Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.
Artykuł metodologiczny
Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do osiągnięcia jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najskuteczniejszą jest mikrotomografia komputerowa (μCT).
Mikrotomografia komputerowa (μCT) o wysokiej rozdzielczości jest niezwykle wszechstronną i dokładną (rozdzielczość 1-2 mikronów) techniką trójwymiarowej analizy biologicznych próbek ex-vivo1, 2. W przeciwieństwie do tomografii elektronowej, μCT umożliwia badanie próbek o grubości do 4 cm. Technika ta wymaga zaledwie kilku godzin pomiaru, w porównaniu do wielu tygodni w przypadku histologii. Ponadto μCT nie opiera się na dwuwymiarowych modelach stereologicznych, dzięki czemu może uzupełniać, a w niektórych przypadkach nawet zastępować metody histologiczne3, 4, które są czasochłonne i niszczące. Przygotowanie i pozycjonowanie próbek w μCT jest proste i nie wymaga wysokiej próżni ani niskich temperatur, które mogłyby niekorzystnie wpłynąć na strukturę. Próbka jest ustawiana i obracana o 180° lub 360° pomiędzy mikroogniskowym źródłem promieni rentgenowskich a detektorem, który składa się z syntylatora i precyzyjnej kamery CCD. Dla każdego kąta wykonuje się obraz 2D, a następnie cała objętość jest rekonstruowana przy użyciu jednego z dostępnych algorytmów5-7. Rozdzielczość 3D wzrasta wraz ze zmniejszeniem kroku obrotu. Przedstawiony protokół wideo ukazuje główne etapy przygotowania, unieruchomienia i pozycjonowania próbki, a następnie obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.
Protokół
1. Przygotowanie próbki
- Po wyekstrahowaniu tkanek przeznaczonych do badania, tkanki zmineralizowane można umieścić w urządzeniu i poddać obrazowaniu. Aby obrazować kość udową myszy, należy wykonać następujące kroki:
- Usunąć po śmierci kończynę z embrionu C57/Bl6 w 18,5 dniu po zapłodnieniu (E18.5).
- Uszczelnić wąski koniec polistyrenowego końcówki pipety (20-200 μl) za pomocą żywicy epoksydowej lub innego kleju, a następnie napełnić końcówkę buforem roboczym (PBS lub innym).
- Szczelnie umieścić kończynę w końcówce i zamknąć drugi koniec arkuszem parafilmu.
- Umieścić końcówkę pipety w odpowiednim uchwycie i postępować zgodnie z protokołem z rozdziału 3. Do wizualizacji kości udowej z kończyny embrionu myszy instrument ustawia się na 40 KV i 200 μA. Aby uzyskać rozdzielczość 8μ, należy zebrać 1000 obrazów projekcyjnych przy 4-krotnym powiększeniu.
- Tkanki niezmineralizowane muszą zostać wstępnie utrwalone i zabarwione w celu zwiększenia tłumienia promieni rentgenowskich badanej tkanki, wykorzystując jeden z wielu dostępnych protokołów8,9. Dla płuc szczura i podobnych próbek protokół przygotowania jest następujący:
- Ortotopowa implantacja niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) NCI-H460 do płuc szczura nude
- Guzki raka płuca stają się wykrywalne 4 tygodnie po implantacji
- Uśmiercić szczura i natychmiast przeprowadzić infuzję z roztworu soli fizjologicznej zmieszanej z heparyną
- Wstrzyknąć rozcieńczony roztwór Microfil (Flowtech) (2 ml roztworu związku, 3 ml rozcieńczalnika i 0.3 ml utwardzacza) do lewej komory w celu zabarwienia krążenia oskrzelowego
- Wyekstrahować płuca i serce szczura
- Unieruchomić próbkę (patrz rozdział 2 protokołu), umieszczając ją ściśle w plastikowej probówce o pojemności 50 ml
- Stworzyć nasyconą atmosferę etanolu, umieszczając na dnie probówki tkaninę nasączoną etanolem
- Przykleić lub przykręcić probówkę w uchwycie urządzenia
- Przejść do ustawiania parametrów obrazowania (rozdział 3). Do pełnego obrazowania płuc szczura źródło ustawia się na 40KV i 100 μA. W celu osiągnięcia rozdzielczości 16μ należy zebrać 2500 obrazów projekcyjnych przy powiększeniu 0.5x.
