Artykuł metodologiczny

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

DOI:

10.3791/2677

⸱

29 kwietnia 2011

 ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Massachusetts Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem służącym do identyfikacji oddziaływań białko:chromatyna zachodzących w kontekście żywych komórek 1-3. Technika ta była szeroko wykorzystywana w komórkach hodowli tkankowych, a w mniejszym stopniu w tkankach pierwotnych. Zastosowanie metody ChIP do embrionalnych tkanek gryzoni, zwłaszcza we wczesnych etapach rozwoju, jest utrudnione ze względu na ograniczoną ilość tkanki oraz heterogeniczność typów komórek i tkanek w embrionie. Przedstawiamy tutaj metodę przeprowadzania ChIP z wykorzystaniem zdysocjowanego embrionu z 8,5 doby embrionalnej (E8.5). Ścięta chromatyna z pojedynczego embrionu E8.5 może zostać podzielona na maksymalnie pięć alikwotów, co zapewnia badaczowi wystarczającą ilość materiału do kontroli oraz do badania specyficznych oddziaływań białko:chromatyna.

Wykorzystaliśmy tę technikę, aby rozpocząć dokumentowanie oddziaływań białko:chromatyna podczas specyfikacji programów ekspresji genów specyficznych dla tkanek. Heterogeniczność typów komórek w embrionie nieuchronnie ogranicza zastosowanie tej techniki, ponieważ wynikiem jest wykrycie oddziaływań białko:chromatyna bez rozróżnienia, czy oddziaływania te zachodzą we wszystkich, w podgrupie, czy w pojedynczym typie komórek. Jednakże badanie genów specyficznych dla tkanek podczas lub po rozpoczęciu specyficznej dla tkanek ekspresji genów jest możliwe z dwóch powodów. Po pierwsze, immunoprecypitacja czynników specyficznych dla tkanek nieuchronnie izoluje chromatynę z typu komórek, w których dany czynnik jest ekspresowany. Po drugie, immunoprecypitacja koaktywatorów i histonów zawierających modyfikacje potranslacyjne związane z aktywacją genów powinna prowadzić do wykrycia tych elementów wyłącznie przy genach i sekwencjach regulacyjnych genów w typie komórek, w których gen jest lub był aktywowany. Technika ta powinna być możliwa do zastosowania w badaniu większości zdarzeń aktywacji genów specyficznych dla tkanek.

W poniższym przykładzie wykorzystano embriony myszy w stadiach E8.5 i E9.5, aby zbadać wiązanie czynnika w obrębie promotora genu specyficznego dla mięśni szkieletowych. Somity, będące tkankami prekursorowymi, z których powstaną mięśnie szkieletowe tułowia i kończyn, występują w stadiach E8.5-9.54,5. Miogenina jest czynnikiem regulacyjnym niezbędnym do różnicowania mięśni szkieletowych 6-9. Dane wykazują, że miogenina wiąże się z własnym promotorem w embrionach E8.5 i E9.5. Ponieważ miogenina jest ekspresjonowana w somitach jedynie na tym etapie rozwoju 6,10, dane wskazują, że oddziaływania miogeniny z jej własnym promotorem zachodzą już w komórkach prekursorowych mięśni szkieletowych w embrionach E8.5.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja embrionów

Uwaga: Wszystkie operacje z udziałem myszy powinny być przeprowadzane zgodnie z odpowiednimi zasadami i protokołami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania

