W tym filmie opisujemy metodę obrazowania żywych komórek w celu obserwacji asymetrycznego podziału komórek progenitorowych organów sensorycznych oraz komórek epidermy w nienaruszonych poczwarkach Drosophila
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie żywych komórek prekursorowych organów zmysłowych w nienaruszonych poczwarkach Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Od czasu odkrycia zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) nastąpiła rewolucyjna zmiana w wykorzystaniu obrazowania żywych komórek jako narzędzia do zrozumienia fundamentalnych mechanizmów biologicznych. Wyjątkowy postęp jest szczególnie widoczny w przypadku Drosophila, którego rozbudowany zestaw mutantów i linii transgenicznych stanowi dogodny model do badania konserwatywnych ewolucyjnie mechanizmów rozwojowych i biologii komórki. Naszym celem jest zrozumienie mechanizmów kontrolujących specyfikację losu komórek w dorosłym obwodowym układzie nerwowym (PNS) u Drosophila. Szczecinki pokrywające głowę, klatkę piersiową, odwłok, odnóża i skrzydła dorosłej muchy są poszczególnymi organami mechanoreceptywnymi i były badane jako system modelowy służący do zrozumienia mechanizmów decyzji o losie komórek zależnych od białka Notch. Komórki prekursorowe organów sensorycznych (SOP) mikrochaet (czyli małych szczecinek) są rozmieszczone w całym nabłonku klatki piersiowej poczwarki i ulegają specyfikacji w ciągu pierwszych 12 godzin po rozpoczęciu pupariacji. Po specyfikacji komórki SOP zaczynają się dzielić, segregując determinant losu komórkowego Numb do jednej komórki potomnej podczas mitozy. Numb działa jako autonomicznie komórkowy inhibitor szlaku sygnalizacyjnego Notch.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę śledzenia dynamiki białek w komórkach SOP oraz ich potomstwie w obrębie nienaruszonego klatki piersiowej poczwarki, wykorzystując kombinację tkankowo-specyficznych driverów Gal4 oraz białek fuzyjnych znakowanych GFP 1,2. Technika ta posiada przewagę nad utrwalonymi tkankami lub hodowanymi eksplantami, ponieważ pozwala na śledzenie pełnego rozwoju organu — od specyfikacji prekursora neuronalnego po wzrost i terminalne różnicowanie narządu. Dzięki temu możemy bezpośrednio powiązać zmiany w zachowaniu komórek ze zmianami w terminalnym różnicowaniu. Ponadto możemy połączyć technikę obrazowania na żywo z systemem mozaikowej analizy z represyjnym markerem komórkowym (MARCM), aby ocenić dynamikę znakowanych białek w mitotycznych komórkach SOP w warunkach mutantowych lub typu dzikiego. Wykorzystując tę technikę, my oraz inni badacze zdobyliśmy nową wiedzę na temat regulacji asymetrycznego podziału komórek oraz kontroli aktywacji sygnalizacji Notch w komórkach SOP (przykłady znajdują się w referencjach 1-6,7 ,8).
Protokół
Wymagane materiały: stereomikroskop do sekcji, taśma dwustronna, standardowe szkiełko przedmiotowe i nakrywka, pęseta sekcyjna (rozmiar 5 lub 5,5), pędzel z miękkim włosiem, silikonowy smar próżniowy, strzykawka 5cc, papier Whatmana, mikroskop konfokalny lub epifluorescencyjny z kamerą cyfrową i oprogramowaniem do akwizycji obrazu.
1. Disekcja poczwarki
- Przeprowadź krzyżówkę (używając odpowiedniej kombinacji linii Gal4 oraz białka fuzyjnego z tagiem GFP pod kontrolą UAS) lub umieść muchy z linii, którą chcesz obrazować, w kilku świeżych fiolkach w temperaturze 25°C.
- Komórki SOP zazwyczaj zaczynają proliferować na klatce piersiowej poczwarki osiemnaście godzin po rozpoczęciu pupariacji, dlatego wybieramy poczwarki „białe” z odpowiedniej linii much lub krzyżówki. Białe poczwarki mają morfologię poczwarki, ale ich poczwarowa powłoka jest niepigmentowana, co wskazuje, że pupariacja nastąpiła w ciągu ostatniej godziny.
