Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

17.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2716

⸱

12 sierpnia 2011

 , 
1Department of Pathology, University of Kansas Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Streszczenie

Wpływ komórek zrębowych, w tym fibroblastów, na progresję nowotworów piersi został dobrze udokumentowany w modelach mysich, w szczególności poprzez transplantację komórek zrębowych i nabłonkowych do gruczołu mlekowego myszy. Obecne modele transplantacyjne często wymagają zastosowania myszy z niedoborem odporności ze względu na różnice w tle genetycznym komórek zrębowych i nabłonkowych. Do osadzania dwóch różnych typów komórek w celu zapewnienia spójnych oddziaływań międzykomórkowych często wykorzystuje się macierze zewnątrzkomórkowe, jednak wiąże się to z użyciem Matrigelu lub kolagenu z ogona szczura, które są substratami immunogennymi. Brak funkcjonalnych limfocytów T u myszy z niedoborem odporności uniemożliwia dokładną ocenę wpływu komórek zrębowych na progresję nowotworu piersi in vivo, co ma istotne znaczenie dla opracowywania i skuteczności leków. Ponadto myszy z niedoborem odporności są kosztowne, trudne w hodowli i wymagają specjalnych warunków opieki. Aby pokonać te przeszkody, opracowaliśmy metodę ortotopowej transplantacji komórek zrębowych i nabłonkowych do myszy o tym samym tle genetycznym w celu indukcji spójnego tworzenia nowotworów. System ten obejmuje pozyskanie prawidłowych fibroblastów, fibroblastów związanych z rakiem, komórek raka piersi PyVmT oraz kolagenu od myszy dawców C57BL/6J. Komórki są następnie osadzane w kolagenie i transplantowane do pachwinowych gruczołów mlekowych samic myszy C57BL/6J. Transplantacja samych komórek PyVmT prowadzi do powstania wyczuwalnych guzów 30-40 dni po zabiegu. Analiza końcowa w 60. dniu wskazuje, że kotransplantacja z fibroblastami nasila wzrost nowotworu piersi w porównaniu do transplantacji samych komórek PyVmT. Choć w badaniach tych wykorzystano komórki i macierz z myszy C57BL/6J, metoda izolacji komórek i macierzy oraz podejście do transplantacji mogą zostać zastosowane u myszy o innym tle genetycznym, co wykazuje wszechstronność tej metody. Podsumowując, system ten może być wykorzystywany do badania oddziaływań molekularnych między komórkami zrębowymi a nabłonkowymi i pozwala przezwyciężyć krytyczne ograniczenia modeli mysich z niedoborem odporności.

