Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i oprzyrządowanego płuca myszy ukrwionego z przepływem pulsacyjnym

Podsumowanie

Poniższy protokół opisuje proces izolacji, wentylacji i instrumentowania płuc myszy do pomiaru stałych lub pulsacyjnych zależności ciśnienie naczyniowe płuc - przepływ w celu ilościowego określenia wpływu przepływu krwi, przepływu powietrza, zmian w drogach oddechowych i zmian naczyniowych na obciążenie następcze prawej komory.

Streszczenie

Izolowany, wentylowany i oprzyrządowany preparat płuc myszy pozwala na pomiar stałych i pulsacyjnych zależności między ciśnieniem a przepływem w naczyniach płucnych z niezależną kontrolą natężenia przepływu w tętnicy płucnej, przebiegu przepływu, ciśnienia w drogach oddechowych i ciśnienia w lewym przedsionku. Opór naczyniowy płuc oblicza się na podstawie wielopunktowych, stałych krzywych ciśnienie-przepływ; Impedancja naczyniowa płuc jest obliczana na podstawie pulsacyjnych krzywych ciśnienie-przepływ uzyskanych w zakresie częstotliwości. Jak obecnie stwierdzono klinicznie, impedancja jest lepszą miarą obciążenia następczego prawej komory niż oporności, ponieważ obejmuje efekty podatności naczyniowej, które nie są bez znaczenia, zwłaszcza w krążeniu płucnym. Trzy ważne wskaźniki impedancji - impedancja zerowa herców Z₀, impedancja charakterystyczna Z_C i wskaźnik odbicia fali R_W - zapewniają wgląd w dystalną powierzchnię przekroju tętniczego dostępną odpowiednio dla przepływu, proksymalnej sztywności tętnicy i niedopasowania impedancji up-downstream. Wszystkie wyniki uzyskane w izolowanych, wentylowanych i perfundowanych płucach są niezależne od tonu współczulnego układu nerwowego, stanu objętości i efektów znieczulenia. Użyliśmy tej techniki do ilościowego określenia wpływu zatorowości płucnej i przewlekłego niedotlenienia na oporność i impedancję oraz do rozróżnienia miejsc działania (tj. Proksymalnych i dystalnych) środków wazoaktywnych i choroby przy użyciu zależności od ciśnienia Z_C. Ponadto, gdy techniki te są stosowane w płucach genetycznie modyfikowanych szczepów myszy, można określić wpływ defektów na poziomie molekularnym na strukturę i funkcję naczyń płucnych.

Protokół

W tym protokole demonstrujemy izolowany, wentylowany, perfundowany preparat płuc myszy, który wcześniej był używany do ilościowego określenia wpływu zatorowości płucnej i przewlekłego niedotlenienia na zależności pulsacyjne ciśnienie naczyniowe płuc - przepływ (Tuchscherer, Webster, & Chesler, 2006; Tuchscherer i wsp., 2007). Krótko mówiąc, płuca myszy są chirurgicznie izolowane od otaczających tkanek, umieszczane w ogrzewanej komorze (IL-1; Harvard Apparatus, Holliston, MA) i wentylowane (Moduł Sterowania Wentylacją (VCM)-R z modułem licznika czasowego (TCM); Aparatura Harvarda). Układ naczyniowy płuc jest perfundowany za pomocą podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640 z 3,5% Ficoll za pomocą pompy strzykawkowej (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) w celu wygenerowania fal o stałym przepływie lub pompy oscylacyjnej wysokiej częstotliwości (Bose -Electro Force, Eden Prairie, MN) równolegle z pompą strzykawkową w celu wytworzenia pulsacyjnych fal przepływu naczyń płucnych. Przetworniki ciśnienia (P75, Harvard Apparatus) mierzą chwilowe ciśnienie w tętnicy płucnej (PAP) i ciśnienie w lewym przedsionku (LAP). Chwilowe natężenie przepływu (Q) jest mierzone za pomocą przepływomierza in-line (Transonic Systems, Inc., Ithaca, NY). Na podstawie tych pomiarów wyprowadzono zależności pulsacyjnego ciśnienia i przepływu, które zapewniają wgląd w fizjologię i patologię naczyń płucnych oraz obciążenie następcze prawej komory.

