System hodowli komórek nabłonka pigmentowego tęczówki do badania regeneracji soczewki u traszki

Podsumowanie

U salamandry soczyście zielonej soczewka regeneruje się zawsze z grzbietowej części tęczówki poprzez transdyferencjację barwnikowych komórek nabłonka tęczówki (IPEs). W niniejszej pracy opisujemy procedurę hodowli komórek IPE z grzbietowej i brzusznej części tęczówki salamandry oraz ich implantację do oka tego zwierzęcia. Implantowane komórki są następnie analizowane za pomocą technik sekcjonowania tkanek i immunohistochemii.

Streszczenie

Salamandry, takie jak traszki i aksolotle, posiadają zdolność do regeneracji wielu utraconych części ciała, w tym kończyn, ogona wraz z rdzeniem kręgowym, oka, mózgu, serca oraz żuchwy ¹. W szczególności traszki wyróżniają się zdolnością do regeneracji soczewki. Po usunięciu soczewki komórki nabłonka pigmentowego tęczówki (IPE) z grzbietowej części tęczówki ulegają transdyferencjacji w komórki soczewki, co w ciągu około miesiąca prowadzi do utworzenia nowej soczewki ^2,3. Właściwość regeneracyjna ta nigdy nie występuje w przypadku komórek brzusznej części tęczówki. Potencjał regeneracyjny komórek tęczówki można badać poprzez przeszczepy komórek IPE hodowanych in vitro. W celu przeprowadzenia hodowli, komórki grzbietowej i brzusznej części tęczówki są najpierw izolowane z oka, a następnie hodowane oddzielnie przez okres 2 tygodni (Rysunek 1). Hodowane komórki są reaggregowane i reimplantowane do oka traszki. Dotychczasowe badania wykazały, że reaggregat grzbietowy zachowuje zdolność do tworzenia soczewki, podczas gdy agregat brzuszny nie tworzy soczewki, co odtwarza tym samym proces zachodzący in vivo (Rysunek 2) ^4,5. Ten system określania potencjału regeneracyjnego komórek grzbietowej i brzusznej części tęczówki jest bardzo użyteczny w badaniu roli genów i białek zaangażowanych w regenerację soczewki.

Protokół

1. Hodowla komórek tęczówki

1. Pobrać gałki oczne od 7 traszek (znieczulonych 0,1% roztworem metanosulfonianu etylu 3-aminobenzoesanu przygotowanym w PBS) i umieścić je w roztworze Hanksa bez wapnia i magnezu (CMF).
2. Zmienić rękawiczki i pracować w komorze do hodowli tkanek.
3. Zsterylizować gałki oczne w mieszaninie Lugola i EtOH przez 3 sekundy.
4. Przepłukać 2 razy w CMF.
5. Przenieść oczy do roztworu Hanksa i rozpocząć sekcję.
6. Wypreparować kompleks tęczówkowo-rogówkowy i usunąć siatkówkę nerwową.
7. Przenieść kompleksy do nowej szalki z roztworem Hanksa.
8. Za pomocą skalpela nr 15 podzielić kompleksy na połowy grzbietową i brzuszną.
9. Usunąć fragmenty tęczówki (najpierw brzuszne) i umieścić je w szalce zawierającej 1 ml L-15.
10. Dodać 15% (150 µl) objętości dyspazy (stężenie 7,5 units/ml).
11. Inkubować w 27°C przez 2 godziny (owinąć szalkę parafilmem).
12. Wyizolować komórki IPE ze zrębu (przygotować roztwór trypsyny w 27°C).
13. Zebrać komórki IPE do probówki 1,5 ml.
14. Wirować przy 1000 rpm w RT (temperaturze pokojowej) przez 2 minuty, a następnie usunąć nadsącz.
15. Przepłukać 1 ml roztworu Hanksa i wirować przy 1000 rpm w RT przez 2 minuty, a następnie usunąć nadsącz.
16. Dodać 1 ml roztworu trypsyny; inkubować przez 2 godziny w 27°C.
17. Wirować przy 1000 rpm w RT przez 2 minuty, a następnie usunąć trypsynę.
18. Dodać 1 ml L-15 w celu przemycia, wirować przy 1000 rpm przez 2 minuty.
19. Dodać 800 µl L-15, powoli pipetować w górę i w dół ok. 10 razy (więcej niż 12 razy zmniejsza adhezję).
20. Wysiać komórki IPE na płytkę 24-dołkową powleczoną kolagenem i inkubować w 27°C przez 2 tygodnie (zazwyczaj od 7 traszek uzyskuje się 4 dołki grzbietowych i 4 brzusznych).
21. Na tym etapie komórki nadają się do transfekcji genetycznej lub traktowania czynnikami w celu określenia ich roli w indukowaniu lub hamowaniu regeneracji soczewki.

