Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Podsumowanie

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Streszczenie

Mikromacierze DNA stały się potężnym narzędziem w detekcji patogenów.^1-5 Wykazano na przykład wiele przykładów możliwości typowania i subtypowania wirusa grypy.^6-11 Identyfikacja i subtypowanie grypy za pomocą mikromacierz DNA znajduje zastosowanie zarówno w zdrowiu publicznym, jak i w praktyce klinicznej w celu wczesnego wykrywania, szybkiej interwencji oraz minimalizacji skutków pandemii grypy. Tradycyjna fluorescencja jest obecnie najczęściej stosowaną metodą detekcji w mikromacierzach. Jednak w miarę jak technologia mikromacierzowa zmierza w stronę zastosowań klinicznych,¹ zastąpienie kosztownej aparatury niskokosztową technologią detekcji, wykazującą podobne charakterystyki wydajności co fluorescencja, sprawi, że testy z wykorzystaniem mikromacierzy staną się bardziej atrakcyjne i opłacalne.

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przeznaczona do zastosowań badawczych i posiada granicę wykrywalności w obrębie jednego rzędu wielkości w stosunku do tradycyjnej fluorescencji¹¹, a jej główną zaletą jest około dziesięciokrotnie niższy koszt aparatury w porównaniu do konfokalnych skanerów mikroarrays wymaganych do detekcji fluorescencyjnej. Inną zaletą jest kompaktowy rozmiar urządzenia, który zapewnia przenośność i elastyczność, w przeciwieństwie do tradycyjnych instrumentów fluorescencyjnych. Ponieważ technologia polimeryzacji nie jest jednak tak z natury liniowa jak detekcja fluorescencyjna, najlepiej nadaje się ona do zastosowań w mikroarrays o niższej gęstości, w których pożądana jest odpowiedź tak/nie dotycząca obecności określonej sekwencji, na przykład w matrycach do wykrywania patogenów. Obecnie maksymalna gęstość plamek kompatybilna z detekcją ampliPHOX wynosi ˜1800 spots/array. Ze względu na ograniczenia dotyczące gęstości plamek, mikroarrays o wyższej gęstości nie nadają się do detekcji metodą ampliPHOX.

W niniejszej pracy prezentujemy technologię detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jako metodę wzmacniania sygnału na mikromacierzy o niskiej gęstości, opracowanej do detekcji i charakteryzacji wirusów grypy (FluChip). Chociaż niniejszy protokół wykorzystuje FluChip (mikromacierz DNA) jako jedną z konkretnych aplikacji detekcji ampliPHOX, każdą mikromacierz zawierającą biotynilowany cel można znakować i wykrywać w podobny sposób. Projekt mikromacierzy oraz biotynilacja celu do przechwycenia leżą po stronie użytkownika. Po przechwyceniu biotynilowanego celu na macierzy detekcję ampliPHOX można przeprowadzić, najpierw znakując macierz koniugatem z etykietą streptawidyny (ampliTAG). Po ekspozycji na światło przy użyciu urządzenia ampliPHOX Reader dochodzi do polimeryzacji roztworu monomeru (ampliPHY) wyłącznie w obszarach zawierających cele znakowane ampliTAG. Powstały polimer można następnie zabarwić nietoksycznym roztworem w celu poprawy kontrastu wizualnego, a następnie przeprowadzić obrazowanie i analizę za pomocą prostego pakietu oprogramowania (ampliVIEW). Cały test FluChip, od nieekstrahowanej próbki do uzyskania wyniku, można przeprowadzić w około 6 godzin, a opisane powyżej etapy detekcji ampliPHOX można ukończyć w około 30 min.