1. Wyposażenie:

1. Izolowany układ płuc z respiratorem dla myszy
2. System akwizycji danych i komputer z programem LabView
3. Dwa przetworniki ciśnienia i przepływomierz do przepływu perfuzatu
4. Przetwornik ciśnienia i przepływomierz (pnemotachometr) do pomiaru przepływu dróg oddechowych
5. Pompa oscylacyjna wysokiej częstotliwości i komputer z programem Win Test
6. Mikroskop wysięgnikowy/zmiennoogniskowy, lampa
7. Łaźnia grzewcza z pompą o dużej wydajności dla systemu IL-1

2. Przygotowanie systemu IL-1

1. Woda destylowana podgrzana do temperatury 37°C przez łaźnię grzewczą krąży do wnętrza systemu IL-1.
2. Wszystkie pompy, przetworniki i kaniula IL-1 są połączone czystymi rurkami, a wszystkie rurki są przepłukiwane wodą destylowaną podgrzaną do 37°C. Pęcherzyki powietrza, które mogłyby przedostać się do płuc i spowodować obrzęk, muszą zostać usunięte. Przewody od pompy przepływu oscylacyjnego do czujnika przepływu i od czujnika przepływu do kaniuli tętnicy płucnej są przepłukiwane 1% PBS.
3. Przetworniki ciśnienia P75 są zerowane poprzez zamknięcie zaworu do kaniuli, otwarcie zaworów do atmosfery, a następnie naciśnięcie przycisku automatycznego zerowania na wzmacniaczu PLUGSYS. Następnie zamyka się zawór do atmosfery i otwiera się zawór do kaniuli.
4. Ceramiczny porowaty element w ścieżce wentylacyjnej systemu IL-1 jest zwilżany w celu zapewnienia wilgoci.

3. Rozwiązania

1. Przygotować 3,5% objętościowo roztwór Ficoll-RPMI i sterylnie przefiltrować media. Filtrowanie pożywki zapewnia, że nie ma dużych cząstek, które mogłyby przypadkowo zatorizować płuca. Stosowanie sterylnych pożywek zmniejsza również prawdopodobieństwo wystąpienia nagłego obrzęku płuc. Napełnij jedną strzykawkę o pojemności 10 ml RPMI do zabiegu chirurgicznego i jedną strzykawkę o pojemności 60 ml z RPMI dla każdej próby eksperymentalnej. Podgrzać perfuzat w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Przygotuj 1 ml heparyny 500 j.m./100 g masy ciała myszy (w przybliżeniu). Sól heparyny wynosi 158 j.m./mg. W przypadku myszy o wadze ~25 g wymieszaj 1,25 mg soli heparyny z 1 ml roztworu PBS w małej probówce do mikrowirówki.

4. Wentylacja myszy

1. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu 150 mg pentobarbitalu w roztworze na kilogram myszy, należy zapewnić głębokie znieczulenie, wykonując mocne uszczypnięcie w łapę. Jeśli nie ma reakcji, przygotuj mysz do operacji, przypinając jej przednie łapy do tablicy korkowej, aby zapewnić stabilność. Uwaga: Przez cały czas trwania eksperymentu głębokość znieczulenia jest monitorowana poprzez uważną obserwację zwierzęcia. Szpilki w łapach i częste nacięcia działają jak szkodliwe bodźce, na które brak reakcji potwierdza, że zwierzę pozostaje w chirurgicznej płaszczyźnie znieczulenia.
2. Spryskaj klatkę piersiową 95% alkoholem, aby zwilżyć sierść i użyj prostych kleszczy, aby chwycić skórę przy szyi. Wytnij 1 cm otwór w skórze za pomocą prostych nożyczek.
3. Po odsłonięciu wnętrza szyi usuń całą białą tkankę gruczołową i mięśnie powierzchowne, szukając przełyku i tchawicy. Odizoluj przełyk i tchawicę od tkanki po obu stronach i z tyłu.
4. Włóż małe zgięte kleszcze pod tchawicę i chwyć kawałek szwu po drugiej stronie. Przeciągnij szew pod tchawicą i zawiąż luźny węzeł chirurgski. Nie zaciskaj szwu ani nie zawiązuj węzła.
5. Wytnij małą kątową literę "v" w tchawicy małymi nożyczkami; nie przecinaj jej do końca. Przenieś tablicę korkową i mysz do podgrzewanego systemu IL-1. Za pomocą dwóch kleszczy chwyć kaniulę tchawicy i tchawicę poniżej "v". Następnie wsuń kaniulę tchawicy do tchawicy przez otwór w kształcie litery "v". Zaciśnij szew wokół tchawicy i kaniuli tchawicy, aby zabezpieczyć kaniulę wewnątrz tchawicy. Zawiąż węzeł.
6. Rozpocznij wentylację (50% wdechu, 90 oddechów/min, z głębokim wdechem) powietrzem z pomieszczenia.

