Opisano metodę opartą na chemii klik, która umożliwia szybkie, nieinwazyjne i wiarygodne znakowanie glikanów z etykietą alkiniową w embrionach danio pręgowanego. W niniejszym badaniu obrazowano glikany fukozylowane w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego w późnej fazie gastrulacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie glikanów w embrionach danio pręgowanego za pomocą znakowania metabolicznego i bioortogonalnej chemii klik
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Obrazowanie glikanów in vivo stało się ostatnio możliwe dzięki zastosowaniu strategii bioortogonalnego reportera chemicznego poprzez traktowanie komórek lub organizmów monosacharydami znakowanymi azydami lub alkynami1, 2. Zmodyfikowane monosacharydy, przetwarzane przez aparat biosyntezy glikanów, są włączane do glikokonjugatów powierzchni komórkowej. Bioortogonalne znaczniki azydowe lub alkynowe umożliwiają następnie kowalencyjne sprzężenie z sondami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji lub z sondami powinowactwa w celu wzbogacenia i analizy glikoproteomicznej. Niniejszy protokół opisuje procedury typowo stosowane do nieinwazyjnego obrazowania glikanów fukozylowanych w embrionach danio pręgowanego, obejmujące: 1) mikroiniekcję embrionów w stadium jednej komórki GDP-5-alkinylfukozą (GDP-FucAl), 2) znakowanie glikanów fukozylowanych w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego fluoroforami sprzężonymi z azydami za pomocą biokompatybilnej cykloaddycji azydowo-alkinowej katalizowanej Cu(I) (CuAAC) oraz 3) obrazowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej3. Opisaną tutaj metodę można łatwo rozszerzyć na wizualizację innych klas glikanów, np. glikanów zawierających kwas sialowy4 i N-acetylogalaktozaminę5, 6, w rozwijających się zarodkach danio pręgowanego oraz w innych żywych organizmach.
Protokół
1. Zbieranie jaj i dechorionizacja
- Zebrań i przenieś jaja zebrafish do szalki Petriego o średnicy 35 mm, usuń jak największą ilość wody, a następnie dodaj 1 mg/ml Pronease E w medium embrionalnym E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2·2H2O, 0.33 mM MgSO4, pH = 7.4), aby strawić otoczkę chorionową.
- Po 3-5 minutach zanurz szalkę w zlewce wypełnionej wodą dla ryb (60 mg „instant Ocean” na litr destylowanej H2O), delikatnie przenieś jaja do zlewki i pozwól im „opaść” do wody.
- Przepłucz jaja wodą dla ryb trzykrotnie. Większość jaj zostanie uwolniona z otoczek.
- Za pomocą wypalonej szklanej pipety Pasteura przenieś odchorionowane jaja do pokrytych agarozą szalek Petriego wypełnionych medium embrionalnym E3.
2. Mikrowstrzykiwanie z użyciem GDP-FucAl
- Przygotować płytki do iniekcji zgodnie z opisanym protokołem7.
- Przenieść zdechorionowane jaja do płytek do iniekcji wypełnionych pożywką E3 dla embrionów.
- Przygotować igłę i pobrać do niej 2 μL roztworu do iniekcji. Roztwór ten zawiera 20 mM GDP-FucAl syntetyzowanego chemoenzymatycznie8 oraz albo dekstran Alexa Fluor 594 (5% w/v) jako znacznik, albo barwnik ładunkowy czerwień fenolowa (0.1% w/v) w 0.2 M KCl. W ramach kontroli negatywnej GDP-FucAl w roztworze do iniekcji należy zastąpić GDP-fukozą.
- Odłamać igłę i dostosować ciśnienie oraz czas iniekcji tak, aby uzyskać kroplę o objętości 1 nL9.
- Wstrzyknąć do jaj 1 nL wybranego roztworu.
- Przenieść jaja do powlekonych agarozą płytek Petri wypełnionych pożywką E3 dla embrionów.
- Inkubować jaja w temperaturze 28 °C i usunąć jaja niezapłodnione w ciągu trzech do czterech godzin po zapłodnieniu.
3. Reakcja chemii klik katalizowana BTTES-Cu(I)
- Gdy embriony osiągną pożądane stadia rozwojowe (np. późna gastrula, segmentacja tkanek i wczesna larva), pokryj dno płytki 96-dołkowej agarozą.
- Do każdego dołka dodaj 92 μL pożywki dla embrionów E3, a następnie 4 μL azotku Alexa Fluor-488 (z roztworu stokowego 2,5 mM w H2O) oraz 2 μL kompleksu BTTES-CuSO4 w stosunku 6:1, a następnie delikatnie wymieszaj.
- Przenieś embriony do dołka zawierającego odczynnik do chemii klik (click chemistry), używając wypalonej szklanej pipety Pasteura. Każdy dołek powinien zawierać mniej niż pięć embrionów.
- Dodaj 2,5 μL świeżo przygotowanego askorbianu sodu (z roztworu stokowego 100 mM w H2O), aby zainicjować reakcję klik3. Końcowe stężenie każdego odczynnika: azotek Alexa Fluor-488: 100 μM; CuSO4: 50 μM; BTTES: 300 μM; askorbian sodu: 2,5 mM.
- Po 3 min dodaj 2 μL sulfonianu batokuproiny (roztwór stokowy 50 mM w H2O), który jest biokompatybilnym chelatorem miedzi, aby zatrzymać reakcję, a następnie natychmiast rozcieńcz całość 100 μL pożywki dla embrionów E3.