  1. Rankiem po kopulacji należy sprawdzić obecność czopa kopulacyjnego u samicy myszy i oddzielić samice po kopulacji od samców poprzez umieszczenie ich w innej klatce. Południe dnia, w którym zaobserwowano czop kopulacyjny, uznaje się za dzień embrionalny 0,5 (E0.5) rozwoju.
  2. W dniu E8.5 (lub w innym pożądanym stadium) należy uśmiercić mysz zgodnie z zatwierdzonym protokołem.
  3. Brzuch uśpionego zwierzęcia należy zwilżyć 70% etanolem i otworzyć jamę brzuszną. Miejsca implantacji wskazujące na obecność rozwijających się zarodków widoczne są jako układ przypominający „koraliki na sznurku” wzdłuż każdego rogu macicy (Rycina 1A). Za pomocą nożyczek należy usunąć oba rogi macicy, przeciąć pojedynczo każde miejsce implantacji w celu oddzielenia (Rycina 1B) i umieścić je w 100 mm szalce Petri zawierającej w temperaturze pokojowej (RT) medium do sekcji (DMEM, 10% płodowa surowica bydlęca, 20 mM HEPES pH 7.4, 60 μg/ml penicyliny, 2 mM streptomycyny).
  4. Za pomocą pęsety należy usunąć każdy zarodek wraz z otaczającymi go błonami z tkanki macicy (Rycina 1C) i umieścić je w świeżym medium do sekcji.
  5. Przy użyciu pęsety i mikroskopu sekcyjnego należy wyizolować poszczególne zarodki. Na tym etapie rozwoju zarodki są otoczone przez kątrelkowy worek żółtkowy, który styka się z tkanką decyduą, trzewny worek żółtkowy oraz błoną amniontyczną. Błona amniontyczna jest przezroczystą błoną w bezpośrednim kontakcie z zarodkiem. Trzewny worek żółtkowy znajduje się pomiędzy błoną amniontyczną a kątrelkowym workiem żółtkowym i jest łatwo rozpoznawalny w zarodkach E8.5-E9.5 dzięki obecności wyraźnych naczyń krwionośnych odżywiających zarodek. Należy oddzielić każdy zarodek od otaczających go błon i przenieść go pojedynczo do nowej płytki zawierającej medium do sekcji, aby usunąć nadmiar krwi. Stadium rozwoju może się różnić między zarodkami oraz między miotami; reprezentatywne zarodki E8.5 oraz reprezentatywny zarodek E9.5 przedstawiono na Rycynie 1D.
  6. Każdy zarodek należy przenieść do probówki eppendorf 1,5 ml zawierającej 200 μl medium do sekcji (opisanego w kroku 4 powyżej).

2. Homogenizacja wyizolowanego embrionu

  1. Do każdej probówki typu Eppendorf dodać 20 jednostek kolagenazy typu II w objętości 200 ul (rozcieńczonej w 1X buforze fosforanowym Dulbecco; DPBS).
  2. Próbki delikatnie potrząsać w wytrząsarce w temperaturze 37°C przy 100 rpm przez 20 min.
  3. Dokładnie resuspender za pomocą pipety, aby rozbić skupiska komórek.
  4. Nanieść zawiesinę komórkową na sterylne sito komórkowe (rozmiar oczek 40 μm) umieszczone nad probówką typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
  5. Natychmiast nanieść 600 μl 1X DPBS w temperaturze pokojowej na sito komórkowe, aby dokończyć proces separacji. Sito usunąć.
  6. Próbki wirować w temperaturze 4°C przy 4000 x g przez 5 min.
  7. Usunąć nadosad.
  8. Osad resuspender w 1 ml 1X DPBS w temperaturze pokojowej.
  9. Próbki wirować przy 4000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
  10. Usunąć nadosad.
  11. Osad resuspender w 200 μl pożywki do sekcji w temperaturze pokojowej.
  12. Policzyć komórki embrionalne. Średnia liczba wynosi 3-5 x 106 komórek/embrion E8.5.

3. Sieciowanie chromatyny

  1. Do próbek o objętości 200 μl dodać 5,6 μl 37% formaldehydu, aby uzyskać stężenie końcowe 1% formaldehydu.
  2. Inkubować próbki przez 10 min w RT.
  3. Wirować próbki w temperaturze 4°C przy 4000 x g przez 3 min.
  4. Odpiąć i usunąć nadsącz.
  5. Resuspendować komórki w zimnym 1X DPBS zawierającym 80 μl/ml koktajlu inhibitorów proteaz (PIC).
  6. Wirować próbki w temperaturze 4°C przy 4000 x g przez 3 min.
  7. Odpiąć i usunąć nadsącz. Na tym etapie próbki można zamrozić w temperaturze -80°C. Zamrożone próbki poddane sieciowaniu są stabilne przez kilka miesięcy.

