Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Podsumowanie

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Streszczenie

Polaryzacja komórek jest fundamentalną właściwością komórek eukariotycznych, która jest dynamicznie regulowana przez czynniki wewnętrzne i zewnętrzne podczas rozwoju embrionalnego ^{1, 2}. Jedną z szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w tę regulację jest szlak Wnt, który jest wielokrotnie wykorzystywany podczas embriogenezy i ma kluczowe znaczenie dla patogenezy chorób u ludzi^{3, 4, 5}. Liczne komponenty molekularne tego szlaku współdziałają w regulacji sygnalizacji w sposób przestrzennie ograniczony, jednak mechanizmy leżące u podstaw tego procesu nie są w pełni poznane. Embrionalne komórki nabłonkowe Xenopus stanowią doskonały system do badania subkomórkowej lokalizacji różnych białek sygnałowych. Białka fuzyjne z fluorescencyjnymi znacznikami są ekspresjonowane w embrionach Xenopus poprzez mikroiniekcję RNA, następnie przygotowuje się eksplanty ektodermy, a lokalizację białek ocenia za pomocą epifluorescencji. W niniejszym protokole eksperymentalnym opisujemy sposób wizualizacji subkomórkowej lokalizacji Diversiny – białka cytoplazmatycznego, którego udział wykazano w sygnalizacji i określaniu polaryzacji komórkowej^{6, 7} – w komórkach ektodermy Xenopus w celu zbadania transdukcji sygnału Wnt⁸. Współekspresja liganda Wnt lub receptora Frizzled zmienia rozkład Diversiny połączonej z czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP), rekrutując ją do błony komórkowej w sposób spolaryzowany ^{8, 9}. Ten protokół ex vivo powinien stanowić użyteczne uzupełnienie badań in vitro na hodowlach komórek ssaków, w których kontrola przestrzenna sygnalizacji różni się od tej w nienaruszonym tkance i jest znacznie trudniejsza do analizy.

Protokół

1. In vitro Zapłodnienie Xenopus Jaja

1. Pozyskać jaja od samic żab, którym 12 godzin przed eksperymentem wstrzyknięto ludzką gonadotropinę kosmówkową (400 unit/frog).
2. Umieścić jaja w niewielkiej ilości (0,5-1 ml) 1 x zmodyfikowanego roztworu Ringera według Marca (MMR)¹⁰ i zapłodnić je in vitro za pomocą małego fragmentu wypreparowanego jądra. Po 2-3 min dodać 0,1 x MMR, aby pokryć całą powierzchnię jaj. W ciągu 20 minut usunąć otoczkę galaretowatą jaj za pomocą 3 % cysteiny - HCL (skorygowanej do pH 8 wodorotlenkiem sodu). Jaja przemyć trzykrotnie roztworem 0,1 x MMR i pozostawić w zimnym inkubatorze (13° C) do czasu iniekcji.
3. Pozwolić zapłodnionym jajax rozwinąć się do stadium 2-4 komórek. Do iniekcji embriony przenieść do roztworu zawierającego 3 % Ficoll oraz 0,5 x MMR.

2. Mikroiniekcja RNA

1. RNA są syntetyzowane z linearyzowanych matryc DNA przy użyciu zestawu mMessage mMachine (Ambion), a następnie rozcieńczane wodą wolną od RNaz do stężenia zapasowego 0,1-1 μg/μl. Optymalne dawki RNA do iniekcji są ustalane w eksperymentach pilotażowych. RNA dla Diversin-RFP, markera błonowego GFP-CAAX oraz Frizzled 8 są stosowane w ilości 0,1-1 ng na iniekcję.
2. Igły do iniekcji są przygotowywane z kapilary przy użyciu wyciągacza igieł (needle puller), a następnie szlifierki do igieł. Przed iniekcją każda igła jest kalibrowana wodą, aby dozować 10 nl cieczy na jedną iniekcję.
3. Do iniekcji embriony umieszcza się na plastikowej szalce w dużej kropli 3% Ficollu i 0,5 x MMR. Jeden mikrolitr roztworu RNA jest zasysany do igły iniekcyjnej za pomocą mikroinjektora Narishige. 10 nl RNA jest wstrzykiwanych do blastomerów zwierzęcych embrionów w stadium 8 komórek 2-3 razy. Iniektywne embriony są przenoszone do dołka płytki 12-dołkowej.

