brp charakteryzują się zmniejszoną gęstością kanałów Ca²⁺, obniżonym uwalnianiem pęcherzyków wywołanym bodźcem oraz zmienioną plastycznością krótkotrwałą (Kittelet al. , 2006). Zmiany w strefach aktywnych obserwowano w modelach chorób u Drosophila. Na przykład immunofluorescencja z użyciem przeciwciała NC82 wykazała, że gęstość stref aktywnych była zmniejszona w modelach stwardnienia zanikowego bocznego oraz zespołu Pitta-Hopkinsa (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Zatem ocena stref aktywnych lub innych białek synaptycznych w modelach chorób u larw Drosophila może dostarczyć cennych wstępnych wskazówek dotyczących występowania defektu synaptycznego.

Przygotowanie całych preparatów wypreparowanych larw Drosophila do analizy immunofluorescencyjnej połączeń neuromięśniowych (NMJ) wymaga pewnych umiejętności, lecz większość naukowców może je opanować dzięki krótkiej praktyce. Przedstawiona metoda umożliwia wypreparowanie i przeprowadzenie immunostainingu wielu larw w jednej szalce do sekcji, co ogranicza różnice środowiskowe między poszczególnymi genotypami i zapewnia wystarczającą liczbę zwierząt dla potwierdzenia powtarzalności oraz przeprowadzenia analizy statystycznej.

Protokół

1. Przygotowanie do immunofluorescencji:

1. Aby przygotować powierzchnię do sekcji, wlej elastomer silikonowy Sylgard 184 Silicone Elastomer Base do małej płytki hodowlanej. Upewnij się, że płytka nie jest wypełniona całkowicie, tak aby obszar sekcji znajdował się poniżej krawędzi.
2. Przytnij piny sekcyjne do długości około 3.5mm, aby ułatwić manipulację; przygotuj co najmniej 6 pinów na jedną larwę.
3. Będziesz potrzebować pęsety tępym końcem, która umożliwi chwytanie pinów podczas sekcji.

2. Disekcja larw:

1. Wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium, które pełzają po ściankach fiolki i nie rozpoczęły jeszcze przepocierania.
2. Umieść larwę na powierzchni do sekcji pod stereomikroskopem. Nadmiar wilgoci usuń za pomocą chusteczki Kimwipe.
3. Ułóż każdą larwę tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry. Powinny być widoczne dwie tchawki – białe linie wzdłuż grzbietu larwy. Postaraj się wycentrować je w miarę możliwości, ponieważ wyznaczają one linię środkową grzbietu.
4. Umieść szpilkę nr 1 tuż powyżej haczyków gębowych (Rysunek 1).
5. Umieść szpilkę nr 2 w odwłoku, tuż nad przetchlinkami między tchawkami.
6. Dodaj niewielką ilość PBS do larw, aby zapobiec wysychaniu kutykuli.
7. Powtórz powyższe kroki dla wszystkich larw, dbając o przestrzenne oddzielenie genotypów poprzez umieszczenie szpilki pomiędzy każdym z nich.
8. Wykonaj małe cięcie poprzeczne tuż nad szpilką nr 2, przecinając obie tchawki (Rysunek 1).
9. Wsuń nożyczki w pierwsze cięcie i tnij wzdłuż linii środkowej grzbietu między tchawkami, aż do miejsca powyżej szpilki nr 1.
10. Należy wykonać dodatkowe małe cięcia na samej górze i na samym dole każdej strony kutykuli, tak aby lewa i prawa strona mogły się rozłożyć, co pozwoli na ich przypięcie bez naciągania kutykuli.
11. Umieść szpilki nr 3, 4, 5 i 6 w każdym z narożników.
12. Utrwal próbkę w 4% PFA przez 20-25 minut w temperaturze pokojowej.
13. Odlej PFA i wypłucz PBS 3-4 razy, odlewając płyn po każdym razie.