- Odczekaj około 18 godzin.
- Umieść kawałek dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku. Zbierz poczwarki i przyklej ich powłokę do taśmy stroną brzuszną do dołu. Chwyć krawędź operculum (okrągłego włazu na przedniej górnej części powłoki poczwarki) za pomocą pęsety.
- Ostrożnie podnieś, usuń i odrzuć operculum, odsłaniając głowę niedojrzałej muchy.
- Użyj pęsety, aby zacząć rozdzierać powłokę poczwarki wzdłuż jej boku. Podnieś środkową część powłoki od strony rozdarcia i przesuń ją na przeciwną stronę, usuwając ją całkowicie lub przyklejając do taśmy, odsłaniając klatkę piersiową i przednią część odwłoka. (Uwaga: Pomiędzy rozwijającą się muchą a powłoką poczwarki istnieje szczelina. Należy uważać, aby nie przebić muchy podczas rozdzierania ścianki powłoki).
- Zacznij przecinać powłokę poczwarki wzdłuż tej samej strony w kierunku końca tylnego. Ponownie uważaj, aby nie przebić muchy. Odsuń powłokę poczwarki na przeciwną stronę muchy i dociśnij ją do dwustronnej taśmy. Odwłok powinien być teraz w pełni odsłonięty. Umieść pędzelek z miękkim włosiem bezpośrednio pod głową muchy. Gdy mucha przyklei się do pędzelka i zostanie uwolniona z powłoki poczwarki, użyj pędzelka, aby delikatnie podnieść muchę ze szkiełka.
2. Montaż poczwarek
Po przeprowadzeniu sekcji poczwarki są następnie montowane pomiędzy szkiełkiem a nakrywką:
- Wyizolowane poczwarki usunięte z kokonu można następnie umieścić na środku szkiełka przedmiotowego stroną grzbietową do góry.
- Przygotować kwadratową ramkę z papieru Whatman o wymiarach 18X18 mm z otworem 10X10 mm w środku. Zanurzyć papier w wodzie aż do nasycenia. Umieścić ramkę wokół poczwarki.
- Używając strzykawki 5 cc wypełnionej silikonowym smarem próżniowym, nanieść równą warstwę smaru wokół ramki z papieru Whatman. Warstwa smaru powinna mieścić się w obrębie szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1), a jej grubość powinna być tylko nieco większa niż średnica poczwarki.
- Nanieść małą kroplę wody (1 μl) na środek szkiełka nakrywkowego o wymiarach 2X2 mm i położyć szkiełko na powyższej preparacji tak, aby kropla wody stykała się z powierzchnią przeznaczoną do obrazowania (w tym przypadku z notum). Delikatnie docisnąć, aby utworzyć szczelną warstwę smaru próżniowego i płaską powierzchnię styku między szkiełkiem nakrywkowym a kutykulą poczwarki.
- Preparat można następnie obrazować na mikroskopach odwróconych lub prostych, wykorzystując epifluorescencję, mikroskopię konfokalną (typu laserowego lub z dyskiem wirującym) lub dwufotonową mikroskopię konfokalną. Przy zachowaniu ostrożności, po kilku dniach można odzyskać dorosłe muchy.
3. Reprezentatywne wyniki:
Wykorzystując linię Gal4 specyficzną dla SOP (neuralized-Gal4) skrzyżowaną z białkami znakowanymi GFP w celu obrazowania wrzeciona podziałowego (tubulina lub Tau-GFP) lub białek histonowych (H2B-GFP), można obserwować płaszczyznę podziału komórek SOP, długość cyklu komórkowego lub liczbę podziałów mitotycznych za pomocą obrazowania time-lapse 9. Inne białka fuzyjne celujące w organella komórkowe, takie jak Rab-GTPazy służące do znakowania różnych przedziałów endocytarnych (Rab5-GFP dla wczesnych endosomów lub Rab1 GFP dla endosomów recyklingujących) lub białka istotne w regulacji sygnalizacji Notch (Numb-, Partner of Numb -GFP lub Sanpodo-GFP), mogą dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów asymetrycznego podziału komórkowego oraz transportu białek błonowych 2,3,7,10,1.