4. Sonikacja

  1. Resuspender osad komórkowy w 100 μl buforu lizującego RT SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA i 1% SDS ze świeżo dodanym PIC w proporcji 1 μl PIC/800 μl całkowitej objętości). W przypadku trudności z resuspensją dodać kolejne 100 ul buforu lizującego RT SDS, aby ułatwić proces. Wymieszać dokładnie poprzez pipetowanie i odwracanie probówki.
  2. Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 min.
  3. Poddać zlizowane komórki sonikacji w celu fragmentacji DNA do wielkości od 200 do 500 par zasad, używając urządzenia Diagenode Bioruptor™ UCD200 (5 min x 8 razy: ustawienie amplitudy 30 s włączone/30 s wyłączone przy wysokiej mocy (320 watów)). Próbki powinny być otoczone mieszaniną lodu z wodą. Nie dopuszczać do ogrzania próbek powyżej 4°C ani do ich zamrożenia. Dostępnych jest wiele rodzajów sonikatorów. Warunki sonikacji należy zoptymalizować dla każdego urządzenia tak, aby uzyskać fragmentację sieciowanego DNA do długości około 500 bp.
  4. Odwiruią próbki po sonikacji w temperaturze 4°C przy 14000 x g przez 10 min.
  5. Przenieść nadsącz do nowej probówki Eppendorf uprzednio schłodzonej na lodzie.
  6. Podzielić sonikowaną próbkę na maksymalnie 5 aliquotów. Empirycznie ustalono, że jeden embrion E8.5 można podzielić na 5 aliquotów. Mniejsze lub większe wielkości próbek można skalować odpowiednio. Na tym etapie próbkę można przechowywać w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia.
  7. Zarezerwować jeden aliquot jako kontrolę wejściową (input) i przechowywać w temperaturze -20°C do kroku 6, w którym nastąpi odwrócenie sieciowania. Pozostałe aliquoty rozcieńczyć 10-krotnie w buforze do rozcieńczania ChIP (16.7 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1.2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 167 mM NaCl i 0.01% SDS) zawierającym świeżo dodany PIC w proporcji 1 μl/800 μl buforu.

5. Oczyszczanie wstępne i immunoprecypitacja

  1. Przeprowadź wstępne oczyszczanie rozcieńczonego supernatantu, dodając 75 μl 50% zawiesiny agarozy z DNA z plemników łososia oraz białkiem A lub G, i inkubuj w 4°C przez 1 hr przy ciągłym obracaniu. Wybór kulek z białkiem A lub białkiem G powinien zależeć od przeciwciała stosowanego w badaniu ChIP. Na przykład kulki z białkiem A są zalecane dla przeciwciał króliczych, natomiast kulki z białkiem G dla przeciwciał kozich lub przeciwciał IgG1 mysich. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w zaleceniach producenta kulek.
  2. Wiruj w 4°C przy 2500 x g przez 1 min.
  3. Przenieś supernatant do nowej, schłodzonej probówki typu eppendorf.
  4. Do wstępnie oczyszczonej porcji dodaj przeciwciało (4 μg/sample) i inkubuj przez noc w 4°C przy ciągłym obracaniu.

6. Płukanie kompleksu chromatyna-białko-kuleczki

  1. Do każdej probówki dodaj 60 μl zawiesiny DNA z plemni łososia/agarozy z Proteiną A lub G i inkubuj w temperaturze 4°C przy rotacji przez 1 hr. Użyj tego samego rodzaju kulek, który został zastosowany do wstępnego oczyszczania w kroku 3 powyżej.
  2. Wirowaj w temperaturze 4°C przy 1000 x g przez 1 min.
  3. Ostrożnie usuń i odrzuć naddestylat. Kompleks DNA-białko-kulki przechowuj na lodzie.
  4. Resuspenduj i przemyj osad zgodnie z poniższymi instrukcjami, używając buforów do przemywania 1, 2, 3 i 4. Bufory do przemywania 1-3 powinny być schłodzone do 4°C, a przemycia tymi buforami należy przeprowadzać w temperaturze 4°C. Bufor do przemywania 4 powinien być w temperaturze pokojowej, a przemycia tym buforem należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Każde przemycie trwa 5 minut przy rotacji w odpowiedniej temperaturze. Po każdym przemyciu wirowaj w temperaturze 4°C (lub w temperaturze pokojowej w przypadku buforu do przemywania 4) przy 1000 x g przez 1 min, a następnie ostrożnie odessaj lub usuń naddestylat.

