Artykuł metodologiczny

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2681

⸱

25 maja 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Brigham and Women's Hospital, 3Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center, 4Department of Pathology, Division of Neuropathology, Brigham and Women's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Streszczenie

Neuralne komórki macierzyste (NSCs) znajdują się wzdłuż neuroepithelium strefy komorowej podczas rozwoju blaszki korowej. Te wczesne progenitory dają ostatecznie początek progenitorom pośrednim, a później różnym podtypom komórek neuronalnych i glejowych, z których tworzy się kora mózgu. Zdolność do generowania i namnażania ludzkich NSCs (tzw. neurosfer) z odrzuconej normalnej tkanki płodowej umożliwia bezpośrednie badanie funkcjonalnych aspektów prawidłowego rozwoju ludzkich NSCs 1-5. Podejście to można również zastosować do generowania NSCs w przypadku znanych schorzeń neurologicznych, co stwarza możliwość zidentyfikowania procesów chorobowych zmieniających proliferację, migrację i różnicowanie progenitorów 6-9. Skupiliśmy się na identyfikacji mechanizmów patologicznych w ludzkich NSCs z zespołem Downa, które mogą przyczyniać się do przyspieszonego fenotypu choroby Alzheimera 10,11. Żadne modele mysie, ani in vivo, ani in vitro, nie są w stanie odtworzyć identycznego zestawu genów zlokalizowanych na ludzkim chromosomie 21.

W niniejszej pracy zastosowano prostą i niezawodną metodę izolacji NSC z kory płodów ludzkich z zespołem Downa oraz ich hodowli in vitro. Metodyka ta obejmuje szczegółowe aspekty pobierania tkanki, preparatyki przy ograniczonych punktach orientacyjnych anatomicznych, sortowania komórek, wysiewania i pasażowania ludzkich NSC. Przedstawiamy również podstawowe protokoły indukcji różnicowania ludzkich NSC w bardziej specyficzne podtypy komórek.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i materiałów do sekcji oraz utrzymania hodowli komórek macierzystych neuronów

  1. Przygotować wcześniej 10 ml pożywki do mikrodysekcji (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) i przechowywać w lodówce.
  2. Przygotować 10 ml pożywki hodowlanej (Stem Pro NSC SFM, Invitrogen) i utrzymywać w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej.
  3. Przygotować pożywkę do mrożenia komórek (KNOCKOUT DMEM/F12+10%FBS+ 5%DMSO) do długoterminowej kriosprzechowywania komórek.
  4. W razie potrzeby przygotować 4% paraformaldehyd (PFA) do utrwalania tkanek.
  5. Do mikrodysekcji należy użyć sterylnych, autoklawowanych pincet oraz ostrzy skalpela z uchwytami.
  6. Przygotować pipetor automatyczny, pipety transferowe 10 ml oraz sitko do komórek 40 μM (BD Falcon 352340) do dysocjacji.
  7. Przygotować kilka szalek hodowlanych 10 cm (BD) do mikrodysekcji, probówki wirówkowe 50 ml (BD) do dysocjacji, probówki wirówkowe 1,5 ml do przechowywania tkanek oraz kriotubki (BD) do mrożenia komórek.

