Detekcja kolorymetryczna ampliPHOX w mikromacierzy DNA w kierunku grypy

Podsumowanie

ampliPHOX technologia detekcji kolorymetrycznej jest przedstawiona jako tania alternatywa dla detekcji fluorescencji dla mikromacierzy. Opierając się na fotopolimeryzacji, ampliPHOX wytwarza stałe plamki polimerowe widoczne gołym okiem w ciągu zaledwie kilku minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, ale wydajnego pakietu oprogramowania.

Streszczenie

Mikromacierze DNA stały się potężnym narzędziem do wykrywania patogenów. ^1-5 Na przykład wykazano wiele przykładów zdolności do typowania i podtypowania wirusa grypy. ^6-11 Identyfikacja i podtypowanie grypy w mikromacierzach DNA ma zastosowanie zarówno w zdrowiu publicznym, jak i w klinice do wczesnego wykrywania, szybkiej interwencji i minimalizowania skutków pandemii grypy. Tradycyjna fluorescencja jest obecnie najczęściej stosowaną metodą detekcji mikromacierzy. Jednak wraz z postępem technologii mikromacierzy w kierunku zastosowania ^klinicznego1 zastąpienie drogiego oprzyrządowania tanią technologią wykrywania wykazującą podobne właściwości działania do fluorescencji sprawi, że testy mikromacierzy staną się bardziej atrakcyjne i opłacalne.

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przeznaczona do zastosowań badawczych i ma limit wykrywania w granicach jednego rzędu wielkości tradycyjnej fluorescencji¹¹, a główną zaletą jest około dziesięciokrotnie niższy koszt instrumentu w porównaniu do konfokalnych skanerów mikromatrycowych wymaganych do wykrywania mikromatryc fluorescencyjnych. Kolejną zaletą jest kompaktowy rozmiar instrumentu, który pozwala na przenośność i elastyczność, w przeciwieństwie do tradycyjnych instrumentów fluorescencyjnych. Ponieważ jednak technologia polimeryzacji nie jest z natury tak liniowa jak detekcja fluorescencyjna, najlepiej nadaje się do zastosowań mikromacierzy o mniejszej gęstości, w których pożądana jest odpowiedź tak/nie na obecność określonej sekwencji, na przykład w przypadku tablic wykrywania patogenów. Obecnie maksymalna gęstość plamki kompatybilna z detekcją ampliPHOX wynosi ̃1800 plamek/matrycę. Ze względu na ograniczenia gęstości plamki, mikromacierze o większej gęstości nie nadają się do detekcji ampliPOX.

Tutaj prezentujemy technologię detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jako metodę wzmacniania sygnału na mikromatrycy o niskiej gęstości, opracowaną do wykrywania i charakteryzacji wirusów grypy (FluChip). Chociaż protokół ten wykorzystuje FluChip (mikromacierz DNA) jako jedno z konkretnych zastosowań detekcji ampliPOX, każda mikromacierz zawierająca biotynylowany cel może być znakowana i wykrywana w podobny sposób. Za projekt mikromacierzy i biotynylację celu, który ma zostać przechwycony, odpowiada użytkownik. Po przechwyceniu biotynylowanego celu na matrycy, detekcję ampliPHOX można przeprowadzić, najpierw znakując matrycę koniugatem znakowanym streptawidyną (ampliTAG). Po wystawieniu na działanie światła za pomocą czytnika ampliPHOX polimeryzacja roztworu monomeru (ampliPHY) zachodzi tylko w regionach zawierających cele znakowane ampliTAG. Powstały polimer można następnie zabarwić nietoksycznym roztworem w celu poprawy kontrastu wizualnego, a następnie obrazować i analizować za pomocą prostego pakietu oprogramowania (ampliVIEW). Cały test FluChip od niewyekstrahowanej próbki do wyniku można przeprowadzić w ciągu około 6 godzin, a opisane powyżej etapy wykrywania ampliPHOX można wykonać w około 30 minut.

