Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Podsumowanie

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Streszczenie

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) larw Drosophila stanowi doskonały model do badania struktury i funkcji synaptycznych. Drosophila jest znana z łatwości przeprowadzania potężnych manipulacji genetycznych, a układ nerwowy larwy okazał się szczególnie użyteczny w badaniu nie tylko prawidłowych funkcji, ale także zaburzeń towarzyszących niektórym chorobom neurologicznym (Lloyd and Taylor, 2010). Wiele kluczowych cząsteczek synaptycznych występujących u Drosophila znajduje się również u ssaków; podobnie jak większość pobudzających synaps OUN u ssaków, NMJ Drosophila jest glutaminergiczne i wykazuje zależną od aktywności przebudowę (Kohet al. , 2000). Ponadto neurony Drosophila można identyfikować indywidualnie, ponieważ ich wzorce unerwienia są stereotypowe i powtarzalne, co umożliwia badanie zidentyfikowanych zakończeń synaptycznych, takich jak te między neuronami ruchowymi a włóknami mięśni ściany ciała, które one unerwiają (Keshishian and Kim, 2004). Istnienie ewolucyjnie konserwatywnych składników synapsy wraz z łatwością manipulacji genetycznych i fizycznych sprawia, że model Drosophila jest idealny do badania mechanizmów leżących u podstaw funkcji synaptycznych (Budnik, 1996).

Strefy aktywne w zakończeniach synaptycznych są szczególnie interesujące, ponieważ to w nich dochodzi do uwalniania neuroprzekaźników. NC82 jest przeciwciałem monoklonalnym rozpoznającym białko Bruchpilot (Brp) u Drosophila, należące do rodziny CAST1/ERC i będące istotnym składnikiem strefy aktywnej (Waghet al. , 2006). Wykazano, że Brp bezpośrednio kształtuje strukturę T-bar strefy aktywnej i odpowiada za efektywne grupowanie kanałów Ca²⁺ pod gęstością T-bar (Fouquetet al. , 2009). Mutanty Brp charakteryzują się zmniejszoną gęstością kanałów Ca²⁺, obniżonym uwalnianiem pęcherzyków wywołanym bodźcem oraz zmienioną plastycznością krótkotrwałą (Kittelet al. , 2006). Zmiany w strefach aktywnych obserwowano w modelach chorób u Drosophila. Na przykład immunofluorescencja z użyciem przeciwciała NC82 wykazała, że gęstość stref aktywnych była zmniejszona w modelach stwardnienia zanikowego bocznego oraz zespołu Pitta-Hopkinsa (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Zatem ocena stref aktywnych lub innych białek synaptycznych w modelach chorób u larw Drosophila może dostarczyć cennych wstępnych wskazówek dotyczących występowania defektu synaptycznego.

Przygotowanie całych preparatów wypreparowanych larw Drosophila do analizy immunofluorescencyjnej połączeń neuromięśniowych (NMJ) wymaga pewnych umiejętności, lecz większość naukowców może je opanować dzięki krótkiej praktyce. Przedstawiona metoda umożliwia wypreparowanie i przeprowadzenie immunostainingu wielu larw w jednej szalce do sekcji, co ogranicza różnice środowiskowe między poszczególnymi genotypami i zapewnia wystarczającą liczbę zwierząt dla potwierdzenia powtarzalności oraz przeprowadzenia analizy statystycznej.

Protokół

1. Przygotowanie do immunofluorescencji:

1. Aby przygotować powierzchnię do sekcji, wlej elastomer silikonowy Sylgard 184 Silicone Elastomer Base do małej płytki hodowlanej. Upewnij się, że płytka nie jest wypełniona całkowicie, tak aby obszar sekcji znajdował się poniżej krawędzi.
2. Przytnij piny sekcyjne do długości około 3.5mm, aby ułatwić manipulację; przygotuj co najmniej 6 pinów na jedną larwę.
3. Będziesz potrzebować pęsety tępym końcem, która umożliwi chwytanie pinów podczas sekcji.

2. Disekcja larw:

1. Wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium, które pełzają po ściankach fiolki i nie rozpoczę....

Dyskusja

W przypadku neuronów obszar zakończeń synaptycznych ma krytyczne znaczenie i stanowi pomost dla prawidłowej komunikacji między komórkami postsynaptycznymi a presynaptycznymi. Skutecznym sposobem badania stanu zdrowia neuronów w modelach chorób jest analiza białek zakończeń synaptycznych za pomocą immunofluorescencji. Przedstawiona tutaj metoda immunofluorescencji umożliwia badaczowi jednoczesne badanie wielu larw, ograniczając jednocześnie różnice środowiskowe między grupami. Układ nerwowy larw Drosophila w trze.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Baza elastomeru silikonowego Sylgard 184	Dow Corning	68037-59-2	Po wymieszaniu pozwolić pęcherzykom powoli wypłynąć na powierzchnię, umieszczając próbkę na wolno obracającym się rotatorze lub pozostawiając na 30 minut lub dłużej.
Stalowe piny Minutien	Fine Science Tools	26002-10	Przyciąć do długości ok. 3-4mm zwykłymi nożyczkami
Kleszczyki do laminektomii (tępe – używane do chwytania pinów)	Fine Science Tools	11223-20	Stosować jako tępe kleszczyki do chwytania pinów
Kleszczyki do sekcji	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine nożyczki Vannasa, długość 8cm	World Precision Instruments, Inc.	501778
Przeciwciało mysie anty-Brp	DSHB	NC82	Stosować w rozcieńczeniu 1:50
Cy3 Affinipure przeciwciało kozie anty-peroksydaza chrzanowa	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Stosować w rozcieńczeniu 1:200
Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG	Invitrogen	A11001	Stosować w rozcieńczeniu ok. 1:200