2. Immobilizacja próbki
Przy wysokiej rozdzielczości ważne jest, aby uniknąć jakichkolwiek zmian w położeniu próbki podczas pomiaru. W tym celu próbkę mocno utrwalono w plastikowym uchwycie dopasowanym do jej rozmiaru. W tym celu stosuje się polistyrenowe końcówki do pipet, plastikowe pipety Pasteura lub specjalnie wykonane plastikowe uchwyty. W zależności od wymagań doświadczalnych próbkę można badać w powietrzu lub zanurzyć w etanolu bądź roztworach buforowych. Typową immobilizację i ostateczne pozycjonowanie kończyny zarodka myszy w urządzeniu przedstawiono na Rys. 1.
Rycina 1. Końcowe ustawienie kończyny zarodka myszy w urządzeniu do mikro-CT.
3. Ustawianie parametrów akwizycji: napięcie i natężenie prądu promieni X, czas ekspozycji CCD
- Próbkę umieszczoną w uchwycie wprowadza się do stopnia obrotowego instrumentu.
- Wykonuje się pierwszy obraz rentgenowski przy dowolnie ustawionym napięciu i natężeniu prądu.
- Jeśli obraz jest zbyt ciemny, należy w pierwszej kolejności zwiększyć liczbę fotonów, czyli nieco zwiększyć natężenie prądu. Jeśli to nie wystarczy, należy nieznacznie zwiększyć energię fotonów rentgenowskich, tj. napięcie na lampie rentgenowskiej.
- Jeśli obraz jest zbyt jasny, należy najpierw zmniejszyć napięcie, a następnie natężenie prądu.
- Jasność obrazu można zwiększyć poprzez binning. Binning równy 1 uwzględnia intensywność każdego piksela w obrazie, natomiast binning równy 2 sumuje wartości z każdej macierzy 2x2 pikseli. Obraz będzie wtedy około 4 razy jaśniejszy niż w przypadku binningu 1, ale będzie miał połowę rozdzielczości.
- Po ustawieniu optymalnej jasności należy zoptymalizować czas ekspozycji kamery, aby osiągnąć kompromis pomiędzy jak najlepszym kontrastem a rozsądnym czasem trwania eksperymentu.
- Kontrast obrazów, zwłaszcza w przypadku próbek o niskiej absorpcji, można poprawić stosując filtry, które redukują strumień fotonów, głównie tych o niższej energii.
4. Pozycjonowanie próbki
- Wybierz powiększenie robocze. Możliwe opcje to 0.5x, 4x, 10x, 20x oraz 40x. Pole widzenia zmniejsza się wraz ze wzrostem powiększenia.
- Uzyskaj optymalną rozdzielczość i pole widzenia, ustawiając odległości między źródłem promieniowania rentgenowskiego a próbką oraz między próbką a detektorem. Zwiększenie odległości od źródła do próbki zmniejsza pole widzenia i zwiększa rozdzielczość. Odległość od próbki do detektora ma przeciwny efekt.
Cały obszar, który ma być widoczny w 3D, powinien znajdować się w obrazie projekcyjnym pod wszystkimi kątami. Należy to sprawdzić, obracając próbkę pod różnymi kątami i zbliżając ją jak najbliżej osi obrotu. W tym celu należy wykonać następujące kroki:
- Wykonaj obraz przy 0 deg, a następnie obróć próbkę o -20 deg. Jeśli pożądana objętość przesunęła się bocznie, należy skorygować jej pozycję poprzez zmianę położenia osi obrotu.
- Po korekcie należy obrócić próbkę pod innym kątem i ponownie skorygować pozycję, aż obszar zainteresowania znajdzie się w polu widzenia obrazu przy wszystkich kątach od -90 do 90 deg.