3. Przygotowanie eksplantatów ektodermalnych

1. Gdy wstrzyknięte embriony osiągną wczesny etap gastruli, przenosi się je do roztworu 0.6 x MMR w plastikowym naczyniu o średnicy 3 cm pokrytym 1 % agarozy. Błonę witelinową usuwa się ręcznie za pomocą pincety. Eksplantaty ektodermy wycina się z embrionów, używając igły wolframowej i pętli z włosia.
2. Eksplantaty ektodermy przenosi się do szklanej fiolki i utrwala w 3.7 % formaldehydzie w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przez 30 minut. Utrwalone eksplantaty płucze się w PBS trzykrotnie (po 10 minut każde płukanie). DAPI dodaje się do trzeciego płukania w celu zabarwienia jąder komórkowych.
3. Eksplantaty montuje się na szkiełku podstawowym. Do szkiełka przykleja się dwa paski taśmy klejącej, a eksplantaty umieszcza pomiędzy nimi. Ponieważ zewnętrzna powierzchnia eksplantatów jest pigmentowana, ich strona wewnętrzna powinna być skierowana w stronę obiektywu mikroskopu. Dodaje się dwie lub trzy krople po 20 μl medium montażowego (70 % glicerolu w PBS z dodatkiem 25 mg/ml DABCO, odczynnika zapobiegającego blaknięciu)¹¹. Na wierzch nakłada się szkiełko nakrywkowe.

4. Obrazowanie eksplantów pod mikroskopem fluorescencyjnym

1. Próbki ogląda się pod fluorescencyjnym mikroskopem Zeiss Axioplan z odpowiednimi filtrami.
2. Obrazy wykonuje się za pomocą przystawki Apotome, aby zwizualizować konkretną płaszczyznę z kilku niezależnych eksplantów.

5. Kriosekcjonowanie

Kriosekcjonowanie jest alternatywną metodą wizualizacji rozkładu białek fluorescencyjnych w komórce i znajduje szersze zastosowanie w immunobarwieniu. W stadium 10 zarodki utrwala się przez 1-2 godziny w utrwalaczu Denta (20% DMSO, 80% metanolu), przemywa PBS i zatapia w 15% roztworze żelatyny rybiej i 15% sacharozy¹¹. Zatopione zarodki szybko zamraża się na suchym lodzie, a następnie wykonuje krioprzekroje za pomocą kriostatu Leica. Przekroje poprzeczne obejmują komórki ektodermalne, które odziedziczyły wstrzyknięte RNA oraz ich przetłumaczone produkty białkowe. Sekcje zachowują fluorescencję i mogą być poddane immunobarwieniu swoistymi przeciwciałami, a następnie znakowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforem. Jądra komórkowe barwi się DAPI. Pośredniki do montowania są takie same, jak opisano powyżej. Obrazowanie można przeprowadzić zgodnie z powyższym opisem.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Receptor Frizzled rekrutuje Diversynę do błony komórkowej. Komórki ektodermy wykazujące ekspresję RNA Frizzled 8 (Xfz8) oraz Div-RFP ujawniają obecność Div-RFP w błonie komórkowej, zamiast w centrosomie (co wykazano poprzez wspólne barwienie z g-tubuliną). Schemat eksperymentu znajduje się u góry; przedstawiono typowy przekrój.

Dyskusja

Powyższy protokół zastosowaliśmy do charakterystyki lokalizacji subkomórkowej Diversiny. W eksplantach bieguna zwierzęcego Diversina-RFP została wykryta w sąsiedztwie jądra i kolokalizowała z g-tubuliną, markerem centrosomalnym, w sekcjach mrożonych (Rysunek 1). Po zidentyfikowaniu lokalizacji subkomórkowej białka można stworzyć konstrukty delecyjne, aby ustalić, które domeny białkowe są niezbędne i wystarczające dla danej lokalizacji subkomórkowej. Stosując to podejście, domeny lokalizacji centrosomalnej Diversiny zmapo...