3. Usuwanie tkanki:

1. Zacznij od usunięcia tkanek z końca tylnego, ponieważ zazwyczaj należy chronić obszar, w którym znajduje się mózg.
2. Korzystając ze stereomikroskopu i utrzymując larwy w kropli PBS, najpierw chwyć koniec tylny jednej z tchawic i wyciągnij ją, co może spowodować jednoczesne usunięcie części ciała tłuszczowego. Powtórz czynność dla drugiej tchawicy.
3. Chwyć część tylnego ciała tłuszczowego lub jelita i usuń je z preparatu. Po usunięciu większości tkanek tylnych skup się na usunięciu małych tkanek wokół mózgu. Jeśli interesują Cię wyłącznie mięśnie lub morfologia NMJ, możesz usunąć również mózg.
4. Usunięcie mózgu pozwala na lepszą wizualizację mięśnia 31, który jest pomocniczym markerem orientacji segmentu brzusznego.

4. Immunofluorescence dla stref aktywnych:

1. Do preparatów wypreparowanych w naczyniu do sekcji dodać czynnik blokujący (5% Normal Goat Serum w PBS). Inkubować w celu blokowania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jeśli chcą Państwo przygotować tylko jeden roztwór do blokowania i rozcieńczania przeciwciał, należy dodać 0,1% TritonX-100 do czynnika blokującego w celu permeabilizacji tkanki.
2. Nanieść przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w odczynniku blokującym z 0,1% TritonX-100. Przeciwciało przeciwko strefie aktywnej jest dostępne w Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Należy użyć przeciwciała referencyjnego (np. koniugatu peroksydazy chrzanowej z Cy3) do znakowania błony NMJ i aksonów.
3. Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w temperaturze 4°C przez noc. Aby zapobiec odparowaniu roztworu przeciwciał z powodu niskiej wilgotności w lodówce, należy stworzyć komorę wilgotnościową, wlewając niewielką ilość wody na dno zużytego pudełka na końcówki do pipet. Przezroczystą pokrywę należy przykryć folią aluminiową, aby ograniczyć fotobleaching fluorescencji. Umieścić preparat na szkiełku w komorze wilgotnościowej, a całe pudełko włożyć do inkubatora w temperaturze 4°C na noc.
4. Następnego ranka przemyć PBST (PBS z 0,2% Triton-X-100) 5-10 razy, przez 5-10 minut podczas każdego mycia.
5. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (np. Invitrogen Alexa Goat anti-Mouse-488) rozcieńczonym w odczynniku blokującym z 0,1% TritonX-100 w temperaturze pokojowej przez 2-4 godziny w przykrytej komorze wilgotnościowej. Jeśli chcą Państwo zidentyfikować położenie jądra w mięśniach lub mózgu, należy dodać barwnik jądrowy (np. DAPI) do przeciwciała drugorzędowego.
6. Przemyć PBST (PBS z 0,02% Triton-X-100) 5-10 razy, przez 5-10 minut podczas każdego mycia.

5. Montowanie próbek larwalnych na szkiełkach:

1. Zlej i odsącz resztki ostatniego przemycia w PBST.
2. Nalej pipetą około 1 mL 80% gliceryny, aby przykryć przytwierdzone skórki larwalne.
3. Usuń 5 z 6 szpilek ze wszystkich larw.
4. Gdy będziesz gotowy do umieszczenia pierwszego genotypu na szkiełku, usuń ostatnią szpilkę ze wszystkich larw tego genotypu.
5. Przygotuj szkiełko do „płukania”, nakładając dwie krople medium montażowego na czyste szkiełko. Ten krok jest istotny, aby usunąć z larw roztwór wodny przed montażem w celu uzyskania wyraźniejszych obrazów.
6. Chwyć jedną larwę za ogon za pomocą pęsety tępej, przesuń larwę w glicerynie, a następnie wzdłuż suchych krawędzi naczynia sekcyjnego, aby usunąć większość gliceryny. Umieść larwy w pierwszej kropli medium montażowego.
7. Powtórz krok 6 dla wszystkich larw tego samego genotypu.
8. Gdy wszystkie larwy znajdą się w pierwszej kropli medium montażowego, chwyć pierwszą larwę za ogon i przeciągnij ją przez kroplę, a następnie wzdłuż suchych krawędzi naczynia, aby usunąć większość medium. Następnie umieść larwy w drugiej kropli medium montażowego.
9. Powtórz krok 8 dla wszystkich larw tego samego genotypu.
10. Przygotuj końcowe szkiełko, opisując je i nakładając na nie niewielką ilość medium montażowego w kształcie litery „T”.
11. Podobnie jak w kroku 5.8, chwyć larwę za ogon; przeciągnij skórkę przez drugą kroplę medium montażowego, a następnie wzdłuż suchych boków szkiełka do „płukania”. Po usunięciu większości medium umieść skórkę larwalną w medium montażowym na końcowym szkiełku.
12. Powtórz czynność dla wszystkich skórek larwalnych.
13. Upewnij się, że wszystkie skórki larwalne są ułożone zgodnie z życzeniem, tak aby strona kutykuli była skierowana w dół, a odsłonięte mięśnie w górę.
14. Połóż na szkiełku szkiełko nakrywkę, aby przykryć zdysekowane larwy, zaczynając od górnej krawędzi litery „T”.
15. Połóż niewielki ciężarek (np. baterię 9 V) na szkiełku nakrywce, upewniając się, że medium montażowe całkowicie rozprowadziło się pod nią.
16. Aby zminimalizować możliwe gaszenie fluorescencji, umieść szkiełko w szufladzie lub ciemnym miejscu, aż medium montażowe zastygnie.
17. Usuń medium montażowe, które wypłynęło poza krawędzie szkiełka nakrywki. Nadmiar zaschniętego medium na szkiełku nakrywce lub szkiełku przedmiotowym usuń 70% etanolem.
18. W celu stworzenia końcowej szczelności, zabezpiecz brzegi lakierem do paznokci.

