Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Podsumowanie

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Streszczenie

Polaryzacja komórek jest fundamentalną właściwością komórek eukariotycznych, która jest dynamicznie regulowana przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne podczas rozwoju embrionalnego ^{1, 2}. Jedną z szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w tę regulację jest szlak Wnt, który jest wielokrotnie wykorzystywany podczas embriogenezy i ma kluczowe znaczenie dla patogenezy chorób u ludzi^{3, 4, 5}. Liczne komponenty molekularne tego szlaku współdziałają w regulacji sygnalizacji w sposób przestrzennie ograniczony, jednak mechanizmy leżące u podstaw tego procesu nie są w pełni poznane. Embrionalne komórki nabłonkowe Xenopus stanowią doskonały system do badania subkomórkowej lokalizacji różnych białek sygnałowych. Białka fuzyjne z fluorescencyjnymi znacznikami są ekspresjonowane w embrionach Xenopus poprzez mikroiniekcję RNA, następnie przygotowuje się eksplanty ektodermy, a lokalizację białek ocenia za pomocą epifluorescencji. W niniejszym protokole eksperymentalnym opisujemy sposób wizualizacji subkomórkowej lokalizacji Diversiny – białka cytoplazmatycznego, którego udział wykazano w sygnalizacji i określaniu polaryzacji komórkowej^{6, 7} – w komórkach ektodermy Xenopus w celu zbadania transdukcji sygnału Wnt⁸. Współekspresja liganda Wnt lub receptora Frizzled zmienia rozkład Diversiny połączonej z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP), rekrutując ją do błony komórkowej w sposób spolaryzowany ^{8, 9}. Ten protokół ex vivo powinien stanowić użyteczne uzupełnienie badań in vitro na hodowlach komórek ssaków, w których kontrola przestrzenna sygnalizacji różni się od tej w nienaruszonym tkance i jest znacznie trudniejsza do analizy.

Protokół

1. In vitro Zapłodnienie Xenopus Jaja

1. Pozyskać jaja od samic żab, którym 12 godzin przed eksperymentem wstrzyknięto ludzką gonadotropinę kosmówkowej (400 unit/frog).
2. Umieścić jaja w niewielkiej ilości (0,5-1 ml) 1 x zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marca (MMR)¹⁰ i zapłodnić je in vitro za pomocą małego fragmentu wypreparowanego jądra. Po 2-3 min dodać 0,1 x MMR, aby pokryć całą powierzchnię jaj. W ciągu 20 minut usunąć otoczkę galaretowatą jaj przy użyciu 3 % cysteiny - HCL (dostosowanej do pH 8 za pomocą wodorotlenku sodu). Jaja przemyć trzykrotnie roztworem 0,1 x MMR i pozostawić w chłodnej inkubatorze (13° C) do momentu iniekcji.
3. Pozostawić zapłodnione jaja do rozwoju do stadium 2-4 komórek. Do iniekcji embriony przenieść do roztworu zawierającego 3 % Ficoll, 0,5 x MMR.

2. Mikrowstrzykiwanie RNA

1. RNA są syntetyzowane z linearyzowanych matryc DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine (Ambion), a następnie rozcieńczane wodą wolną od RNaz do stężenia zapasu 0,1-1 μg/μl. Optymalne dawki RNA do iniekcji są ustalane w eksperymentach pilotażowych. RNA dla Diversin-RFP, markera błonowego GFP-CAAX oraz Frizzled 8 są stosowane w ilości 0,1-1 ng na iniekcję.
2. Igły do iniekcji są przygotowywane z kapilary za pomocą wyciągarki igieł, a następnie szlifierki do igieł. Przed iniekcją każda igła jest kalibrowana wodą, aby dozować 10 nl cieczy na jedną iniekcję.
3. Do iniekcji embriony umieszcza się na plastikowym spodku w dużej kropli 3 % Ficoll, 0,5 x MMR. Jeden mikrolitr roztworu RNA jest zasysany do igły iniekcyjnej za pomocą mikroinjektora Narishige. 10 nl RNA wstrzykuje się 2-3 razy do blastomerów zwierzęcych embrionów w stadium 8 komórek. Iniektowane embriony przenosi się do dołka płytki 12-dołkowej.