Protokół

1. Amplifikacja próbki za pomocą RT-PCR

1. Ekstrakcja wirusowego RNA z materiału klinicznego lub izolatu wirusa za pomocą zestawu Qiagen MinElute Virus Spin Kit w połączeniu z platformą automatycznej ekstrakcji kwasów nukleinowych QIAcube. Ekstrakcje przeprowadza się na próbce o objętości 200 μl z końcową objętością elucji wynoszącą 60 μl. Przechowuj ekstrakty w temperaturze -70°C lub niższej do późniejszego wykorzystania.
2. W strefie wolnej od szablonu przygotować główną mieszankę RT-PCR na lodzie zgodnie z protokołem producenta. Aby włączyć biotynę podczas RT-PCR, należy użyć biotynylowanej mieszaniny dNTP zamiast dostarczonej przez producenta mieszanki dNTP. Koszt użycia biotynylowanej mieszaniny dNTP wynosi mniej niż 1 USD/test. Można również zastosować alternatywne metody wprowadzania biotyny, takie jak użycie biotynylowanego podkładu. Dodać mieszanki podkładowe o końcowych stężeniach 1,0 μM dla grypy A, 1,0 μM dla grypy B i 0,14 μM dla kontroli wewnętrznej. Zestaw starterów Flu A amplifikuje segment genu macierzy (produkt 1032 nt), a zestaw starterów Flu B amplifikuje niestrukturalny segment genu (produkt 811 nt). Każdy zestaw starterów FluChip zawiera jeden starter z grupą fosforylową 5', aby ułatwić wytwarzanie jednoniciowego DNA poprzez trawienie enzymatyczne z egzonukleazą lambda po PCR. Otrzymany produkt jednoniciowy wymaga znacznie krótszych czasów hybrydyzacji niż jego dwuniciowy odpowiednik i znacznie skraca całkowity czas testu. Wstępnie przygotowana mieszanina tych starterów, jak również matryca RNA kontroli wewnętrznej, są dostępne w InDevR dla zainteresowanych badaczy w ograniczonym zakresie.
3. Krótko przemieszać i rozprowadzić 18 μl mieszanki wzorcowej w cienkościennych probówkach do PCR.
4. Przenieść probówki na lodzie do odpowiedniego obszaru roboczego w celu dodania próbki i dodać 2 μl szablonu do każdej probówki reakcyjnej.
5. Przenieś probówki PCR do termocyklera i uruchom następujący profil termiczny: odwrotna transkrypcja w temperaturze 50°C przez 30 minut, inaktywacja/aktywacja enzymu w temperaturze 95°C przez 15 minut, 40 cykli PCR w temperaturze 95°C przez 30 s, 55°C przez 30 s i 72°C przez 1 minutę i końcowe przedłużenie w temperaturze 72°C przez 10 minut.

2. Hybrydyzacja produktów RT-PCR do mikromacierzy o niskiej gęstości

1. Aby wygenerować jednoniciowy DNA do hybrydyzacji FluChip, należy przygotować mieszaninę trawienia enzymatycznego, łącząc 1,0 μl enzymu egzonukleazy lambda, 2,2 μl towarzyszącego buforu reakcyjnego i 0,8 μl wody wolnej od nukleaz. Ilości te dotyczą pojedynczej próbki, ale można je łatwo przeskalować w celu uzyskania całkowitej liczby próbek do wytrawienia. Pobrać próbki z termocyklera i dodać 4 μl przygotowanej mieszaniny do każdej reakcji w celu wytrawienia fosforylowanej nici produktu PCR. Zwróć próbki do termocyklera i zaprogramuj termocykler na 37 stopni Celsjusza na 15 minut, a następnie 95 stopni Celsjusza na 10 minut, aby zakończyć etapy trawienia enzymatycznego i fragmentacji cieplnej.
2. Zastosowane niestandardowe mikromatryce do grypy są drukowane na szkiełkach szklanych funkcjonalizowanych aldehydem przez Applied Microarrays Inc. (Tempe, AZ). Sekwencje wychwytywania zakończone 5'-aminami są łączone ze zoptymalizowanym buforem plamiającym i drukowane w końcowym stężeniu 20 μM (z wyjątkiem sekwencji kontroli pozytywnej, która dodatkowo ma modyfikację 3'-biotyny i jest wykrywana przy końcowym stężeniu 500 nM). Stosowana jest metoda bezkontaktowego nakrapiania, z optymalną średnicą plamki 300 μm i podziałką od środka do środka 700 μm.
3. Wyjmij mikromacierze z pudełka do przechowywania i nałóż jednorazowe studzienki hybrydyzacyjne wokół mikromacierzy, usuwając arkusz ochronny i mocno dociskając wokół obwodu studzienki.
4. Umieść szkiełka w pojemniku do mycia zawierającym 110 ml oczyszczonej wody na 5-minutowe mycie przed hybrydyzacją za pomocą wytrząsarki orbitalnej przy 60-90 obr./min. Osusz matrycę, delikatnie dotykając wycieraczką chusteczki do krawędzi studni i pozwalając wodzie odpłynąć.
5. Połącz 22 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego z każdym z rozdrobnionych produktów ssDNA i odpipetuj 40 μl roztworów hybrydyzacyjnych do studzienek mikromacierzy.
6. Pozostaw szkiełka do hybrydyzacji w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 60 minut.
7. Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, krótko przepłucz matryce buforem do płukania D w butelce do płukania przed włożeniem do stojaka na szkiełka. Zazwyczaj objętość płukania buforu do płukania D wynosi 2 ml na matrycę. Umieść stojak na szkiełka zawierające szkiełka w pojemniku na mycie zawierającym 110 ml buforu do mycia A. Umieść pojemnik na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 60-90 obr./min na 1 minutę.
8. Wyjmij ruszt szkiełkowy z buforu myjącego A, krótko spłucz buforem do mycia D, przenieś ruszt szkiełkowy do pojemnika zawierającego bufor do płukania B i wstrząsaj z prędkością 60-90 obr./min przez 5 minut.
9. Delikatnie osusz matrycę na każdym szkiełku i umieść wysuszone szkiełka w komorze wilgotnościowej, przygotowując się do etapów detekcji kolorymetrycznej ampliPOX.