5. Tomogram o wysokiej rozdzielczości
- Podczas pomiaru próbka jest obracana o mały kąt w każdym kroku, a dla każdego kąta rejestrowany jest jeden obraz projekcyjny. Całkowita liczba obrazów jest zawsze kompromisem między pożądaną rozdzielczością z jednej strony a czasem pomiaru i rozmiarem pliku z drugiej. Jak pokazano na Rys. 2, każda pojedyncza projekcja obejmuje wszystkie przekroje próbki nałożone jeden na drugi, w związku z czym nie może ona ujawnić struktury 3D próbki.
Rysunek 2. Obrazy projekcyjne płuca szczura przy kącie obrotu 0° (A), 45° (B) i 90° (C).
- Dopiero po wykonaniu obrazów projekcyjnych w zakresie co najmniej od -90 do 90 deg, można przystąpić do rekonstrukcji objętości próbki. Rekonstrukcja trwa od 10 min do 2 h, w zależności od użytego oprogramowania oraz liczby projekcji. Ponownie, końcowa jakość obrazu 3D stanowi kompromis między pożądaną rozdzielczością, czasem poświęconym na proces a rozmiarem wynikowego pliku.
6. Kalibracja skali obrazu
Poziom (wartość) piksela w zrekonstruowanym obrazie jest unikalny dla tego obrazu. Aby porównać dwa różne obrazy, na każdy z nich należy nałożyć jednolitą skalę intensywności. W tym celu
- Przeprowadź tomografię z zastosowaniem standardowego fantoma, używając tych samych warunków eksperymentalnych co w przypadku próbki
- Przeprowadź rekalibrację obrazu próbki, wykorzystując wartości uzyskane dla fantoma. Najczęściej stosowaną skalą jest skala Hounsfielda (lub skala CT). Dla powiększenia 4x wartość tła wynosząca 15 000 (dla wody lub PBS) została zastąpiona wartością 0, a maksymalna wartość 35 000 dla kości została zastąpiona standardową wartością Hounsfielda wynoszącą 3000. Pozostałe wartości pikseli uzyskano poprzez interpolację liniową lub ekstrapolację w oparciu o te granice.
7. Przetwarzanie i analiza obrazu
Po uzyskaniu obrazów o wysokiej rozdzielczości należy wyodrębnić istotne informacje przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu. Wykorzystany pakiet oprogramowania musi być przystosowany do pracy z bardzo dużymi plikami (do 20Gb).
8. Reprezentatywne wyniki
Na Rys. 3 przedstawiono reprezentację kości udowej myszy C57/Bl6 w 18,5 dniu embrionalnym (E18.5) – cztery dni po rozpoczęciu procesu mineralizacji. Warstwy mineralne są wyraźnie widoczne (kolor biały), natomiast tkanki miękkie nie są widoczne w tym preparacie. Wykonano 1000 obrazów projekcyjnych przy powiększeniu liniowym 4x. Rozdzielczość końcowa wynosi 8 mikronów. Dokładna analiza renderowania objętościowego przedstawionego na Rys. 1 wykazuje, że frakcja objętości kości (część objętości kości zajęta przez tkankę zmineralizowaną) wynosi 0,18, a gęstość mineralna kości to 723 mg/cm3. Wartości te pozwalają na porównanie tej struktury z kośćmi na innych etapach rozwoju.
Rysunek 3. Różne reprezentacje obrazu 3D zarodka kości udowej myszy. Przedstawiono przekrój poprzeczny (A), przekrój strzałkowy (środkowo-boczny) (B) oraz zrzut ekranu z renderowania objętościowego (C).
Rycina 4 przedstawia obraz 3D płuc samicy szczura nago (RNU) w wieku 12 tygodni, u której ortotopowo zaimplantowano niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) NCI-H460. Wykonano 2500 obrazów projekcyjnych przy powiększeniu liniowym 0,5x, co zapewniło końcową rozdzielczość 16 mikronów. Obraz ukazuje naczynia krwionośne zabarwione Microfil (o średnicy do 20 mikronów). Analiza obrazu wykazuje, że 4 tygodnie po implantacji utworzyło się wiele guzków nowotworowych. Zajmują one znaczną część objętości płuc (17%). Większość zabarwienia płucnego stwierdzono w obszarach obwodowych guzów. Co istotne, jak pokazano na ryc. 4B, wewnątrz guzków obecnych jest również kilka naczyń krwionośnych, które według wstępnej analizy zajmują około 3% ich objętości.