6. Reprezentatywne wyniki:

Przykład preparatu z wypreparowanymi i poddanymi immunobarwieniu larwami przedstawiono na rysunku 2. Przy prawidłowym przeprowadzeniu dyssekcji, barwienia i montażu preparatu, użytkownik może zidentyfikować interesujące go mięśnie larwy (rysunek 3) w segmentach A2-A6. Hoanget al. przedstawiają szczegółowy opis położenia mięśni oraz charakterystykę specyficznych butonów synaptycznych (Hoang and Chiba, 2001). Korzystając z obiektywu o dużym powiększeniu, użytkownik może skupić się na pojedynczej synapsie i wykonać obraz z serii z-stack. Przedstawiono reprezentacyjny obraz z maksymalnej projekcji fragmentu synapsy 6/7 (rysunek 4). Następnie, przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, można ilościowo ocenić strefy aktywne pod kątem cech charakterystycznych dla danego fenotypu mutanta. Przykłady cech, które mogą być zmienione w konkretnym fenotypie mutanta, obejmują całkowitą liczbę, intensywność fluorescencji oraz odstępy między strefami aktywnymi.

Potencjalne problemy:

Ocena immunofluorescencyjna larwalnego złącza nerwowo-mięśniowego jest cennym systemem, który może dostarczyć istotnych informacji na temat biologii synaptycznej, choć istnieją potencjalne pułapki mogące ograniczyć użyteczność tej metody. Przykładowo, często pożądane jest obrazowanie wzorca barwienia dla dwóch lub więcej przeciwciał pierwszorzędowych w tej samej próbce. Kluczem do sukcesu jest wybór odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych, właściwych fluoroforów oraz stosownych kontroli negatywnych.

W przypadku obrazowania dwóch antygenów w eksperymencie należy upewnić się, że przeciwciała pierwotne pochodzą z różnych gatunków, aby każde z badanych białek można było jednoznacznie zidentyfikować za pomocą znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała wtórnego. Zalecanym sposobem redukcji tła jest zastosowanie środka blokującego zawierającego normalne surowicę gatunku, z którego pochodzą przeciwciała wtórne (np. należy użyć normalnej surowicy koziej jako środka blokującego przy stosowaniu przeciwciał wtórnych kozich przeciw króliczym lub przeciw mysim).

Po zaplanowaniu przeciwciał pierwotnych i wtórnych, których będziesz używać w eksperymencie, należy również rozważyć uwzględnienie kontroli w zestawach do barwienia, aby upewnić się, że obserwowany sygnał fluorescencyjny jest rzeczywisty, a nie stanowi jedynie tła. Jeśli to możliwe, należy uwzględnić próbki kontrolne ujemne, które nie zawierają białka docelowego. W badaniach nad egzogenną nadekspresją transgenu można to łatwo osiągnąć, dołączając zwierzę typu dzikiego, ale w niektórych przypadkach możliwe jest wykorzystanie homozygoty mutanta białka docelowego. Inną niezbędną kontrolą ujemną, przydatną do pomiaru poziomu tła sygnału fluorescencyjnego, jest zastosowanie przeciwciała wtórnego bez dodawania przeciwciała pierwotnego. Podczas obrazowania otrzymanych preparatów ważne jest zrozumienie, że nie cały obserwowany sygnał fluorescencyjny może być rzeczywisty; może on wynikać z tła generowanego przez przeciwciała wtórne lub z endogennego tła tkankowego. Podczas analizy zmian natężenia fluorescencji może być konieczna normalizacja obrazów w celu uwzględnienia fluorescencji tła.