2. Agregacja komórek tęczówki

1. Do płytek zawierających komórki tęczówki dodać 20μl roztworu dyspazy do 400 μl pożywki, delikatnie zamieszać okrężnymi ruchami.
2. Inkubować płytki w temperaturze 27°C przez noc.
3. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby odczepić komórki.
4. Przenieść komórki do probówki Eppendorf i wirować przez 2 minuty przy 1000 rpm w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć pożywkę i wypłukać, dodając 1 ml pełnej pożywki L-15, wirować przez 2 minuty przy 1000 rpm w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć pożywkę.
6. Użyć od 2000 do 7000 komórek na jeden agregat. Do każdej probówki dodać 200 ul pożywki L-15 na agregat.
7. Rozdzielić komórki (200 μl) do nowych probówek Eppendorf.
8. Wirować przy 1000 rpm przez 2 min w temperaturze pokojowej.
9. Inkubować przez 48 h w temperaturze 27°C.

3. Implantacja zagregowanych komórek

1. Należy naciąć rogówkę oka traszki i usunąć soczewkę.
2. Po usunięciu soczewki należy umieścić agregat komórek IPE bezpośrednio pod tkanką rogówki po stronie brzusznej oka.
3. Traszki są utrzymywane przez miesiąc, aby umożliwić regenerację soczewki.

4. Zatapianie oka traszki

1. Wyjąć oczy traszy z implantowanym agregatem i umieścić je w soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
2. Utrwalić w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4°C przez co najmniej 4 h lub przez noc.
3. Przemyć w PBS, 4°C przez 30 minut.
4. Potraktować 0,85% roztworem soli fizjologicznej: 4°C, 30 minut.
5. Przemyć w roztworze soli fizjologicznej/etanolu (1:1): RT przez 15 minut.
6. Przemyć w 70% etanolu: RT, 15 minut. Powtórzyć tę czynność raz.
7. Przemyć w 85% etanolu i 95% etanolu w RT, po 30 minut w każdym roztworze.
8. Przemyć w 100% etanolu: RT, 30 minut. Powtórzyć tę czynność raz.
9. Przechowywać w 4°C lub kontynuować procedurę.
10. Przemyć w 100% ksylenie: RT, 30 minut. Powtórzyć tę czynność raz.
11. Potraktować mieszaniną ksylenu/parafiny (1:1): 60°C, 45 minut.
12. Potraktować 100% parafiną: 60°C, 20 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze dwa razy.
13. Zatopić w formach do odlewania.

5. Krojenie na sekcje

1. Przygotować skrawki osadzonego oka o grubości 15 μm za pomocą mikrotomu.
2. Umieścić skrawki oka na szkiełku pokrytym żelatyną i pozostawić je na podgrzewaczu do szkiełek.

6. Barwienie

1. Umieścić preparaty w ksylenie na 10 minut. Powtórzyć tę czynność jeszcze raz.
2. Nawodnić w: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% etanolu po 1 minucie w każdym roztworze.
3. Płukać w wodzie dejonizowanej przez minutę.
4. Przemyć w PBS przez 15 minut.
5. Przemyć w PBST (0,2% Triton-X 100 w PBS) przez 15 minut.
6. Przemyć w PBS przez 15 minut.
7. Umieścić w roztworze blokującym (10% przeciwciała wtórnego koziego) na godzinę.
8. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez noc.
9. Przemyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS przez 15 minut.
10. Przemyć w PBST przez 15 minut.
11. Przemyć w PBS przez 15 minut.
12. Inkubować z przeciwciałem wtórnym przez 2 godziny w ciemności (rozcieńczenie 1:100 w PBS).
13. Przemyć w PBS, PBST i PBS po 15 minut w każdym roztworze, a następnie zamontować preparat.
14. Obserwować preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym.