2. Izolowanie ludzkich komórek macierzystych neuronów z ludzkiego mózgu płodowego

  1. Kluczem do sukcesu procedury jest pobranie żywej tkanki natychmiast po terminacji płodu. W przypadku zabiegów planowych czas pobrania próbek można ustalić z wyprzedzeniem, aby zminimalizować czas po śmierci płodu. Produkty poczęcia są pobierane w ciągu 2 godzin po zabiegu, ale w przypadku procedur planowych idealnie można to osiągnąć w ciągu kilku minut. Tkanki płodowe są często pofragmentowane. Jednak zazwyczaj znaczna część mózgu pozostaje nienaruszona, co umożliwia identyfikację wizualną. Ograniczenia wieku ciążowego (GA) są określone przez prawo ustawowe, ale protokół ten był stosowany w okresie między 18. a 2. tygodniem GA.
  2. Mózg płodu umieszcza się w szalce Petriego o pojemności 10 ml zawierającej schłodzony do temperatury lodu roztwór KNOCKOUT DMEM/F12. Różne części kory identyfikuje się na podstawie punktów orientacyjnych anatomicznych. Granice kory czołowej oraz ciemieniowo-potylicznej wyznacza ekstrapolowana przecięcie bruzdy środkowej i szczeliny Sylwiusza. Tkankę z kory czołowej przedniej względem bruzdy środkowej i wzdłuż brzegu szczeliny Sylwiusza wycina się za pomocą skalpeli, dbając o to, aby komora pozostała nienaruszona i nieuszkodzona.
  3. Z oddzielonego bloku kory czołowej usuwa się wszelką pozostałą krew i opony mózgowe. Jeśli próbka jest wystarczającej jakości, najlepiej podzielić blok na kilka mniejszych próbek do różnych celów: do przekrojów (utrwalonych w 4% paraformaldehydzie, PFA) oraz do analiz białek/mRNA (szybko zamrożonych w temperaturze -80°C).
  4. Wybrany blok mózgu przenosi się do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaje schłodzony do temperatury lodu roztwór KNOCKOUT DMEM/F12 w ilości około 3-krotnej objętości tkanki. Tkankę delikatnie dysocjuje się poprzez mechaniczne pipetowanie pipetą transferową 10 ml, aż cała tkanka zostanie pofragmentowana (zazwyczaj 20-30 razy), a następnie komórki filtruje się przez sito komórkowe 40 μM (BD Falcon 352340), aby uzyskać zawiesinę pojedynczych lub prawie pojedynczych komórek.
  5. Zawiesinę komórkową wiruje się przy 200 rpm w temperaturze pokojowej przez 5 min, osad komórkowy resuspenduje w 10 ml świeżego, ciepłego medium hodowlanego (Stem Pro NSC SFM), a liczbę komórek ocenia się za pomocą hemocytometru.
  6. Do każdej kolby hodowlanej o powierzchni 25 cm2 dodaje się 5 ml ciepłego medium hodowlanego i przenosi 2X106 komórek do każdej kolby. Hodowle utrzymuje się w inkubatorze 37°C/5% CO2 przez 1 tydzień przed analizą. Połowę medium wymienia się raz w tygodniu w przypadku dalszych hodowli lub eksperymentów.

3. Manipulacja komórkami macierzystymi neuronów w celu ich dalszej charakterystyki lub przeprowadzenia eksperymentów

  1. Neurosfery zazwyczaj tworzą się w ciągu 1 do 2 tygodni w zalecanych warunkach hodowli, a średnica NSC waha się od 20 do 40 μm. Neurosfery na tym etapie można dysocjować za pomocą 0,2 g/L EDTA w pożywce Hanksa wolnej od wapnia i magnezu (Hanks) w temperaturze 37°C przez 15 min w celu uzyskania pojedynczych komórek. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 20 rpm, płucze w świeżej pożywce Hanks i ponownie wysiewa w ciepłym medium hodowlanym do subkultury.
  2. Aby zainicjować różnicowanie, zdysocjowane komórki wysiewa się na szkiełka cover-slip powlekane poli-D-lizyną/lamininą 1 z gęstością 1X105 komórek na szkiełko (24mmX24mm). Różnicowanie w kierunku oligodendrocytów osiąga się poprzez utrzymywanie komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 (Invitrogen, Main, MD)+2% B27(50X, Invitrogen, Main, MD)+10ng/ml bFGF+10ng/ml SHH+ 10ng/ml PDGF-AA przez 2 dni, a następnie zmianę na to samo medium bez czynników wzrostu na kolejne 5 dni. Różnicowanie w kierunku neuronów osiąga się poprzez utrzymywanie komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 +2% B27 (50X) przez 7 dni. Różnicowanie w kierunku astrocytów przeprowadza się poprzez hodowlę komórek w KNOCKOUT DMEM/F12 +1%FBS przez tydzień.
  3. Transfekcja genów do komórek macierzystych neuronów może być przeprowadzona na zdysocjowanych komórkach z uprzednio utworzonych neurosfer. W tym przypadku przedstawiono komórki macierzyste neuronów transfekowane EGFP-C1 metodą elektroporacji. Elektroporacja konstruktu EGFP-C1 została przeprowadzona przy użyciu zestawów AMAXA Nucleofector Kits for Mouse Neural Stem Cells (VPG-104) z urządzeniem AMAXA Nucleofector (Lonza AAD-101), zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie, 5 μg DNA oraz 1 X 106 komórek zmieszano ze 100 μl medium do transfekcji, a po impulsowej elektroporacji komórki resuspendowano w medium do utrzymania komórek macierzystych neuronów do dalszej hodowli. Różnicowanie transfekowanych komórek przeprowadzano poprzez dysocjację neurosfer 3-4 dni po elektroporacji, stosując te same procedury opisane w kroku 3.2.