Protokół

1. Amplifikacja próbek metodą RT-PCR

1. Wyodrębnij wirusowe RNA z materiału klinicznego lub izolatu wirusa, używając zestawu Qiagen MinElute Virus Spin Kit wraz z zautomatyzowaną platformą do ekstrakcji kwasów nukleinowych QIAcube. Ekstrakcje przeprowadza się z 200 μl próbki przy końcowej objętości elucji wynoszącej 60 μl. Ekstrakty przechowuj w temperaturze -70°C lub niższej do późniejszego użycia.
2. W strefie wolnej od matrycy przygotuj na lodzie mieszaninę master mix do RT-PCR zgodnie z protokołem producenta. Aby wprowadzić biotynę podczas RT-PCR, użyj biotynilowanej mieszaniny dNTP zamiast mieszaniny dNTP dostarczonej przez producenta. Koszt zastosowania biotynilowanej mieszaniny dNTP jest niższy niż 1 USD/test. Można również stosować alternatywne metody wprowadzania biotyny, takie jak użycie biotynilowanej startera. Dodaj mieszaniny starterów w końcowych stężeniach 1,0 μM dla Flu A, 1,0 μM dla Flu B oraz 0,14 μM dla kontroli wewnętrznej. Zestaw starterów dla Flu A amplifikuje segment genu macierzy (produkt 1032 nt), a zestaw starterów dla Flu B amplifikuje niestrukturalny segment genu (produkt 811 nt). Każdy zestaw starterów FluChip zawiera jeden starter z grupą fosforanową na końcu 5', aby ułatwić generowanie jednoniciowego DNA poprzez trawienie enzymatyczne egzonukleazą lambda po PCR. Powstały produkt jednoniciowy wymaga znacznie krótszego czasu hybrydyzacji niż odpowiednik dwuniciowy, co znacząco skraca całkowity czas analizy. Przygotowana wcześniej mieszanina tych starterów, jak również matrycowe RNA kontroli wewnętrznej, są dostępne od InDevR dla zainteresowanych badaczy w ograniczonym zakresie.
3. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i rozdziel 18 μl master mixu do cienkościennych probówek PCR.
4. Przenieś probówki na lodzie do odpowiedniego obszaru roboczego w celu dodania matrycy, a następnie dodaj 2 μl matrycy do każdej probówki z reakcją.
5. Przenieś probówki PCR do termocyklera i przeprowadź następujący profil termiczny: odwrotna transkrypcja w 50°C przez 30 min, inaktywacja/aktywacja enzymu w 95°C przez 15 min, 40 cykli PCR: 95°C przez 30 s, 55°C przez 30 s i 72°C przez 1 min oraz końcowa elongacja w 72°C przez 10 min.

2. Hybrydyzacja produktów RT-PCR z macierzami o niskiej gęstości

1. W celu wytworzenia jednoniciowego DNA do hybrydyzacji FluChip, przygotować mieszaninę do trawienia enzymatycznego, łącząc 1,0 μl enzymu egzonukleazy lambda, 2,2 μl dołączonego buforu reakcyjnego oraz 0,8 μl wody wolnej od nukleaz. Ilości te dotyczą jednej próbki, ale można je łatwo przeskalować dla całkowitej liczby próbek przeznaczonych do trawienia. Wyjąć próbki z termocyklera i dodać 4 μl przygotowanej mieszaniny do każdej reakcji, aby strawić fosforylowaną nić produktu PCR. Umieścić próbki z powrotem w termocyklerze i zaprogramować urządzenie na 37 °C przez 15 minut, a następnie na 95 °C przez 10 minut, aby zakończyć etapy trawienia enzymatycznego i fragmentacji termicznej.
2. Użyte niestandardowe mikromacierze grypy są naniesione na szklane slajdy funkcjonalizowane aldehydem przez firmę Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). Sekwencje wychwytujące z końcem 5'-amino są łączone z zoptymalizowanym buforem do naniesienia i drukowane w końcowym stężeniu 20 μM (z wyjątkiem sekwencji kontroli pozytywnej, która posiada dodatkowo modyfikację 3'-biotyny i jest nanoszona w końcowym stężeniu 500 nM). Stosowana jest bezkontaktowa metoda naniesienia, z optymalną średnicą plamki 300 μm i rozstawem od środka do środka wynoszącym 700 μm.
3. Wyjąć mikromacierze z pudełka do przechowywania i nałożyć jednorazowe studzienki do hybrydyzacji wokół mikromacierzy, zdejmując folię ochronną i mocno dociskając obwód studzienki.
4. Umieścić slajdy w pojemniku do płukania zawierającym 110 ml oczyszczonej wody w celu przeprowadzenia 5-minutowego płukania przed hybrydyzacją przy użyciu wstrząsarki orbitalnej przy prędkości 60-90 rpm. Osuszyć macierz, delikatnie dotykając krawędzi studzienki chłonną chusteczką i pozwalając na odciągnięcie wody.
5. Połączyć 22 μl 2x Buforu do Hybrydyzacji z każdym z fragmentowanych produktów ssDNA, a następnie nanieść 40 μl roztworów do hybrydyzacji do studzienek mikromacierzy.
6. Pozostawić slajdy do hybrydyzacji w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 60 minut.
7. Wyjąć slajdy z komory wilgotnościowej, krótko opłukać macierze Buforem do Płukania D za pomocą butelki z rozpylaczem przed umieszczeniem ich w statywie na slajdy. Zazwyczaj objętość płukania Buforem do Płukania D wynosi 2 ml na macierz. Umieścić statyw ze slajdami w pojemniku do płukania zawierającym 110 ml Buforu do Płukania A. Umieścić pojemnik na wstrząsarce orbitalnej przy prędkości 60-90 rpm przez 1 minutę.
8. Wyjąć statyw ze slajdami z Buforu do Płukania A, krótko opłukać Buforem do Płukania D, przenieść statyw do pojemnika zawierającego Bufor do Płukania B i wstrząsać przy prędkości 60-90 rpm przez 5 minut.
9. Delikatnie osuszyć macierz na każdym slajdzie i umieścić osuszone slajdy w komorze wilgotnościowej w przygotowaniu do etapów kolorymetrycznej detekcji ampliPHOX.