Bufor 1:Bufor płuczący o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
150 mM NaCl i 0,1% SDS), 1 ml x 2 płukania.
Bufor 2:Bufor płuczący o wysokiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl (pH 8.1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100,
500 mM NaCl i 0,1% SDS), 1 ml x 2 płukania.
Bufor 3:Bufor płuczący z LiCl (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630,
0,25 M LiCl i 1% kwasu deoksycholowego (sól sodowa)), 1 ml x 1 płukanie.
Bufor 4:Bufor TE (10 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 płukania.

7. Elucja kompleksu chromatyny i przeciwciał

  1. Resuspenduj przemyty kompleks chromatyna-białko-kuleczki w 250 μl świeżo przygotowanego buforu elucyjnego (1% SDS, 0,1 M NaHCO3). Intensywnie wymieszaj próbkę na wortexie przez 5 s, a następnie inkubuj w RT przez 15 min przy stałym obracaniu.
  2. Wiruj przy 2500 x g przez 1 min w RT i przenieś eluat do nowej probówki typu eppendorf.
  3. Powtórz kroki 1 i 2, łącząc eluaty w tej samej probówce typu eppendorf. Eluaty powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu tego etapu eluaty można przechowywać w -20°C do czasu dalszego użycia.

8. Odwrócenie sieciowania i odzysk DNA

  1. Dodaj 20 μl 5 M NaCl na 500 μl eluatu (40 μl/ml dla kontroli wejściowej).
  2. Ogrzewaj eluaty w temperaturze 65°C w kąpieli wodnej przez 4 h lub przez noc.
  3. W celu sprawdzenia wielkości fragmentów DNA, 10 μl każdej próbki (w tym kontroli wejściowej) można nałożyć na 2% żel agarozowy obok markerów wielkości w zakresie od 0,1 do 1 kbp. DNA pojawi się jako rozmycie (smear), a nie jako wyraźny prążek. Pozostałe próbki mogą pozostać w temperaturze 65°C podczas elektroforezy.
  4. Odzyskaj DNA z każdej próbki, używając zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Aby zoptymalizować adsorpcję DNA na membranie krzemionkowej w kolumnie wirówkowej QIAquick, dodaj 600 μl buforu QG (dołączonego do zestawu) oraz 200 μl izopropanolu do 500 μl próbki. Należy pamiętać, że bufor QG zawiera wskaźnik pH, który umożliwia łatwe określenie pH próbki. Jeśli po wymieszaniu kolor próbki zmieni się z żółtego na fioletowy (pH > 7,5), dodaj do próbki 10 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2) i wymieszaj. Obniża to pH mieszaniny, aby zmaksymalizować wiązanie DNA z ziarnami w kolumnie.
  5. Przed nałożeniem mieszaniny na kolumnę sprawdź, czy nie wystąpił osad SDS. Jeśli doszło do wytrącenia SDS, próbkę należy ogrzewać w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C aż do momentu zniknięcia osadu.
  6. Nałóż 700 μl mieszaniny do kolumny wirówkowej QIAquick (fioletowa kolumna w zestawie) i wiruj w temperaturze pokojowej przy 14000 x g przez 1 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odlej filtrat z kolumny i powtórz ten krok z pozostałą częścią próbki.
  7. Dodaj 500 μl buforu QG, aby wypłukać kolumnę. Wiruj w temperaturze pokojowej przy 14000 x g przez 2 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odlej filtrat z kolumny.
  8. Przepłucz kolumnę 700 μl buforu do płukania PE (dołączonego do zestawu), do którego dodano etanol zgodnie z instrukcją producenta. Wiruj w temperaturze pokojowej przy 14000 x g przez 1 min. Przed przejściem do kolejnego etapu odlej filtrat z kolumny.
  9. Powtórz etap wirowania, aby całkowicie usunąć resztki buforu PE z kolumny. Wyrzuć filtrat oraz probówkę zbiorczą.
  10. Eluuj DNA z kolumny do nowej probówki Eppendorf, dodając 60 μl buforu EB (bufor do elucji dołączony do zestawu).
  11. Wiruj w temperaturze pokojowej przy 14000 x g przez 1 min. Eluowane DNA można przechowywać w temperaturze -20°C do czasu detekcji. Pomiary A260 odzyskanego materiału zazwyczaj wskazują stężenia 90-120 ng/ul, co daje całkowity odzysk ok. 6-7 ug na alikwot. Jednak stosunek A260/280 tych próbek wynosi zazwyczaj >1,8, co sugeruje obecność RNA w próbce. Zatem dokładna ilość odzyskanego DNA może być niższa.