4. Zamrażanie neuronalnych komórek macierzystych i subkultur

  1. Rozdzielone zawiesiny komórek odwirowuje się i resuspenderuje w medium do mrożenia, osiągając stężenie 1X107 cells/vial/ml. Komórki powoli zamraża się w temperaturze -20°C, następnie w -80°C, a potem przenosi do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.
  2. Komórki szybko rozmraża się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i resuspenderuje w ogrzanym DMEM/F12+10% serum w celu przemycia, po czym odwirowuje, aby usunąć medium do mrożenia, i resuspenderuje w ogrzanym medium hodowlanym.

5. Reprezentatywne wyniki:

Neuralne komórki macierzyste pochodzące z prawidłowego płodu w 18. tygodniu wieku ciążowego hodowano zgodnie z opisanymi metodami; po tygodniu widoczne są neurosfery o okrągłych, gładkich krawędziach i dość jednorodnej wielkości (Ryc. 2A). Neurosfery te można transfekować EGFP-C1 lub innymi konstruktami i obserwować pod mikroskopem fluorescencyjnym (Ryc. 2B). Uformowane neurosfery dysocjowano następnie za pomocą EDTA i wysiano w formie pojedynczych komórek na powlekane szkiełka cover-slip. Komórki różnicowane zgodnie z odpowiednimi protokołami utrwalono 4% paraformaldehydem i barwiono markerami specyficznymi dla różnych typów komórek. Multipotencjalność zaobserwowano poprzez ekspresję markerów wskazujących na neurony (Ryc. 2C, D, rodamina), astrocyty (Ryc. 2E, F, rodamina) oraz oligodendrocyty (Ryc. 2G, H, rodamina). Komórki, które nie zostały poddane elektroporacji EGFP, również zróżnicowano na różne typy komórek i zabarwiono markerami specyficznymi dla poszczególnych komórek. Multipotencjalność zaobserwowano poprzez ekspresję markerów wskazujących na neurony (Ryc. 3A, B, fluoresceina), astrocyty (Ryc. 3C, rodamina oraz Ryc. 3D, fluoresceina) i oligodendrocyty (Ryc. 3E, F, rodamina).

Schemat hodowli neurosfer; wycinek kory mózgu, dysocjacja komórek, charakterystyka NSC, proces pasażowania.
Rycina 1. Schemat procedury eksperymentalnej izolacji komórek macierzystych mózgu z odrzuconego ludzkiego płodu