Rycina 1: Disekcja i montaż poczwarki. A. Kolejne obrazy przedstawiają procedurę usuwania poczwarki oraz przygotowania nienaruszonych poczwarek do montażu i obrazowania żywych komórek. Poczwarki są wyjmowane z fiolki i umieszczone grzbietem do góry na dwustronnej taśmie klejącej przyklejonej do szkiełka przedmiotowego. Pierwsza kolumna: usunięcie operculum i rozdarcia wzdłuż bocznej strony poczwarki. Druga kolumna: usunięcie poczwarki z obszaru klatki piersiowej i odwłoka. Następnie wolna poczwarka jest podnoszona z otoczki poczwarkowej za pomocą pędzla z miękkim włosiem. B. Montaż poczwarki między szkiełkiem a nakrywekrem. Poczwarkę umieszcza się grzbietem do góry na szkiełku przedmiotowym, otaczając ją zwilżoną ramką z papieru Whatman. Ciągła warstwa silikonowego smaru próżniowego, naniesiona z 5-mililitrowej strzykawki, służy do uszczelnienia połączenia szkiełka z nakrywką, chroniąc poczwarkę przed wysychaniem i unosząc nakrywkę tak, aby delikatnie opierała się ona o tułów poczwarki. Mała kropla wody (1 μl) na styku szkiełka nakrywkowego i kutykuli klatki piersiowej znacznie poprawia jakość obrazu przy zastosowaniu obiektywów imersyjnych (wodnych lub olejowych). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy żywych komórek SOP oraz zróżnicowanych zewnętrznych organów sensorycznych, wykonane przy użyciu naszej procedury sekcji i montowania poczwarek. AObrazy wyodrębnione z serii czasowej komórki SOP w fazie mitozy, wykazującej ekspresję białka fuzyjnego aktyna-GFP pod kontrolą zneuralizowaneGal4 (neur-Gal4/UAS-actin-GFP), zwróć uwagę na akumulację aktyny w korze w obrębi bruzdy podziałowej (1 obraz co 2 minuty). BSOP komórki potomne koekspresyjne dla białek Partner of Numb-RFP (czerwony) i Rab5-GFP sterowane przez zneuralizowaneGal4, zwróć uwagę na asymetryczny rozkład Pon-RFP w jednej z komórek potomnych (pIIb) oraz rozkład wczesnych endosomów w obu komórkach potomnych. CRendering wolumetryczny serii przekrojów z (z-series) zróżnicowanych zewnętrznych organów sensorycznych w późnym stadium poczwarki. Struktury kutykuli, takie jak szczecinki mechanosensoryczne i włosy epidermalne, są widoczne dzięki autofluorescencji kutykuli (kolor czerwony). Dodatkowo zastosowano system MARCM w celu ekspresji Lgl-GFP (pod kontrolą zneuralizowanyGal4) w podzbiorze komórek prekursorowych organów zmysłowych (zielony). (Wszystkie obrazy zostały zarejestrowane przy użyciu skanującego mikroskopu konfokalnego Nikon C1 z obiektywem 60X 1,45 N.A.)
Dyskusja
W tym filmie przedstawiamy technikę izolowania i montowania poczwarek Drosophila do obrazowania żywych komórek SOP w notum poczwarki. Usunięcie poczwarek z poczwarkowej osłonki wymaga pewnej ręki, odpowiednich narzędzi i pewnej wprawy, lecz jest łatwe do opanowania. Ważne jest, aby precyzyjnie określić stadium rozwoju poczwarek, co zapewni względną łatwość preparacji i pozwoli uchwycić fazę proliferacji rozwoju SOP. Po zamontowaniu poczwarki będą nadal rozwijać się pomiędzy szkiełkiem a nakryweką i w większości przypadków osiągną stadium imago w poczwarce, a ostatecznie przejdą przeobrażenie. W naszym doświadczeniu komórki można obrazować przez kilka godzin. Ta technika montowania nie ogranicza się do obserwacji komórek prekursorowych PNS na klatce piersiowej poczwarki, ale może być wykorzystana do wizualizacji wszystkich komórek znajdujących się blisko powierzchni kutykuli i dostępnych dla obiektywu mikroskopu (należy zauważyć, że obserwacje prowadzone są w stadium, w którym osłonkę poczwarki można usunąć bez zabicia poczwarki, zazwyczaj około 10 do 14h po uformowaniu puparium). Z sukcesem wizualizowaliśmy białka połączeń, białka cytoszkieletowe oraz regulatory transportu pęcherzykowego w komórkach nabłonkowych poczwarki (dane niepublikowane).