Wybór fluoroforu również musi być dokonany z rozwagą. Rozważenie widm wzbudzenia i emisji dla każdego fluoroforu oraz zdolność do jednoznacznego wykrywania każdego sygnału są niezbędne, aby uniknąć przenikania sygnałów między kanałami (bleed through). W przypadku jakichkolwiek wątpliwości prostym sposobem określenia zakresu przenikania sygnałów jest przeprowadzenie immunostainingu z użyciem jednego przeciwciała znakowanego pojedynczym fluoroforem na raz i sprawdzenie obrazu w każdym kanale, który będzie wykorzystywany w końcowym eksperymencie. Powinno to wykazać, czy w przypadku posiadanego zestawu filtrów mikroskopowych występuje zjawisko przenikania sygnałów.

Rysunek 1. Schemat blokowy nacinania kutykuli i rozmieszczenia szpilek 1-6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz

Rysunek 2. Umieszczenie larw na końcowym szkiełku. Należy upewnić się, że preparaty larw są ułożone stroną mięśniową do góry, a stroną kutykularną do dołu. Należy zachować odstęp co najmniej o szerokości ciała jednej larwy pomiędzy poszczególnymi próbkami.

Rysunek 3. Podczas obrazowania zlokalizuj interesujące Cię mięśnie i segmenty. Typowe złącza neuromięśniowe charakteryzują mięśnie 6/7, mięsień 13, mięsień 12 lub mięsień 4. Po przeciwnej stronie linii środkowej brzusznej znajduje się lustrzane odbicie struktury mięśniowej pokazanego hemi-segmentu. Wykorzystaj mięsień 31 jako marker do identyfikacji obrazowanego segmentu. Obrazuj te same synapsy i segmenty w pozostałych próbkach, zbierając wiele obrazów synaptycznych dla każdego genotypu, które posłużą do kwantyfikacji.

Rysunek 4. Przedstawiono reprezentatywny obraz maksymalnej projekcji fragmentu połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) unerwiającego mięsień 6/7. Barwienie NC82 (Bruchpilot) pokazano w kolorze zielonym. Presynaptyczne barwienie HRP pokazano w kolorze czerwonym. Zwrócono uwagę na punkty strefy aktywnej, które mogą zostać dodatkowo ilościowo określone za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Dyskusja

W przypadku neuronów obszar zakończeń synaptycznych ma krytyczne znaczenie i stanowi pomost dla prawidłowej komunikacji między komórkami postsynaptycznymi a presynaptycznymi. Skutecznym sposobem badania stanu zdrowia neuronów w modelach chorób jest analiza białek zakończeń synaptycznych za pomocą immunofluorescencji. Przedstawiona tutaj metoda immunofluorescencji umożliwia badaczowi jednoczesne badanie wielu larw, ograniczając jednocześnie różnice środowiskowe między grupami. Układ nerwowy larw Drosophila w trze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning	68037-59-2	Po wymieszaniu pozwolić pęcherzykom powoli wypłynąć na powierzchnię, umieszczając próbkę na wolno obracającym się rotatorze lub pozostawiając na 30 minut lub dłużej.
Stalowe piny Minutien	Fine Science Tools	26002-10	Przyciąć do długości ok. 3-4mm zwykłymi nożyczkami
Kleszczyki do laminektomii (tępe – używane do chwytania pinów)	Fine Science Tools	11223-20	Stosować jako tępe kleszczyki do chwytania pinów
Kleszczyki do sekcji	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine nożyczki Vannasa, długość 8cm	World Precision Instruments, Inc.	501778
Przeciwciało mysie anty-Brp	DSHB	NC82	Stosować w rozcieńczeniu 1:50
Cy3 Affinipure przeciwciało kozie anty-peroksydaza chrzanowa	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Stosować w rozcieńczeniu 1:200
Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG	Invitrogen	A11001	Stosować w rozcieńczeniu ok. 1:200