3. ampliPHOX: etykietowanie hybrydowych produktów i chipów kalibracyjnych za pomocą ampliTAG

1. Połącz 10 μl ampliTAG, 20 μl 2x buforu ampliTAG i 10 μl oczyszczonej wody dla każdej matrycy, która ma być przetworzona. Objętości odczynników można łatwo skalować w celu uzyskania całkowitej liczby próbek. Upewnij się, że przygotowałeś wystarczającą ilość mieszaniny do etykietowania, aby uwzględnić wszystkie potrzebne matryce próbek i tablice kalibracyjne. Liczba potrzebnych chipów kalibracyjnych zależy od tego, czy wykonujesz pełną kalibrację (dla nowego urządzenia lub nowej partii odczynników), czy tylko kontrolę urządzenia. Aby uzyskać pełną kalibrację, należy oznaczyć 3 chipy kalibracyjne, a w celu sprawdzenia odczynnika należy oznaczyć tylko jeden chip kalibracyjny. Należy pamiętać, że zanim matryce kalibracyjne zostaną oznaczone, powinny przejść przez etap mycia przed hybrydyzacją, który został wcześniej opisany dla matryc przeciw grypie.
2. Przenieść 40 μl mieszaniny etykiet do każdej matrycy i pozostawić reakcję etykietowania do przebiegu w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez 5 minut.
3. Natychmiast przepłucz matryce buforem do mycia D w butelce do płukania przed umieszczeniem szkiełek w stojaku na szkiełka. Przenieś ruszt do pojemnika zawierającego 110 ml buforu do płukania C i wstrząsaj z prędkością 60-90 obr./min przez 5 minut.
4. Korzystając z drugiego pojemnika na mycie wypełnionego oczyszczoną wodą, wykonaj trzy kolejne krótkie zanurzenia w wodzie, aby usunąć pozostałości soli. Wysuszyć matryce, delikatnie dotykając wycieraczką chusteczki do krawędzi studzienek.
5. Mikromacierze są teraz prawidłowo oznaczone za pomocą ampliTAG, a pozostała część procedury wykrywania ampliPHOX może zostać wykonana. Fotoaktywacja i obrazowanie oznakowanych matryc powinny zostać zakończone w ciągu 24 godzin, a dodatkowe matryce można przechowywać w ciemnym pudełku na slajdy do czasu użycia.