- Przenieś embriony do szklanej szalki Petriego i przemyj potraktowane embriony 2 razy 15 mL pożywki dla embrionów E3.
4. Obrazowanie
- Nanieś kroplę agarozy o bardzo niskiej temperaturze topnienia (1,2% (w/v) w podłożu dla embrionów E3) na szklaną płytkę z mikrosodkami MatTek i umieść w kropli agarozy embrion.
- Ustaw embriony grzbietowo lub bocznie, a następnie pozostaw płytkę na lodzie przez 5 min, aby kropla agarozy stężała. Ostrożnie dolej do płytki podłoże dla embrionów E3, aż całkowicie przykryje kroplę agarozy.
- Obrazy fluorescencyjne i w jasnym polu są pozyskiwane sekwencyjnie przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wszystkie obrazy embrionów są pozyskiwane z interwałem kroków 5 μm. Ryciny kompozytowe są przygotowywane przy użyciu oprogramowania ImageJ.
5. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia schemat naszej dwuetapowej strategii znakowania. Rysunek 2 ukazuje znakowanie zarodków rybek daniowatego za pomocą reakcji CuAAC wspomaganej przez BTTES w 9,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). BTTES jest ligandem opartym na tris(triazolylometylo)aminie. Przyspiesza on gwałtownie reakcję CuAAC podczas koordynacji z generowanym in situ Cu(I) i promuje szybkie zachodzenie reakcji cykloaddycji w żywych systemach bez widocznej toksyczności. Bezpośrednio po 3-minutowej reakcji klik wykrywamy wyraźne znakowanie zarodków traktowanych GDP-FucAl (Rysunek 2, panele lewe). W przypadku zarodków kontrolnych, którym wstrzyknięto mikroigłą GDP-fukozę, wykrywana jest jedynie fluorescencja tła (Rysunek 2, panele prawe).
Rysunek 1.Strategia znakowania glikanów fukozylowanych w warstwie otaczającej embriony danio pręgowanego.
Rysunek 2. Obrazowanie in vivo fukozylowanych glikanów podczas embriogenezy danio pręgowanego za pomocą chemii klik prowadzonej w katalizie BTTES-Cu(I). Zarodki danio pręgowanego w stadium jednej komórki poddano mikroiniekcji pojedynczą dawką GDP-FucAl i inkubowano do 9,5 hpf. Następnie zarodki poddano reakcji z azydkiem Alexa Fluor 488 w obecności katalizatora BTTES-Cu(I). Obrazowanie zareagowanych zarodków wykonano przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obrazy z maksymalną projekcją intensywności w osi z dla fluorescencji Alexa Fluor 488 (panel górny); pole jasne (panel dolny). Pasek skali: 100 μm.
Rozwiązywanie problemów
| Problem | Przyczyna | Środek zaradczy |
| Zarodki wyglądają na niezdrowe | Roztwór wstrzykiwany mikroiniekcyjnie zawiera zanieczyszczenia | Czystość cukrów nukleotydowych powinna wynosić powyżej 85%. Sprawdź źródło. |
| Po reakcji nie stwierdzono znakowania | Stężenie miedzi jest poniżej 30 μM | Należy uważać, aby nie rozcieńczyć roztworu reakcyjnego poprzez dodanie nadmiernej ilości medium do zarodków E3 podczas wprowadzania zarodków, ponieważ szybkość reakcji znacznie spada, gdy stężenie miedzi jest poniżej 30 μM. |
| Zarodki giną po reakcji | Nieprawidłowa obsługa embrionów | Należy upewnić się, że pipeta została wypalona, a naczynie reakcyjne pokryto bardzo cienką warstwą 0,5% agarozy. |
| Obrazy są ziarniste | Odczynniki nie zostały odpowiednio wymieszane przed dodaniem embrionów | Należy przestrzegać zalecanej kolejności dodawania odczynników i upewnić się, że odczynniki do chemii klikalnej zostały odpowiednio wymieszane przed dodaniem zarodków. |
| Obrazy wykazują, że zarodki są uszkodzone | Intensywne wstrząsanie uszkadza zarodki podczas reakcji | Po umieszczeniu zarodków w roztworze delikatnie wstrząśnij przez mniej niż 10 sekund. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obrazowanie biomolekuł in vivo dostarcza kluczowych informacji na temat ich aktywności biologicznej w naturalnym środowisku. W niniejszym filmie demonstrujemy, w jaki sposób znakowanie fukozylowanych glikanów w warstwie osłony embrionów danio pręgowanego realizowane jest poprzez mikroiniekcję embrionów w stadium jednego komórki GDP-FucAl oraz drugi etap koniugacji z fluoroforem za pomocą biokompatybilnej reakcji CuAAC3 pośredniczonej przez BTTES. Skuteczne znakowanie można osiągnąć w ciągu 2-3 minut,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była częściowo finansowana przez National Institutes of Health (GM093282 dla P.W.; 3U54AI057158-06S1 dla R.D.S.) oraz ze środków startowych z Albert Einstein College of Medicine.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Siarczan(II) miedzi(II) pięciowodny | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Azydek Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A10266 | |
| dekstran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-L-askorbinian sodu | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Kwas batokuproinedisulfonowy | Acros Organics | 164060010 | |
| Szklana płytka z mikrodoodkami | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
Bibliografia
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