9. Analiza odzyskanego DNA

  1. SDS może zakłócać aktywność polimerazy Taq w reakcji PCR. Przed przeprowadzeniem PCR należy całkowicie usunąć SDS. Inkubować DNA na lodzie, aby wytrącić pozostałości SDS, a następnie wirować w temperaturze 4°C przy 14000 x g przez 1 min. Przenieść nadsącz do nowej probówki typu Eppendorf. Krok ten jest zdecydowanie zalecany.
  2. Eluaty DNA można wykryć za pomocą konwencjonalnej reakcji PCR lub ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (Q-PCR) z użyciem starterów specyficznych dla każdej analizowanej sekwencji. Do jednej reakcji PCR lub Q-PCR można wykorzystać 5-10 μl całkowitego eluatu DNA. PCR z kontrolą wejściową można przeprowadzić przy 5-10 krotym rozcieńczeniu DNA w porównaniu z ilością w pozostałych próbkach. Warunki PCR i Q-PCR będą się różnić, jednak ograniczona ilość materiału wyjściowego wymaga dodatkowych cykli PCR. W przypadku wykrywania metodą konwencjonalnego PCR zalecamy rozpoczęcie od 40 cykli i dostosowanie ich w razie potrzeby.

10. Reprezentatywne wyniki

Niniejszy protokół został wykorzystany do przeprowadzenia analizy ChIP z zarodków w stadiach E8.5 i E9.5 (Rysunek 2). Wyniki wykazują, że miogenina występuje na promotorze miogeniny w zarodkach E8.5 i E9.5. Oczyszczone w procesie ChIP DNA analizowano za pomocą konwencjonalnej PCR (Rysunek 2A) oraz ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 2B). Z kolei w worku żółtkowym, w którym miogenina nie jest ekspresowana, nie stwierdzono wiązania miogeniny z promotorem miogeniny. Jako negatywną kontrolę sekwencji wykorzystano promotor interferonu-γ (IFNγ), który zawiera sekwencje odpowiadające miejscu wiązania miogeniny. Zgodnie z oczekiwaniami, miogenina nie wiązała się z promotorem IFNγ w żadnej z badanych próbek tkanek. W zarodkach E8.5 i E9.5 miogenina jest specyficznie ekspresowana w somytach (Rysunek 3; 6,10), które są prekursorami mięśni szkieletowych. Wyniki te wskazują zatem, że miogenina wiąże się z promotorem miogeniny w somytach w stadiach E8.5 i E9.5.