4. ampliPHOX: kalibracja, wzmocnienie sygnału i obrazowanie

1. Włącz czytnik ampliPHOX i upewnij się, że oprogramowanie ampliVIEW jest gotowe do fotoaktywacji.
2. Określ optymalny czas fotoaktywacji za pomocą chipów kalibracyjnych. Oprócz krótkiego wprowadzenia, które następuje poniżej, procedura ta jest również szczegółowo opisana w ampInstrukcja obsługi ampliPHOX. Chipy kalibracyjne zawierają serię rozcieńczeń biotynylowanej sekwencji kontrolnej, które są wykorzystywane do optymalizacji czułości testu, w celu maksymalizacji liczby rzędów chipa kalibracyjnego, które wytwarzają sygnał dodatni określony przez oprogramowanie.
3. Usunąć ampliPHY z 4°C, pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej i krótko zwirować, aby wymieszać. Odpipetować 3 μl wzmacniacza ampliPHY do fiolki ampliPHY i dokładnie wirować przez 10 sekund.
4. Równomiernie przenieść 40 μl roztworu ampliPHY do studzienki mikromacierzy zawierającej matrycę znakowaną ampliTAG, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zamknąć fiolkę ampliPHY pomiędzy kolejnymi aplikacjami. Włóż szkiełko mikromacierzy do wnęki fotoaktywacyjnej czytnika ampliPHOX.
5. W przypadku pierwszej matrycy kalibracyjnej użyj domyślnego czasu fotoaktywacji w polu "Czas" w lewym panelu oprogramowania i kliknij zielony przycisk "Start", aby rozpocząć fotoaktywację. Po zakończeniu wyjmij matrycę i spłucz oczyszczoną wodą, aby usunąć nadmiar ampliPHY. Wyraźna formacja polimeru w niektórych miejscach powinna być teraz widoczna.
6. Pozostaw plamki polimerowe do wyschnięcia na 2 minuty, a następnie rozprowadź dwie krople ampliRED na matrycy i pozwól barwieniu postępować przez 2 minuty.
7. Następnie szybko spłucz mikromacierz oczyszczoną wodą i osusz chusteczką higieniczną.
8. Włóż mikromacierz do wnęki obrazowania czytnika ampliPHOX i kliknij przycisk 'Przechwyć nowy obraz' w zakładce Obrazowanie. Po zobrazowaniu dostosuj kadrowanie i zapisz obraz.
9. W zakładce Analiza wybierz maskę chipa kalibracyjnego i przycisk "Automatyczne umieszczanie", aby rozpocząć analizę. Oprogramowanie automatycznie utworzy "Rekord podsumowujący" pokazujący ilościowe wyniki. Na podstawie tych wyników czas fotoaktywacji jest dostosowywany o 10 sekund dla drugiej matrycy kalibracyjnej i procedura jest powtarzana.
10. Po określeniu optymalnego czasu fotoaktywacji, matryce próbek mogą być przetwarzane przy użyciu tego samego protokołu wzmacniania sygnału i obrazowania, który jest używany dla matryc kalibracyjnych.
11. Po przechwyceniu obrazu dla tablic próbek można utworzyć maskę dla konkretnego układu macierzy, takiego jak opisany tutaj układ tablicy grypy. Oprogramowanie ampliVIEW jest w stanie przeprowadzać automatyczną analizę obrazu i generować wyniki podtypów grypy dla każdej próbki.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schematyczna ilustracja metody detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX. (A) Biotynylowany docelowy DNA jest hybrydyzowany z każdym miejscem w macierzy i (B) znakowany za pomocą ampliTAG. (C) następnie dodaje się roztwór ampliPHY i (D) wystawia na działanie światła, aby utworzyć widoczne plamy polimerowe. (E) Powstałe plamy polimerowe są następnie barwione nietoksycznym barwnikiem w celu poprawy kontrastu.

Rysunek 2. (A) Układ mikromacierzy o niskiej gęstości grypy. Sekwencje 1-7 i 10-13 są ukierunkowane na grypę A, a sekwencje 8, 9 na grypę B. (B) obrazy fluorescencyjne ampliPHOX i (C) nowej próbki wirusa H1N1 ("świńskiej grypy") z 2009 r., wykazujące ten sam wzorzec wykrywania przy użyciu obu metod.

Rysunek 3. Od lewej do prawej, reprezentatywne obrazy ampliPHOX dla grypy A H3N2, H1N1 pochodzenia ludzkiego, nowej H1N1 z 2009 r. (pochodzenia świńskiego) i próbki ujemnej. Wszystkie 3 podtypy pokazują wizualnie odrębne wzorce na tablicy. Zauważ przecząco, że widoczna jest tylko wewnętrzna kontrola MS2, co wskazuje, że amplifikacja RT-PCR nie została zahamowana.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest szybką i niedrogą alternatywą dla detekcji fluorescencji jednokolorowej dla zastosowań mikromacierzy o mniejszej gęstości. Zasada detekcji, przedstawiona schematycznie na rysunku 1, opiera się na zastosowaniu znacznika fotoinicjatora (1B). W obecności roztworu zawierającego monomer (1C) ekspozycja na światło powoduje, że fotoinicjator (ampliTAG) wyzwala reakcję polimeryzacji tylko w znakowanych obszarach (1D). Chociaż zademonstrowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Qiagen MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704	pojedynczy 60 μ l elucja
QIAcube	Qiagen 9001292		opcjonalny
ABI 9800 Fast Thermal Cycler	Applied Biosystems	4441166
Zestaw Qiagen OneStep RT-PCR	Qiagen	210210	dNTP nie używany
2x Bufor do wykrywania	InDevR Inc.	MI-5007
Biotynylowana mieszanka dNTP	InDevR Inc.	MI-5009
Epicentrum egzonukleazy lambda	Biotechnologies	LE032K	2500 U, 10U/μ l
Mieszanka podkładowa FluChip	InDevR Inc.	Nie dotyczy	jeszcze niedostępne w sprzedaży
Wytrząsarka orbitalna	Madell Technology	ZD-9556-A
Pojemniki na myjki	InDevR Inc.	MI-4002
Stojaki do mycia	InDevR Inc.	MI-4003
2x Bufor hybrydyzacyjny	InDevR Inc.	MI-5004
	InDevR Inc.	AP-5006
myjące A-D	InDevR Inc.	MI-5005
ampliRED	InDevR Inc.	AP-5004
ampliTAG	InDevR Inc.	AP-5001
2x bufor ampliTAG	InDevR Inc.	AP-5002
ampliPHY, wzmacniacz ampliPHY	InDevR Inc.	AP-5003