Protokół

1. Izolacja i ekstrakcja kolagenu donora z myszy C57BL/6J

  1. Uśmierć dorosłe, zdrowe samice myszy C57BL/6J zgodnie z zatwierdzonymi metodami IACUC.
  2. Pobierz ogony i namocz je w 70% etanolu przez 45 minut w celu sterylizacji tkanek. Osusz ogony ręcznikiem papierowym i owiń w folię aluminiową. Przechowuj ogony w -20°C do momentu użycia.
  3. Umieść ogony w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą nożyczek nacinaj skórę u nasady ogona i oddziel ją od tkanki. Odetnij od 0,5 do 1 cm z obu końców ogona, a pozostałą część podziel na trzy lub cztery fragmenty. Wypreparuj ścięgna z ogonów i rozdziel je na pojedyncze włókna za pomocą skalpela lub żyletki.
  4. Przenieś włókna ścięgien do sterylnego pojemnika i przemyj sterylną wodą destylowaną. Przenieś ścięgna z ogonów 5-7 myszy do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej 35 ml sterylnej wody dejonizowanej z dodatkiem 50 units/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny oraz 0,034 N kwasu octowego rozcieńczonego z roztworu zakraplającego kwasu octowego (17 N). Umieść na wstrząsarce w 4°C na tydzień w celu ekstrakcji kolagenu.
  5. Odwiruj zanieczyszczenia w wirówce stołowej przy 3000 g przez 15 minut. Przenieś nadsącz, około 30 ml, do dwóch probówek poliwęglanowych dostosowanych do rotora Beckman 50.2 Ti i wiruj przy 35 000 g (około 17 000 rpm) przez 1 godzinę.
  6. Objętość nadsączu musi zostać zredukowana, aby uzyskać stężenie 1-2 mg/ml. Przenieś nadsącz do jednostki filtracyjnej ultracel 50 k Amicon i wiruj w wirówce stołowej przy 3000 rpm przez 15 minut w 4°C. Przenieś filtrat do sterylnej probówki stożkowej i odstaw. Powtarzaj wirowanie, aż objętość zostanie zredukowana do 5-6 ml.
  7. Oznacz stężenie białka. Stosujemy standardowy test Bradforda (Biorad), używając standardów BSA (Biorad) i nierozcieńczonych próbek. Zmierz próbkę z filtratu jako kontrolę negatywną.
  8. Dalej sprawdź czystość ekstrakcji, rozdzielając próbkę oczyszczonego kolagenu na żelu poliakrylamidowym SDS 6%, 10 studzienek, grubość żelu 1,5 mm. Przygotuj 20 μg próbki w 30 μl 1x buforu do ładowania SDS-PAGE zawierającego 63 mM Tris HCl, 10% glicerolu, 2% SDS i 0,0025% błękitu bromofenolowego w probówkach eppendorfowskich o pojemności 1,5 ml. Przygotuj równą ilość białka z kolagenu typu I z ogona szczura jako kontrolę pozytywną. Dodatkowo przygotuj zestaw standardów BSA w stężeniach 2,5, 5, 10, 20 μg rozcieńczonych w PBS i 1X buforze do ładowania. Gotuj próbki w 95°C przez 5 minut.
  9. Pozostaw próbki do ostygnięcia i krótko odwiruj w mikrowirówce (maksymalna prędkość przez 10 sekund), aby osadzić kondensat.
  10. Nałóż próbki wraz z markerem masy cząsteczkowej. Na przykład nałóż 5 μl standardu białkowego Kaleidoscope Biorad. Prowadź elektroforezę przy 150 woltach przez około 1 godzinę lub do momentu, gdy front barwnika dotrze do dołu.
  11. Wyjmij żel i zabarw w buforze z błękitem Coomassie. Przygotuj ten bufor, mieszając 2 g błękitu Coomassie, 75 ml kwasu octowego zakraplającego i 500 ml etanolu do całkowitej objętości 1000 ml z wodą dejonizowaną. Przygotuj również taką samą ilość buforu do odbarwiania według tego samego przepisu, ale bez odczynnika błękitu Coomassie. Przykryj żel wystarczającą ilością błękitu Coomassie i umieść na wstrząsarce.
  12. Wstrząsaj delikatnie przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i zlej barwnik. Wymień roztwór do odbarwiania, gdy stanie się ciemnoniebieski. Odbarwiaj żel przez noc lub do momentu, gdy na żelu pojawią się wyraźne pojedyncze prążki. Zlokalizuj dwa prążki kolagenu (masy cząsteczkowe = 90 kda i 130 kda) i oceń intensywność prążków w stosunku do standardów i kontroli. W razie potrzeby wykonaj obrazowanie żelu za pomocą systemu GelDoc.