Rycina 4. Obraz 3D guzków nowotworowych rosnących w płucu szczura. Przedstawiono migawkę z renderowania objętościowego (A) oraz przekrój przez objętość (B). Guzki nowotworowe zaznaczono strzałkami.
Film 1. Renderowanie objętościowe kości udowej myszy przedstawionej na rysunku 1. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Film 2. Rendering objętościowy płuc szczura przedstawionych na Rysunku 2. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Film 3. Przekroje seryjne przez płuca. Guzki widoczne są jako szare obszary w większości warstw. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Dyskusja
Mysz C57/Bl6 w 18,5 dniu embrionalnym (E18.5) znajduje się w czwartym dniu po rozpoczęciu procesu mineralizacji. Na tym etapie rozwoju przyszła kość składa się z wielu warstw zmineralizowanych osteoidów, co wyraźnie widać na Rys. 3. W tym miejscu należy podkreślić, że tkanki zmineralizowane można obrazować z niższą rozdzielczością za pomocą innych instrumentów, które wymagają mniejszego przygotowania próbki. Niniejszy protokół (oraz użyty w nim mikrotomograf komputerowy) poza zapewnieniem wyższej rozdzielczości, oferuje użytkownikowi największą elastyczność w wyborze optymalnych parametrów geometrycznych pomiaru.
Wyniki przedstawione na Ryc. 4 wskazują, że w ortotopowych modelach zwierzęcych raka płuca, ludzki niedrobnokomórkowy rak płuca może indukować rekrutację naczyń krwionośnych i neowaskularyzację. Przyjmujemy, że tkanka płucna nie przemieściła się ani nie zmieniła kształtu podczas pomiaru. Użytkownik powinien zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć takich zmian podczas tomografii. W przypadku niektórych próbek, zwłaszcza w odniesieniu do tkanek miękkich, konieczne jest zbudowanie specjalnych urządzeń mocujących, które idealnie unieruchomią próbkę podczas pomiaru. Niestety, występowanie znacznych wycieków środka kontrastowego w otoczeniu guzów uniemożliwiło wiarygodną kwantyfikację obwodowych naczyń krwionośnych. W rezultacie obrazy są zabrudzone środkiem barwiącym, szczególnie na krawędziach, co jest wyraźnie widoczne w filmach 2 i 3. Nie udało nam się zapobiec temu wyciekowi, jednak użyteczne informacje o guzkach nowotworowych, w tym ich rozmiarze, kształcie i obecności wewnętrznych naczyń krwionośnych, nie zostały naruszone. Mogliśmy jednoznacznie stwierdzić, że co najmniej w przypadku badanego tutaj krążenia oskrzelowego, obwodowe ukrwienie bierze udział w perfuzji guza, przy czym pewna perfuzja występuje również wewnątrz nowotworu.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania zostały przeprowadzone w Irving and Cherna Moskowitz Center for Nano and Bio-Nano Imaging w Instytucie Nauki Weizmanna.
Jesteśmy wdzięczni Ornie Yeger za pomoc w opracowaniu i przeprowadzeniu tego protokołu.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Do akwizycji obrazów wykorzystano mikroogniskowy system tomografii rentgenowskiej MICRO XCT-400 firmy Xradia, Concord, USA. | |||
| Obrazy przetwarzano i analizowano przy użyciu pakietów oprogramowania ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, Francja) oraz MicroView (General Electric, USA). Zamiast nich można zastosować dowolne dostępne oprogramowanie do analizy obrazu. |
Bibliografia
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50, 2-13 (2010).
- Bauer, J. S., Link, T. M. Advances in osteoporosis imaging. Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).
- Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23, 59-66 (1998).
- Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods. IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).
- Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT. Med Phys. 27, 754-772 (2000).
- Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT. Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).
- Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med Phys. 31, 305-313 (2004).
- Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. X-ray high-resolution vascular network imaging. J Microsc. 215, 139-148 (2004).
Przedruki i uprawnienia