5. Używanie wentylowanej myszy

5.1. Uzyskaj dostęp do prawej komory, aby wstrzyknąć heparynę

1. Ponownie spryskaj klatkę piersiową myszy alkoholem, aby ponownie zwilżyć futro. Usuń całą skórę na klatce piersiowej nad żebrami za pomocą prostych kleszczy i prostych nożyczek. Przeciąć w górę wzdłuż mostka. Podnieś skórę z każdej strony, a następnie przetnij skórę zgodnie z linią dolnych żeber.
2. Chwyć pęsetą wyrostek mieczykowaty na dnie mostka i wytnij otwór w przeponie za pomocą prostych nożyczek. Chwyć membranę pęsetą i odetnij ją od żeber.
3. Ponownie chwyć wyrostek mieczykowaty pęsetą (lewa ręka) i użyj nożyczek z końcówką kulkową, kątowymi, aby przeciąć mostek i żebra, uważając, aby nie przeciąć płuc, serca lub naczyń krwionośnych (użyj końcówki kulki na nożyczkach, aby cię poprowadzić). Będzie krew, ale tak długo, jak krawędź tnąca nożyczek będzie przylegać do mostka, serce i płuca nie zostaną przecięte.
4. Chwyć żebra po lewej stronie i odetnij tyle żeber, ile to konieczne, aby odsłonić serce. Powoli wstrzyknąć do prawej komory 0,1 ml roztworu heparyny. Ten krok jest ważny, aby zapobiec zakrzepom krwi w płucach, które uszkadzają komórki śródbłonka i upośledzają perfuzję. Heparynę należy wstrzykiwać, gdy serce jeszcze bije.

5.2. Kantonacja głównej tętnicy płucnej

1. Odetnij resztę żeber (lewą i prawą stronę) za pomocą tylnego (zaokrąglonego) końca kleszczy, aby delikatnie odepchnąć płuca od ściany żeber. Złapanie samych płuc uszkodzi delikatną tkankę. Przypadkowy kontakt końcówek nożyczek z tkanką płucną również spowoduje uszkodzenie.
2. Przesuń mikroskop na miejsce nad płucem. Odetnij tkankę gruczołową i tłuszczową na górze serca. Użyj pęsety, aby odciągnąć go od tętnic i żył, a następnie przetnij nożyczkami sprężynowymi, gdy tkanka jest napięta.
3. Używając innego zestawu pęsety, nabierz od prawej do lewej od góry serca pod lewym przedsionkiem/komorą, aby umieścić końcówkę pęsety pod aortą i tętnicą płucną (PA). Zrób to ostrożnie - pęseta nie powinna stawiać oporu. Używanie pęsety zmniejsza prawdopodobieństwo przypadkowego przebicia tętnicy płucnej lub aorty.
4. Gdy końcówka pęsety znajdzie się pod aortą i PA, chwyć kawałek szwu i przeciągnij. Zawiąż luźny węzeł chirurgski. Nie zaciskaj szwu ani nie zawiązuj węzła.
5. Opcjonalnie: użyj skośnych nożyczek, aby usunąć dolną połowę ciała. Przeciąć żebra i kręgosłup; Przecięcie aorty i żyły głównej spowoduje przepływ znacznej ilości krwi - użyj patyczka higienicznego, aby zatamować przepływ. Umieścić w torbie do wyrzucenia.
6. Zalać kaniulę PA 4 ml ze strzykawki RPMI o pojemności 10 ml. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie rurki są wolne od pęcherzyków powietrza. Perfuzja płuc z destylacją Woda lub bąbelki spowodują obrzęk.
7. Wytnij małe wcięcie w prawej ścianie wolnej komory i włóż kaniulę PA, kierując w dół i w prawo. Końcówka kaniuli powinna być widoczna przez przezroczystą ściankę PA. Wlej niewielką ilość RPMI, aby potwierdzić swoją lokalizację. Zaciśnij szew wokół kaniuli, aorty i PA i zawiąż węzeł. Należy pamiętać, że w tym momencie aorta jest również zawiązana, więc właściwa perfuzja nie powinna się rozpocząć, dopóki lewy przedsionek nie zostanie kaniulowany.

5.3. Kanulacja lewego przedsionka

1. Wyciąć wcięcie w dolnej części lewej komory i zobojętnić kaniulę lewego przedsionka (LA), kierując się do góry. Do otwarcia zastawki mitralnej w tym kierunku może być potrzebne niewielkie ciśnienie. We właściwym miejscu końcówka kaniuli prześlizgnie się i będzie bezpieczna bez szwów.