2. Izolacja i hodowla komórek raka piersi oraz fibroblastów od myszy dawców zdrowych i PyVmT C57BL/6J

  1. Uśmierć samice myszy normalnych lub transgenicznych PyVmT w tym samym wieku, po 10 tygodniach, gdy w przypadku myszy transgenicznych PyVmT guzy są widoczne i wyczuwalne, stosując zatwierdzone metody IACUC.
  2. Ułóż mysz na plecach na płaskiej powierzchni i unieruchom kończyny za pomocą taśmy klejącej.
  3. Wykonaj nacięcie w kształcie odwróconej litery T między sutkami gruczołów mlekowych piersiowych i pachwinowych, a następnie odchyl płat skóry, aby odsłonić gruczoły mlekowe. Usuń tkankę gruczołów mlekowych i posiekaj ją na małe kawałki za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  4. Przygotuj 100 ml enzymatycznego koktajlu do trawienia zawierającego: 200 mg trypsyny, 500 mg kolagenazy, 4 mg DNAzy, 100 000 jednostek hialuronidazy w sterylnym PBS oraz antybiotyki; inkubuj przez noc na lodzie, a następnie przez 3 h w temperaturze 37°C.
  5. Do każdej próbki dodaj 10 ml PBS zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i odwiruj osad komórkowy w wirówce stołowej przy 1500 rpm przez 5 minut w temperaturze 4°C.
  6. Ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 5-7 ml PBS/10% FBS. Powtórz wirowanie i przemywanie jeszcze dwa razy.
  7. Resuspenduj osad komórkowy w 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny oraz 250 ng/ml amfoterycyny i przenieś na szalki 10 cm pokryte kolagenem typu I. Aby pokryć szalki kolagenem, rozcieńcz 1 ml kolagenu (używając roztworu stokowego 1,5 mg/ml) w 39 ml 0,02 N kwasu octowego rozcieńczonego w sterylnej wodzie destylowanej lub PBS. Pipetuj 5 ml roztworu roboczego kolagenu na szalki 10 cm. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez minimum 10 minut. Odessaj nadmiar kolagenu. Nieużywane szalki zabezpiecz folią Parafilm i przechowuj w temperaturze 4°C przez tydzień.
  8. Wymieniaj pożywkę 2-3 razy w tygodniu. Prawidłowe trawienie tkanek będzie objawiać się obecnością ognisk nabłonkowych otoczonych wrzecionowatymi komórkami fibroblastycznymi.
  9. Oddziel fibroblasty od komórek nabłonkowych poprzez selektywną trypsynizację. Odessaj pożywkę i przemyj komórki raz PBS. Pipetuj 1 ml 0,25% trypsyny/0,54 mM EDTA na komórki i inkubuj w temperaturze pokojowej. Fibroblasty przylegają słabiej niż komórki nabłonkowe. Po 2 minutach sprawdź pod mikroskopem, czy fibroblasty oddzieliły się od podłoża; komórki powinny unosić się w zawiesinie lub być zaokrąglone, podczas gdy ogniska nabłonkowe powinny nadal przylegać do powierzchni.
  10. Lekko opukaj szalkę, aby poluzować fibroblasty, a następnie ostrożnie pipetuj 10 ml pożywki z surowicą do szalki, aby usunąć fibroblasty.
  11. Przenieś pożywkę z fibroblastami do stożkowej probówki 15 ml i odwiruj zgodnie z opisem w kroku 5). Przesiej te komórki na szalki 10 cm pokryte kolagenem i powtarzaj proces selektywnej trypsynizacji, aż fibroblasty i komórki nabłonkowe zostaną całkowicie rozdzielone.
  12. Sprawdź czystość komórek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na markery nabłonkowe, takie jak CK14 i CK18, oraz markery fibroblastów, takie jak alfa-aktyna mięśni gładkich (α-sma).