Obrazy mikroskopowe różnicowania komórek macierzystych; znakowanie GFP; obejmuje markery MAP2, DCX, GFAP, S10B, O1, O4.
Rycina 2. Propagacja niezróżnicowanych i zróżnicowanych ludzkich komórek neuronalnych in vitro(A) Neurosfery ukazane w mikroskopii kontrastowej wykazują gładkie, okrągłe krawędzie i szybki wzrost po ponad tygodniowej hodowli. (B) Wprowadzanie różnych plazmidów i konstruktów można osiągnąć poprzez transfekcję. Trzy dni po transfekcji EGFP-C1 w wielu komórkach widoczna jest ekspresja zielonego białka fluorescencyjnego, co ukazano w immunobarwieniu fluoresceiną oraz w mikroskopii fluorescencyjnej. Transfekowane EGFP-C1 neurosfery poddano dysocjacji i różnicowaniu w różnych warunkach w kierunku neuronów (C, D), astrocytów (E, F) i oligodendrocytów (G, H), co ukazano w fluorescencji rodaminowej. Równocześnie transfectionarne komórki EGFP-dodatnie ukazano w fluorescencji fluoresceiny. Komórki transfekowane (białe groty strzałek) są nieodróżnialne od komórek nietransfekowanych (białe strzałki). Jądra komórkowe zabarwiono Hoechst342. Paski skali wynoszą 200 μm dla A, 100 μm dla B i 25 μm dla C-H.

Ekspresja markerów komórek neuronalnych, obrazy immunofluorescencyjne; analiza MAP2, DCX, GFAP, S10B, O1, O4.
Rysunek 3. Neurosfery bez transfekcji zostają rozproszone i poddane różnicowaniu w różnych warunkach w neurony (A, B, fluoresceina), astrocyty (C, rodamina, D, fluoresceina) oraz oligodendrocyty (E, F, rodamina). Jądra komórkowe wybarwiono barwnikiem Hoechst 342. Paski skali wynoszą 25 μm dla A-F.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Istnieją różne podejścia do hodowli świeżej tkanki i wytwarzania ludzkich linii komórkowych. Historycznie świeżą tkankę pobierano i hodowano natychmiast w celu generowania różnych typów komórek ośrodkowego układu nerwowego. Podejście to jest jednak wyraźnie ograniczone liczbą próbek, które można uzyskać, a która w przypadku próbek ludzkich jest zazwyczaj niewielka. Ze względu na minimalny stopień manipulacji, świeżo hodowane komórki neuronalne stanowią najsolidniejszy system eksperymentalny, ograniczając potencjalne arte...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Niniejsza praca została częściowo sfinansowana przez National Institutes of Health: HD054347 oraz NS063997-01 dla VLS. Praca ta została również częściowo sfinansowana przez Empire State Stem Cell Fund za pośrednictwem kontraktu nr C024324 Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork dla VLS. Opinie wyrażone w niniejszym opracowaniu są wyłącznie opiniami autora i niekoniecznie odzwierciedlają stanowisko Empire State Stem Cell Board, Departamentu Zdrowia Stanu Nowy Jork ani Stanu Nowy Jork. VLS jest laureatem Doris Duke Clinical Scientist Developmental Award. Dziękujemy również profesorowi Timothy'emu Vartanianowi za przekazanie przeciwciał Anti-O1 i Anti-O4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KNOCKOUT DMEM/F12Invitrogen12660-012Pożywka do dysocjacji
Stem Pro NSC SFMInvitrogenA10509-01Pożywka hodowlana
Surowica bydlęca płodowaInvitrogen10091-148Pożywka do mrożenia
Roztwór Hanksa (-Ca2+, -Mg2+)Invitrogen14175-095Pożywka do dysocjacji
DMSOSigma-AldrichD2650Pożywka do mrożenia
EDTASigma-Aldrich431788Pożywka do dysocjacji
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127Roztwór utrwalający
bFGFR&D Systems234-FSEPożywka różnicująca
SHHR&D Systems1845-SHPożywka różnicująca
PDGF-AAR&D Systems221-AAPożywka różnicująca
B27Invitrogen17504-044Pożywka różnicująca
Przeciwciało mysie anty-MAP2Sigma-AldrichM23201:200
Przeciwciało królicze anty-DCXCell Signaling Technology4604s1:200
Przeciwciało królicze anty-GFAPDakoZ03341:200
Przeciwciało królicze anty-S100BDakoZ03111:200
Przeciwciało królicze anty-O1dar profesora Timothy'ego Vartaniana*1:50
Przeciwciało królicze anty-O4Dar profesora Timothy'ego Vartaniana*1:50
Sito komórkowe 40μm BD Biosciences352340
* Timothy Vartanian, MD, PhD, Katedra Neurologii i Neuronauk, Weill Cornell Medical College, Nowy Jork, USA