figure-protocol-1
Rycina 1. Disekcja zarodka E8.5. (A) Izolowany róg macicy (panel górny; większe powiększenie pokazane w panelu dolnym). (B) Róg macicy przecięty nożyczkami w celu oddzielenia poszczególnych miejsc implantacji zawierających pojedyncze zarodki. (C) Zarodki wystające z tkanki macicy podczas disekcji. Strzałki wskazują zarodki wciąż pokryte tkanką pozazarodkową. (D) Dwa zarodki E8.5 z tego samego miotu. Zarodek po lewej nie rozpoczął procesu obrotu. Zarodek po prawej znajduje się w trakcie obrotu. Po prawej stronie – reprezentatywny zarodek E9.5.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Analiza ChIP wykazująca wiązanie miogeniny do promotora miogeniny w embrionach E8.5 i E9.5. (Góra) Konwencjonalna analiza PCR 5 µL DNA oczyszczonego w eksperymentach ChIP z użyciem przeciwciała przeciwko miogeninie lub niespecyficznego IgG, przeprowadzona z użyciem starterów amplifikujących fragment promotora miogeniny od -79 do +69 względem miejsca startu transkrypcji, który zawiera miejsce wiązania miogeniny zlokalizowane przy -12, lub starterów amplifikujących fragment promotora IFNγ zawierający sekwencję odpowiadającą miejscu wiązania miogeniny zlokalizowanemu ok. 1075 bp powyżej miejsca startu transkrypcji. Użyte sekwencje starterów IFNγ to 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3' oraz 5'-TGA GGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (Dół) Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym tych samych próbek, których użyto w (A). Dane przedstawiono jako % input +/- odchylenie standardowe.

figure-protocol-3
Rycina 3. Miogenina jest specyficznie wyrażana w somytach embrionów w stadiach E8.5 i E9.5. Hybrydyzacja in situ całego preparatu dla miogeniny wykazuje specyficzną ekspresję mRNA w somytach. Pasek skali na obrazie E8.5 - 200 μm. Pasek skali na obrazie E9.5 - 500 μm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W opisanym protokole ChIP wykazujemy, że regulator miogenezy, miogenina, wiąże się z promotorem miogeniny w tkance prekursorowej mięśni szkieletowych obecnej w pojedynczych embrionach w stadiach E8.5 i E9.5. Wcześniejsze badania szczegółowo scharakteryzowały wiązanie miogeniny z sekwencjami zawierającymi pudełko E, począwszy od wstępnych eksperymentów przesunięcia elektroforetycznego in vitro z wykorzystaniem miogeniny translacjej in vitro lub produkowanej bakteryjnie oraz znakowanego radioaktywnie DNA ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i regulacjami określonymi przez IACUC University of Massachusetts Medical School.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez NIH R01 GM56244 dla ANI, co obejmuje fundusze przyznane w ramach American Recovery and Reinvestment Act z 2009 roku, oraz przez NIH R01 GM87130 dla JARP

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do analizy ChIPUpstate, Millipore17-295
Kolagenaza typu IIInvitrogen17101015Rozcieńczenie w 1x PBS
Dulbecco’pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) GIBCO, by Life Technologies12100-061Wysoka zawartość glukozy
Dulbecco’bufor fosforanowy z solą 1X (DPBS)GIBCO, by Life Technologies14190-144Wolny od chlorku wapnia, wolny od chlorku magnezu
Płytkowa surowica bydlęca (FBS)Mediatech, Inc.35-010-CV
Zestaw do izolacji z żeluQIAquick28704zestaw do 50 reakcji
Roztwór zapasowy penicyliny/streptomycynyGIBCO, by Life Technologies5000 μstężenie g/ml
Koktajl inhibitorów proteazSigma-AldrichP8340
DNA z plemni łososia / agaroza z białkiem AEMD Millipore16-157
przeciwciało przeciwko miogeninieSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-576
Normalne IgG królikaEMD Millipore12-370
Platinum PCR SupermixInvitrogen11306-016
mieszanka GoTaq Q-PCR master mixPromega Corp.A6001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
  2. Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
  3. Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
  4. Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, Suppl 1. 21-30 (2006).
  5. Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
  6. Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
  7. Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
  8. Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
  9. Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
  10. Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
  11. Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
  12. Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
  13. Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
  14. Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
  15. French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
  16. Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
  17. Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
  18. Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
  19. Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
  20. Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
  21. Serna, dela, L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
  22. Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
  23. Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
  24. Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
  25. Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
  26. Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
  27. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

85 dzie embrionalnyzawiesina pojedynczych kom reksieciowanie DNAfragmentacja sonicznaoczyszczanie DNAilo ciowa PCR

Powiązane artykuły