3. ampliPHOX: znakowanie produktów hybrydyzacji i chipów kalibracyjnych za pomocą ampliTAG

1. Dla każdego przetwarzanego macierzy połącz 10 μl ampliTAG, 20 μl buforu 2x ampliTAG oraz 10 μl wody oczyszczonej. Objętości odczynników można łatwo przeskalować zgodnie z całkowitą liczbą próbek. Należy przygotować odpowiednią ilość mieszaniny znakującej, aby objęła wszystkie macierze próbek i macierze kalibracyjne. Liczba wymaganych chipów kalibracyjnych zależy od tego, czy przeprowadzana jest pełna kalibracja (dla nowego urządzenia lub nowej partii odczynników), czy jedynie kontrola urządzenia. W przypadku pełnej kalibracji należy oznakować 3 chipy kalibracyjne, a w przypadku kontroli odczynników tylko jeden chip kalibracyjny. Należy pamiętać, że przed oznakowaniem macierzy kalibracyjnych powinny one przejść etap mycia przed hybrydyzacją, który został wcześniej opisany dla macierzy grypy.
2. Przenieś 40 μl mieszaniny znakującej na każdą macierz i pozwól reakcji znakowania przebiegać w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 5 minut.
3. Natychmiast wypłucz macierze Buforem do Mycia D z butelki do płukania, przed umieszczeniem slajdów w statywie. Przenieś statyw do pojemnika zawierającego 110 ml Buforu do Mycia C i wstrząsaj przy 60-90 rpm przez 5 minut.
4. Używając drugiego pojemnika do mycia wypełnionego wodą oczyszczoną, wykonaj trzy kolejne krótkie zanurzenia w wodzie, aby usunąć pozostałości soli. Osusz macierze, delikatnie dotykając krawędzi studni chusteczką.
5. Mikromacierze są teraz prawidłowo oznakowane ampliTAG i można przeprowadzić pozostałą część procedury detekcyjnej ampliPHOX. Fotoaktywacja i obrazowanie oznakowanych macierzy powinny zostać zakończone w ciągu 24 godzin; pozostałe macierze można przechowywać w ciemnym pudełku na slajdy do momentu użycia.

4. ampliPHOX: kalibracja, amplifikacja sygnału i obrazowanie

1. Włącz czytnik ampliPHOX i upewnij się, że oprogramowanie ampliVIEW jest gotowe do fotoaktywacji.
2. Wyznacz optymalny czas fotoaktywacji przy użyciu chipów kalibracyjnych. Oprócz poniższego krótkiego wprowadzenia, procedura ta została szczegółowo opisana w instrukcji obsługi ampliPHOX. Chipy kalibracyjne zawierają serię rozcieńczeń biotynilowanej sekwencji kontrolnej, które są wykorzystywane do optymalizacji czułości testu, w celu maksymalizacji liczby rzędów chipa kalibracyjnego generujących sygnał dodatni zgodnie z oceną oprogramowania.
3. Wyjmij ampliPHY z temperatury 4°C, pozwól mu ogrzać się do temperatury pokojowej i krótko wymieszaj w wirówce typu vortex. Pipetuj 3 μl wzmacniacza ampliPHY do fiolki z ampliPHY, a następnie dokładnie mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 sekund.
4. Równomiernie przenieś 40 μl roztworu ampliPHY do dołka mikroarray zawierającego matrycę znakowaną ampliTAG, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Zamykaj fiolkę ampliPHY po każdym naniesieniu. Wsuń szkiełko z mikroarray do komory fotoaktywacyjnej czytnika ampliPHOX.
5. W przypadku pierwszej matrycy kalibracyjnej użyj domyślnego czasu fotoaktywacji w polu „Time” w lewym panelu oprogramowania i kliknij zielony przycisk „Start”, aby rozpocząć fotoaktywację. Po zakończeniu wyjmij matrycę i wypłucz wodą oczyszczoną, aby usunąć nadmiar ampliPHY. Powinno być teraz widoczne tworzenie się przezroczystego polimeru w niektórych punktach.
6. Pozostaw polimerowe punkty do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie nanieś dwie krople ampliRED na matrycę i pozostaw do barwienia na 2 minuty.
7. Następnie szybko wypłucz mikroarray wodą oczyszczoną i osusz chusteczką.
8. Wsuń mikroarray do komory obrazowania czytnika ampliPHOX i kliknij przycisk „Capture New Image” w karcie Imaging. Po wykonaniu zdjęcia dostosuj kadr i zapisz obraz.
9. W karcie Analysis wybierz maskę Calibration Chip i przycisk „Auto Placement”, aby rozpocząć analizę. Oprogramowanie automatycznie wygeneruje „Summary Record” z ilościowymi wynikami. Na podstawie tych wyników czas fotoaktywacji dla drugiej matrycy kalibracyjnej należy skorygować o 10 sekund i powtórzyć procedurę.
10. Po wyznaczeniu optymalnego czasu fotoaktywacji matryce z próbkami można przetworzyć zgodnie z tym samym protokołem wzmacniania sygnału i obrazowania, który zastosowano dla matryc kalibracyjnych.
11. Po wykonaniu zdjęć matryc z próbkami można utworzyć maskę dla konkretnego układu matrycy, np. dla układu matrycy grypy opisanego w niniejszym dokumencie. Oprogramowanie ampliVIEW umożliwia automatyczną analizę obrazu i generowanie wyników subtypów grypy dla każdej próbki.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schematyczny rysunek kolorymetrycznej metody detekcji ampliPHOX. (A) Biotynilowany docelowy DNA hybrydyzuje do każdego punktu w macierzy, a następnie (B) zostaje znakowany za pomocą ampliTAG. (C) Następnie dodaje się roztwór ampliPHY i (D) poddaje działaniu światła w celu utworzenia widocznych polimerowych plamek. (E) Powstałe plamki polimerowe są następnie barwione nietoksycznym barwnikiem w celu poprawy kontrastu.