Technika montażu poczekonek pozwoliła nam również opracować metodę obrazowania struktur kutykularnych w późnych stadiach poczekonek przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego, w celu wizualizacji morfologii szczecinek mechanosensorycznych i włosków epidermalnych z wykorzystaniem wewnętrznej autofluorescencji kutykuli. Obrazy te przypominają mikrografie z transmisyjnego mikroskopu elektronowego kutykuli muchy, ale mogą być pozyskiwane z żywych zwierząt i pozwalają na jednoczesną wizualizację morfologii kutykularnej oraz ekspresji fluorescencji GFP 6,7,12.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować J. Knoblichowi (IMP, Wiedeń) oraz M. Gonzalez-Gaitanowi (Uniwersytet Genewski) za szczepy Drosophila, a także Shinyi Inoué i Christianowi Sardetowi, których techniki montowania embrionów morskich stały się inspiracją do opracowania niniejszej metody. Protokół ten został pierwotnie opracowany w laboratorium Y.N. Jana. F.R. i D.Z. są wspierani przez grant NIH RO1 NS059971, fundusz Pennsylvania Tobacco Settlement oraz Fox Chase Cancer Center.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| dwustronna taśma klejąca Scotch | |||
| Szkiełko podstawowe | |||
| szkiełko nakrywkowe 18 mm x 18 mm | |||
| Pinceta | |||
| papier Whatman | |||
| Silikonowy smar próżniowy | Dow Corning | ||
| strzykawka 5 ml | |||
| Pipetator | |||
| Mikroskop konfokalny lub epifluorescencyjny |
Bibliografia
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Two types of asymmetric divisions in the Drosophila sensory organ precursor cell lineage. Nat Cell Biol. 3, 58-67 (2001).
- Bellaiche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nat Cell Biol. 3, 50-57 (2001).
- Emery, G., Knoblich, J. A. Endosome dynamics during development. Curr Opin Cell Biol. 18, 407-415 (2006).
- Roegiers, F., Younger-Shepherd, S., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Bazooka is required for localization of determinants and controlling proliferation in the sensory organ precursor cell lineage in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 14469-14474 (2001).
- Roegiers, F. Frequent unanticipated alleles of lethal giant larvae in Drosophila second chromosome stocks. Genetics. 182, 407-410 (2009).
- Tong, X. Numb independently antagonizes Sanpodo membrane targeting and Notch signaling in Drosophila sensory organ precursor cells. Mol Biol Cell. 21, 802-810 (2010).
- Jafar-Nejad, H. Sec15, a Component of the Exocyst, Promotes Notch Signaling during the Asymmetric Division of Drosophila Sensory Organ Precursors. Dev Cell. 9, 351-363 (2005).
- Karbowniczek, M. The evolutionarily conserved TSC/Rheb pathway activates Notch in tuberous sclerosis complex and Drosophila external sensory organ development. J Clin Invest. 120, 93-102 (2010).
- Coumailleau, F., Furthauer, M., Knoblich, J. A., Gonzalez-Gaitan, M. Directional Delta and Notch trafficking in Sara endosomes during asymmetric cell division. Nature. 458, 1051-1055 (2009).
- Emery, G. Asymmetric rab11 endosomes regulate delta recycling and specify cell fate in the Drosophila nervous system. Cell. 122, 763-773 (2005).
- Justice, N., Roegiers, F., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Lethal giant larvae acts together with numb in notch inhibition and cell fate specification in the Drosophila adult sensory organ precursor lineage. Curr Biol. 13, 778-783 (2003).
Przedruki i uprawnienia