Bibliografia

  1. Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
  2. Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and in vivo. Brain Pathol. 9, 569-598 (1999).
  3. Schwartz, P., Bryant, P., Fuja, T., Su, H., O'Dowd, D., Klassen, H. Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).
  4. Martinez-Serrano, A., Rubio, F. J., Navarro, B., Bueno, C., Villa, A. Human neural stem and progenitor cells: in vitro and in vivo properties, and potential for gene therapy and cell replacement in the CNS. Curr Gene Ther. 1, 279-299 (2001).
  5. Rajan, P., Snyder, E. Neural stem cells and their manipulation. Methods Enzymol. 419, 23-52 (2006).
  6. Ruiz-Lozano, P., Rajan, P. Stem cells as in vitro models of disease. Curr Stem Cell Res Ther. 2, 280-292 (2007).
  7. Sheen, V., Ferland, R., Harney, M., Hill, R., Neal, J., Banham, A., Brown, P., Chenn, A., Corbo, J., Hecht, J., Folkerth, R., Walsh, C. Impaired proliferation and migration in human Miller-Dieker neural precursors. Ann Neurol. 60, 137-144 (2006).
  8. Bahn, S., Mimmack, M., Ryan, M., Caldwell, M., Jauniaux, E., Starkey, M., Svendsen, C., Emson, P. Neuronal target genes of the neuron-restrictive silencer factor in neurospheres derived from fetuses with Down's syndrome: a gene expression study. Lancet. 359, 310-315 (2002).
  9. Ferland, R. J., Batiz, L. F., Neal, J., Lian, G., Bundock, E., Lu, J., Hsiao, Y. C., Diamond, R., Mei, D., Banham, A. H. Disruption of neural progenitors along the ventricular and subventricular zones in periventricular heterotopia. Hum Mol Genet. 18, 497-516 (2009).
  10. Esposito, G., Imitola, J., Lu, J., De Filippis, D., Scuderi, C., Ganesh, V. S., Folkerth, R., Hecht, J., Shin, S., Iuvone, T., Chesnut, J., Steardo, L., Sheen, V. Genomic and functional profiling of human Down syndrome neural progenitors implicates S100B and aquaporin 4 in cell injury. Hum Mol Genet. 17, 440-457 (2008).
  11. Esposito, G., Scuderi, C., Lu, J., Savani, C., De Filippis, D., Iuvone, T., Steardo, L. J. r, Sheen, V., Steardo, L. S100B induces tau protein hyperphosphorylation via Dickopff-1 up-regulation and disrupts the Wnt pathway in human neural stem cells. J Cell Mol Med. 12, 914-927 (2008).
  12. Flax, J. D., Aurora, S., Yang, C., Simonin, C., Wills, A. M., Billinghurst, L. L., Jendoubi, M., Sidman, R. L., Wolfe, J. H., Kim, S. U., Snyder, E. Y. Engraftable human neural stem cells respond to developmental cues, replace neurons, and express foreign genes. Nat Biotechnol. 16, 1033-1039 (1998).
  13. Fults, D., Pedone, C. A., Morse, H. G., Rose, J. W., McKay, R. D. Establishment and characterization of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J Neuropathol Exp Neurol. 51, 272-280 (1992).
  14. Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities? Nat Rev Neurosci. 11, 176-187 (2010).
  15. Svendsen, C. N., ter Borg, M. G., Armstrong, R. J., Rosser, A. E., Chandran, S., Ostenfeld, T., Caldwell, M. A. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. J Neurosci Methods. 85, 141-152 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzka tkanka p odowasekcja kory m zgutworzenie neurosferr nicowanie kom rekcytometria przep ywowakrio konserwacjaprotok subkulturyekspresja marker wmodel zespo u Downa

Powiązane artykuły