5.4. Rozpocznij perfuzję

1. Ręcznie podawać RPMI ze strzykawki o pojemności 10 ml w ilości 0,3 ml na minutę, aż RMPI będzie widoczne w rurkach odpływowych (różowawy kolor w przeciwieństwie do przezroczystego PBS). Jeśli w rurze odpływowej nie ma przepływu, zmień położenie kaniuli LA. Jeśli nie można uzyskać odpływu przy zmianie położenia, sprawdź, czy nie ma wycieku w tętnicy płucnej. Nieszczelność lub pęknięcie tętnicy płucnej nie może zostać naprawione; Jest to powód do przerwania eksperymentu.
2. Podłącz strzykawkę o pojemności 60 ml do kaniuli PA za pomocą systemu IL-1 i rozpocznij infuzję perfuzatu z prędkością 1 ml/min, sprawdzając, czy nie ma wycieków i upewniając się, że płuca stają się białe, co pokazuje, że RPMI zastępuje krew w płucach. Perfuzja z powolnym przepływem przez dwie minuty.

6. Pomiar pulsacyjnych i stałych zależności między ciśnieniem a przepływem w płucach

1. W przypadku badań przepływu pulsacyjnego należy najpierw ustawić przemieszczenia tłoków pompy oscylacyjnej na żądanych poziomach dla każdej częstotliwości w programie WinTest na podstawie wcześniejszych eksperymentów. Ze względu na zmienność budowy i mechaniki płuc, przemieszczenia muszą być dostosowane do każdej myszy. Ustaw stały przepływ na żądany poziom. Otwórz zawór pompy oscylacyjnej i rozpocznij rejestrację danych tuż przed uruchomieniem profilu przepływu oscylacyjnego (program Wintest). Otwórz plik danych i wykreśl przepływ eksperymentalny (Q) w programie Excel. Dostosuj przemieszczenia tłoków pompy oscylacyjnej przy każdej częstotliwości (program Wintest) tak, aby Q max i Q min były zgodne z potrzebami.
2. W przypadku prób stałego przepływu należy zamknąć zawór pompy oscylacyjnej. Jeśli ten zawór pozostanie otwarty, pompa oscylacyjna działa jak kondensator, tłumiąc zmiany z jednego natężenia przepływu na drugie. Zbieraj dane przez co najmniej 10 sekund przy każdym natężeniu przepływu lub do momentu, gdy ciśnienie PA nie zmieni się o więcej niż 5%.
3. W przypadku pomiarów przepływu pulsacyjnego lub stałego, stara wentylacja pod stałym ciśnieniem przed zebraniem danych. Wznów wentylację natychmiast po zebraniu danych.
4. Uważaj na RPMI w drogach oddechowych; jest to dowód obrzęku i jest powodem do przerwania eksperymentu. Nie pozwól również, aby RPMI dotarł do czujników ciśnienia lub przepływu w drogach oddechowych, ponieważ spowoduje to uszkodzenie przetworników.

7. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywne stałe wyniki:

W izolowanym układzie płuc eksperymentator ma możliwość niezależnego kontrolowania nie tylko przepływu w płucach Q, ale także ciśnienia w drogach oddechowych, P_{, powietrza} i ciśnienia w lewym przedsionku LAP. Jest to korzystne, ponieważ Q, P_powietrze i LAP wpływają na unaczynienie płuc i wynikające z tego ciśnienie w tętnicy płucnej PAP. Kolejną zaletą jest to, że uzyskane wyniki są niezależne od tonu współczulnego układu nerwowego ¹, stanu objętości i znieczulenia ².

Zmiany PAP wywołane zmianami stopnia schodowego w Q dla stałego_powietrza P i stałego lub zmiennego LAP są pokazane na rysunku 1. Należy zauważyć, że w izolowanym preparacie płucnym kaniula LAP jest zwykle podłączona do rurki, która kieruje perfuzat do pojemnika na odpady. Po umieszczeniu tej rurki LAP jest liniowo zależny od Q ze względu na przepływ Poiseuille'a. Jednak wysokość wylotu i pojemnika na odpady można regulować ręcznie, aby zapewnić stałe, niezerowe okrążenie lub rurkę można usunąć, aby umożliwić zerowe okrążenie, które jest niezależne od Q.

