Krzemowe mikroczipy do manipulowania oddziaływaniami międzykomórkowymi

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje podejście eksperymentalne do dynamicznej regulacji oddziaływań międzykomórkowych między komórkami adherentnymi w skali mikrometrycznej. Zademonstrowano manipulację komunikacją międzykomórkową pomiędzy hepatocytami a komórkami zrębowymi. Opracowana platforma umożliwia badanie oddziaływań komórka-komórka w różnorodnych procesach biologicznych, w tym w rozwoju i patogenezie.

Streszczenie

Rola mikrośrodowiska komórkowego jest uznawana za kluczową w określaniu losu i funkcji komórek w niemal wszystkich tkankach ssaków, od rozwoju po transformację nowotworową.  W szczególności oddziaływania z sąsiednim zrąbkiem są powiązane z szeregiem zjawisk biologicznych; jednak konwencjonalne techniki ograniczają możliwość badania przestrzennych i dynamicznych elementów takich interakcji.

W mikromechanicznej rekonfigurowalnej hodowli (RC) wykorzystujemy mikroobrobiony podłoże krzemowe z ruchomymi elementami, aby dynamicznie kontrolować interakcje międzykomórkowe poprzez mechaniczne repozycjonowanie. Wcześniej metoda ta była stosowana do badania komunikacji międzykomórkowej w kokulturach hepatocytów i komórek nieparenchymalnych, wykazując interakcje zależne od czasu oraz ograniczony zasięg sygnalizacji rozpuszczalnej ¹.

W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy przygotowanie i zastosowanie systemu RC. Rozpoczynamy od zaprezentowania sposobu manipulowania częściami urządzenia za pomocą pęsety, w tym przełączania między konfiguracją z przerwą a konfiguracją z kontaktem (populacje komórek oddzielone wąską przerwą 80-µm lub w bezpośrednim, ścisłym kontakcie). Następnie szczegółowo omawiamy proces przygotowania podłoży do hodowli oraz wieloetapowy proces wysiewu komórek niezbędny do uzyskania konfluentnych monowarstw komórkowych. Wykorzystując mikroskopię żywych komórek, ilustrujemy manipulowanie komórkami w czasie rzeczywistym pomiędzy różnymi możliwymi konfiguracjami eksperymentalnymi. Na koniec demonstrujemy kroki niezbędne do regeneracji powierzchni urządzenia w celu jego ponownego wykorzystania: czyszczenie toluenem i roztworem piranhas, powlekanie polistyrenem oraz traktowanie plazmą tlenową.

Protokół

Przygotowanie kultur komórkowych:

1. Należy rozpocząć od części silikonowych powlekonych polistyrenem traktowanym plazmą.
2. Powlec części odpowiednimi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, aby wspomóc adhezję pożądanego typu komórek. W przypadku hepatocytów inkubować w roztworze Collagen-1 o stężeniu 50 µg/ml w temperaturze 37°C przez 45 min. W przypadku fibroblastów 3T3 macierz nie jest wymagana.
3. Zablokować części z elementami komplementarnymi w konfiguracji kontaktowej.
4. Namoczyć w 70% etanolu przez minimum 10 min w celu sterylizacji. Płukać 2x w ddH₂O oraz 1x w pożywce do hodowli komórek.
5. Zasiać komórki w stężeniu 500 000 komórek/ml w odpowiedniej pożywce hodowlanej. Użyć 1 ml w każdym dołku 12-dołkowej płytki hodowlanej.
6. Inkubować przez 1 h, wstrząsając co 15 min w celu równomiernego resuspendowania komórek.
7. Jeśli po 1 h nie uzyskano zlewnej monowarstwy, należy odessać zawiesinę komórkową i powtórzyć sianie ze świeżą zawiesiną. Powtarzać do momentu uzyskania pożądanej gęstości komórek.
8. Usunąć części komplementarne. Przenieść części do świeżych dołków i inkubować przez noc, aby umożliwić komórkom pełną adhezję i rozprzestrzenienie się.
9. Utworzyć kokultury, blokując odpowiednie części w konfiguracji z przerwą (gap) lub kontaktowej. Konfigurację można zmienić w dowolnym momencie hodowli.
10. Podczas wymiany pożywki należy zadbać o to, aby komórki pozostały suche przez jak najkrótszy czas, najlepiej tylko przez sekundę lub dwie. Odessać płyn jedną ręką i natychmiast zastąpić pożywkę drugą ręką.

Obróbka części krzemowych w celu ponownego użycia:

1. Usuń komórki, namaczając elementy w wybielaczu, a następnie płucząc wodą.
2. Pozostaw części do całkowitego wyschnięcia. Namocz w toluenie przez 2 h, aby usunąć polistyren.
3. Oczyść w roztworze piranha (1:2 H₂O₂:H₂SO₄) podgrzanym do 120°C.
4. Płucz przez 15 min w ciągłym strumieniu ddH₂O. Jeśli polistyren nie będzie nakładany natychmiast, przechowuj części w wodzie.
5. Rozpuść polistyren w toluenie w stężeniu 100 mg/ml. Mieszaj na wortexie w stożkowej probówce z polipropylenu przez około 1 h lub do całkowitego rozpuszczenia. Na każde 10 części wymagane jest nieco ponad 1 ml roztworu.
6. Naniesienie roztworu polistyrenu metodą spin-coatingu na poszczególne części krzemowe przy 2 400 rpm przez 30 s.
7. Wypalaj przez co najmniej 5 h w temperaturze 120°C.
8. Poddaj działaniu plazmy tlenowej (200 mTorr, 200 W) przez 1 min.

Dyskusja

System ten jest wyjątkowy, ponieważ umożliwia dynamiczne manipulowanie organizacją przestrzenną tkanki na poziomie komórkowym. W konsekwencji urządzenie to pozwoliło na przeprowadzenie szeregu nowatorskich eksperymentów biologicznych, obejmujących takie zagadnienia jak dynamika sygnalizacji międzykomórkowej, sygnalizacja kontaktowa w porównaniu z rozpuszczalną, decyzje dotyczące losu komórek, toksykologia oraz wzajemna komunikacja komórkowa. Urządzenie to powinno być szeroko stosowalne, ponieważ podłożem hodowlanym jest ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Krzemowe podłoża grzebieniowe	Narzędzie	N/A	N/A	Części są dostępne dla wspólnych projektów badawczych. Prosimy o kontakt z Elliotem Hui (eehui @ alum . mit . edu) lub Sangeetą Bhatią (sbhatia @ mit . edu).