3. Przygotowanie eksplantów ektodermalnych

1. Gdy wstrzyknięte embriony osiągną wczesny etap gastruli, przenosi się je do roztworu 0,6 x MMR w plastikowej szalce o średnicy 3 cm pokrytej 1% agarozą. Błonę witelinową usuwa się ręcznie za pomocą pęsety. Eksplanty ektodermy wycina się z embrionów, używając igły wolframowej i pętli z włosa.
2. Eksplanty ektodermy przenosi się do szklanej fiolki i utrwala w 3,7% formaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 30 minut. Utrwalone eksplanty płucze się trzykrotnie w PBS (po 10 minut każdy). Do trzeciego płukania dodaje się DAPI w celu zabarwienia jąder komórkowych.
3. Eksplanty montuje się na szkiełku przedmiotowym. Do szkiełka przykleja się dwa paski taśmy klejącej, a eksplanty umieszcza pomiędzy tymi paskami. Ponieważ zewnętrzna powierzchnia eksplantów jest pigmentowana, ich wewnętrzna strona powinna być skierowana w stronę obiektywu mikroskopu. Dodaje się dwie lub trzy krople po 20 μl medium montażowego (70% glicerolu w PBS z dodatkiem 25 mg/ml DABCO, środka zapobiegającego blaknięciu)¹¹. Całość przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym.

4. Obrazowanie eksplantów pod mikroskopem fluorescencyjnym

1. Próbki są oglądane pod fluorescencyjnym mikroskopem Zeiss Axioplan z odpowiednimi filtrami.
2. Obrazy są rejestrowane przy użyciu przystawki Apotome, aby zwizualizować konkretną płaszczyznę z kilku niezależnych eksplantów.

5. Kriosekcjonowanie

Kriosekcjonowanie jest alternatywną metodą wizualizacji rozkładu białek fluorescencyjnych w komórce, bardziej przydatną w przypadku immunobarwienia. W stadium 10 embriony utrwala się przez 1-2 godziny w utrwalaczu Denta (20% DMSO, 80% metanolu), przemywa PBS i zatapia w 15% roztworze żelatyny rybiej i 15% sacharozy¹¹. Zatopione embriony są szybko zamrażane na suchym lodzie, a następnie wykonuje się krioprzekroje przy użyciu kriosztatu Leica. Przekroje poprzeczne obejmują komórki ektodermalne, które odziedziczyły wstrzyknięte RNA oraz ich przetłumaczone produkty białkowe. Przekroje zachowują fluorescencję i mogą być poddawane immunobarwieniu specyficznymi przeciwciałami, a następnie znakowaniu przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem. Jądra komórkowe barwi się DAPI. Medium montażowe jest takie samo, jak opisano powyżej. Obrazowanie można przeprowadzić zgodnie z wcześniejszym opisem.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rycina 1. Receptor Frizzled rekrutuje Diversinę do błony komórkowej. Komórki ektodermy wykazujące ekspresję RNA Frizzled 8 (Xfz8) oraz Div-RFP wykazują obecność Div-RFP w błonie komórkowej, zamiast w centrosomie (co potwierdzono poprzez wspólne barwienie g-tubuliną). Schemat eksperymentu znajduje się w górnej części; przedstawiono typowy przekrój poprzeczny.

Dyskusja

Powyższy protokół zastosowaliśmy do charakterystyki lokalizacji subkomórkowej Diversiny. W eksplantach bieguna zwierzęcego Diversina-RFP została wykryta w sąsiedztwie jądra i kolokalizowała z g-tubuliną, markerem centrosomalnym, w sekcjach mrożonych (Rysunek 1). Po zidentyfikowaniu lokalizacji subkomórkowej białka można stworzyć konstrukty delecyjne, aby ustalić, które domeny białkowe są niezbędne i wystarczające dla danej lokalizacji subkomórkowej. Stosując to podejście, domeny lokalizacji centrosomalnej Diversiny zmapo...