Reprezentatywne wyniki pulsacji:

Podczas gdy za pomocą tego systemu można generować dowolne przebiegi przepływu pulsacyjnego, zazwyczaj generujemy przepływ w postaci Q = 3 + 2 sin (2fπt) ml/min przy częstotliwościach f = 1, 2, 5, 10, 15 i 20 Hz, aby ocenić zlinearyzowaną impedancję układu krążenia płuc (Rysunek 2: górny panel). Na podstawie uzyskanych pomiarów PAP, LAP i Q oblicza się wielkość impedancji naczyń płucnych (Z) i fazę (θ), rozkładając najpierw jeden pełny cykl sinusoidalny ΔP = PAP-LAP i Q przy każdej narzuconej częstotliwości sinusoidalnego natężenia przepływu na szereg harmonicznych sinusoidalnych za pomocą transformaty Fouriera. Stosunek transformacji ciśnienia do transformacji przepływowej daje impedancję naczyniową płuc, PVZ = FFT (ΔP)/FFT(Q), która ma wielkość Z i fazę θ. Impedancja wejściowa Z₀, impedancja charakterystyczna Z_C i wskaźnik odbicia fali R_W są obliczane na podstawie wielkości impedancji. W szczególności Z₀ oblicza się z Z przy 0. harmonicznej (f = 0 Hz) uśrednionej dla wszystkich częstotliwości, Z_C oblicza się jako średnią Z między pierwszym minimum (5 Hz) a 20 Hz, a R_W oblicza się jako (Z_{0-Z C})/(Z₀+Z_C) ³.

Rysunek 1. Przebiegi przepływu ustalonego (górny rząd) i wynikające z nich ciśnienia (drugi rząd: PAP, P_air, LAP) w funkcji czasu z różnymi kombinacjami_powietrza LAP i P. Dolny wiersz pokazuje PAP vs. Q. W (A) i (B) LAP zwiększa się i maleje wraz z Q, ponieważ rurka odpływowa była na swoim miejscu. Rurka ta została usunięta dla (C), tak że LAP jest stałe i niezależne od Q. W (D) i (E) wysokość rurki wylotowej została wyregulowana ręcznie tak, aby LAP był wyższy, ale niezależny od Q._Powietrze było pod ciśnieniem końcowym wdechowym (A, C, D) lub końcowym wydechowym (B, E).

Rysunek 2. Przebieg przepływu pulsacyjnego Q (panel górny) i wynikające z niego ciśnienia (panel dolny: PAP, LAP i P_powietrze) w funkcji czasu. Na podstawie tych pulsacyjnych zależności ciśnienia płucnego od przepływu można obliczyć PVZ, który odzwierciedla całkowite obciążenie następcze prawej komory.

Dyskusja

Kluczowe etapy operacji

Bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność podczas odcinania klatki piersiowej od płuc. Płuca muszą być w pełni odsłonięte i niehamowane przez otaczające tkanki podczas napełniania, ale nie uszkodzone podczas procesu izolacji. Użycie płaskiego przedmiotu, takiego jak tylny koniec kleszczy, może być użyte do utrzymania płuc z dala od ściany klatki piersiowej, tak aby istniała wolna ścieżka do cięcia nożyczkami. Kolejnym krytycznym krokiem jest założenie szwu wokół tętnicy ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Strzykawka 1 ml	Fisher Scientific	14-829-10F
Strzykawka 10 ml	Fisher Scientific	14-823-2A
Strzykawka 60 ml	Fisher Scientific	13-689-8
RPMI z GLN 6/PK	Filtry	MT10040CV
	Fisher Scientific	09-761-57
Ficoll PM 70	Sigma-Aldrich	F2878-100g
Heparyna	Sigma-Aldrich
Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Nożyczki do	Fine Science Tools	14109-09
Nożyczki sprężynowe Vannas - ostrza 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
Nożyczki do cienkiej tęczówki - proste	narzędzia	do nauki14106-09
Dumont #5/45 Kleszcze	Narzędzia do nauki	11251-35
Kleszcze do biologii medycznej	Dumont Narzędzia do nauki	11254-20
Lauda E100 ECO-line 003	VWR international	Porównywalny z Lauda-Brinkmann E-103, 62400-922
IL-1 Izolowany perfundowany system płuc myszy	Aparat Harvarda	739904
Przetwornik ciśnienia krwi P75 do modułu PLUGSYS	Aparat Harvard	730020
Moduły przepływu TS410	Transonic	TS410
ME 4 PXN Precyzyjne czujniki przepływu PXN	Transonic	ME 4 PXN
Pompy wielostrzykawkowe Cole-Parmer	Cole-Parmer	EW-74900-20
Nembutal 50MG/ML 20ML Fiolka	Amatheon