Rysunek 2. (A) Układ niskogęstościowej macierzy mikroarray dla grypy. Sekwencje 1-7 oraz 10-13 są ukierunkowane na grypę A, a sekwencje 8 i 9 na grypę B. (B) Obrazy ampliPHOX oraz (C) obrazy fluorescencyjne próbki nowego szczepu H1N1 z 2009 roku („grypa świńska”), wykazujące taki sam wzór detekcji obiema metodami.

Rysunek 3. Od lewej do prawej: reprezentatywne obrazy ampliPHOX dla grypy A H3N2, H1N1 pochodzenia ludzkiego, nowego szczepu H1N1 z 2009 roku (pochodzenia świńskiego) oraz próbki negatywnej. Wszystkie trzy podtypy wykazują wyraźnie odmienne wzory na macierzy. Zauważmy, że w próbce negatywnej widoczna jest tylko wewnętrzna kontrola MS2, co wskazuje, że amplifikacja RT-PCR nie została zahamowana.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla detekcji fluorescencyjnej w jednym kolorze w zastosowaniach dla mikromacierzy o niskiej gęstości. Schematycznie przedstawiona na Rysunku 1 zasada detekcji opiera się na zastosowaniu znacznika fotoinicjatora (1B). W obecności roztworu zawierającego monomer (1C) ekspozycja na światło powoduje, że fotoinicjator (ampliTAG) wyzwala reakcję polimeryzacji wyłącznie w obszarach znakowanych (1D). Choć tec...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Qiagen MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704	pojedyncza elucja 60 μl
QIAcube	Qiagen	9001292	opcjonalnie
Szybki termocykler ABI 9800 Fast Thermal Cycler	Applied Biosystems	4441166
Zestaw Qiagen OneStep RT-PCR kit	Qiagen	210210	dNTP z zestawu nieużywane
2x Bufor do nanoszenia (Spotting Buffer)	InDevR Inc.	MI-5007
Mieszanina biotynilowanych dNTP	InDevR Inc.	MI-5009
Egzonukleaza lambda	Epicentre Biotechnologies	LE032K	2500 U, 10U/μl
Mieszanina starterów FluChip	InDevR Inc.	N/A	obecnie niedostępne w sprzedaży
Mieszadło orbitalne	Madell Technology	ZD-9556-A
Pojemniki do płukania	InDevR Inc.	MI-4002
Statywy do płukania	InDevR Inc.	MI-4003
2x Bufor do hybrydyzacji	InDevR Inc.	MI-5004
Chipy kalibracyjne	InDevR Inc.	AP-5006
Bufory do płukania A-D	InDevR Inc.	MI-5005
ampliRED	InDevR Inc.	AP-5004
ampliTAG	InDevR Inc.	AP-5001
2x Bufor ampliTAG	InDevR Inc.	AP-5002
ampliPHY, wzmacniacz ampliPHY	InDevR Inc.	AP-5003