7. Reprezentatywne wyniki:

Niniejsza procedura hodowli komórek tęczówki traszki była wykorzystywana do badania potencjału regeneracyjnego komórek IPE z części grzbietowej i brzusznej. Ponadto możliwe jest badanie specyficznych genów przyczyniających się do mechanizmu regeneracji soczewki w oku traszki. Po 2 tygodniach hodowli komórek (Rysunek 1) można przeprowadzić ich transfekcję genami w celu zbadania ich funkcji w regeneracji soczewki. Szczególne zainteresowanie budzą geny, które mogą indukować tęczówkę brzuszną. Ponieważ komórki tęczówki brzusznej nie potrafią ulec transdyferencjacji w soczewkę (Rysunek 2), można badać funkcję indukcyjną kandydującego genu. W przeszłości, stosując tę technikę, wykazaliśmy, że nadekspresja six-3 w obecności kwasu retinowego prowadziła do indukcji soczewki z tęczówki brzusznej ⁶. Na Rysunku 3 widać, że agregat z tęczówki brzusznej doprowadził do powstania w pełni wyrośniętej i zróżnicowanej soczewki (grot strzałki), która nie różni się od soczewki gospodarza z tęczówki grzbietowej (strzałka).

Rycina 1. a) Komórki nabłonka pigmentowego grzbietowej części tęczówki hodowane in vitro przez okres 2 tygodni. b) Komórki nabłonka pigmentowego brzusznej części tęczówki hodowane in vitro przez okres 2 tygodni. Zauważmy, że pigmentacja utrzymuje się na tym etapie zarówno w komórkach grzbietowych, jak i brzusznych części tęczówki.

Rycina 2. Zdolność do regeneracji hodowanych komórek IPE. a) Indukcja soczewki z agregatu grzbietowych komórek IPE (grot strzałki). Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka), di: grzbietowa część tęczówki, vi: brzuszna część tęczówki, le: nabłonek soczewki, lf: włókna soczewki. b) Brak indukcji soczewki z agregatu brzusznych komórek IPE (grot strzałki). Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka).

Rycina 3. Indukcja soczewki z agregatu brzusznego przetransfekowanego six-3 i traktowanego kwasem retinowym. Indukcja soczewki gospodarza z grzbietowej części tęczówki (strzałka). Indukcja soczewki z agregatu brzusznego (grot strzałki).

Dyskusja

Niniejszy protokół ustanowił system in vitro do badania mechanizmów regeneracji soczewki u salamander. Ponieważ agregaty (zarówno grzbietowe, jak i brzuszne) wiernie odwzorowują zachowanie in vivo podczas regeneracji, technika ta może ograniczyć ogromny wysiłek wymagany przy transgenezie u salamander i może być wykorzystywana w eksperymentach typu „gain of function” (zyskanie funkcji), jak i „loss of function” (utrata funkcji) ^7,8,9 . Ponadto agregaty lub tęczówki jako całość mogą być łatwo traktowane czynnikami wzrostu w celu zbadania ich efektów, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Przykładowo, za pomocą tej techniki zbadano rolę szlaku BMP ⁶.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwór Lugola’	Sigma-Aldrich	L-6146
HEPES	Sigma-Aldrich	H-4034
Kwas 3-aminobenzoesanu etylu metanosulfonowy	Sigma-Aldrich	E-10521
Dyspaza	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
Trypsyna 1:250	GIBCO, by Life Technologies	27250018
L-15 (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L-4386
DNaza 1	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
Siarczan kanamycyny	GIBCO, by Life Technologies	100x, 15160
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Fungizone (roztwór amfoterycyny B)	Sigma-Aldrich	A2942
Płytka 24-dołkowa powlekana kolagenem	BD Biosciences	354408