3. Barwienie immunofluorescencyjne hodowli komórkowych

  1. Umieścić szklane laminki w szalkach 6 cm. Sterylizować za pomocą promieniowania UV przez 5 do 10 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  2. Pokryć laminkę 1-2 ml roboczego roztworu kolagenu na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odessać nadmiar.
  3. Trypsynizować i wysiać 200 000 komórek nabłonkowych lub fibroblastów na próbkę. Dodać 3-5 ml pełnej pożywki i inkubować przez 24 godziny.
  4. Odessać pożywkę, przemyć komórki PBS i utrwalić w lodowatym metanolu w temperaturze -20°C przez 7 minut.
  5. Przemyć komórki PBS dwa razy, aby usunąć etanol, a następnie zablokować 1-2 ml PBS zawierającego 1% FBS przez 1 godzinę w RT.
  6. Za pomocą pęsety wyjąć laminki i umieścić je w dużym, płytkim pojemniku przykrytym parafilmem lub inną powierzchnią hydrofobową.
  7. Rozcieńczyć następujące przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku 1:100 w roztworze blokującym: anty-aktyna mięśni gładkich (α-sma), anty-CK14 (marker nabłonka podstawnego), anty-CK18 (marker nabłonka światłowstrowego).
  8. Nanieść pipetą 100 μl przeciwciał bezpośrednio na laminki na 1 godzinę w RT. Inkubować osobną laminkę z komórkami w roztworze blokującym; próbka ta będzie służyć jako kontrola przeciwciał wtórnych.
  9. Odessać przeciwciała i nanieść pipetą 1 ml PBS bezpośrednio na laminkę w celu przemycia. Odessać i powtórzyć 3-5 razy.
  10. Rozcieńczyć następujące przeciwciała wtórne w roztworze blokującym: anty-mysie-alexa 488 w stosunku 1:100, anty-mysie biotynylowane w stosunku 1:500, anty-mysie-alexa-568.
  11. Owinąć pojemnik z laminkami folią aluminiową. Nanieść pipetą 100 μl odpowiedniego przeciwciała wtórnego bezpośrednio na laminki: α-sma z anty-mysim-alexa 568, barwienie CK 14 z anty-mysim biotynylowanym oraz CK18 z anty-mysim-alexa 488. Przykryć pojemnik, aby chronić próbki przed światłem widzialnym.
  12. Odessać przeciwciała i przemyć PBS zgodnie z krokiem 9). Pozostawić próbki w PBS, z wyjątkiem barwienia CK14.
  13. Rozcieńczyć streptawidynę sprzężoną z alexa 568 w stosunku 1:500 w PBS. Inkubować próbki barwione na CK14 ze streptawidyną-alexa 568 przez 30 minut w RT w ciemności. Przemyć w PBS zgodnie z krokiem 9).
  14. Rozcieńczyć DAPI w stosunku 1:500 w PBS. Odessać PBS z próbek i inkubować z DAPI przez 10 minut w RT w ciemności.
  15. Przepłukać próbki PBS. Nanieść pipetą 100 μl odczynnika Prolong anti-fade na szkiełka przedmiotowe, odwrócić laminkę tak, aby komórki były skierowane w stronę szkiełka. Przechylić laminkę pod kątem, aby delikatnie zetknęła się z medium montującym.
  16. Wykonać obrazowanie próbek przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego. Przechowywać próbki w ciemności, aby chronić sygnał immunofluorescencyjny, który będzie utrzymywał się przez około 2 tygodnie.

4. Przygotowanie komórek zatopionych w kolagenie do przeszczepienia

  1. Aby osadzić komórki w kolagenie, konieczne jest obniżenie pH kolagenu w celu uzyskania polimeryzacji poprzez zmieszanie go z roztworem utwardzającym. Przygotuj roztwór utwardzający, mieszając 100 ml 10X Earl's Balanced Salt Solution (EBSS) z 2,45 g NaHCO3, 7,5 ml 1 M NAOH oraz 42,5 ml sterylnej wody destylowanej. Następnie wysterylizuj roztwór, używając jednostki filtrującej 0,22 mikrona montowanej na zakrętce butelki, przymocowanej do sterylnej butelki.
  2. Wymieszaj kolagen (stężenie zapasu 1 mg/ml) z roztworem utwardzającym w początkowym stosunku 4:1. Dla jednego przeszczepu wymieszaj 100 μl kolagenu z 25 μl roztworu utwardzającego w probówce typu eppendorf. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex lub pipetuj próbkę w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać składniki.
  3. Dodawaj kolagen lub roztwór utwardzający w przyrostach 5-10 μl i mieszaj dokładnie, aż barwnik czerwony fenolowy w mieszaninie zmieni kolor na jasnoróżowy lub pomarańczowy, co będzie odzwierciedlać neutralne pH. Kolor żółty wskazuje na pH kwasowe, natomiast ciemnoróżowy na pH zasadowe. Przechowuj mieszaninę w lodzie, aby zapobiec polimeryzacji.
  4. Usuń fibroblasty i komórki nabłonkowe z płytki poprzez trypsynizację. Najpierw odessij pożywkę i przemyj płytkę 5 ml PBS. Nanieś pipetą 1 ml 0,25% trypsyny/0,54 mM EDTA w HBSS na płytkę. Inkubuj fibroblasty w RT przez 2-5 minut. Inkubuj komórki nabłonkowe w 37°C przez 2-6 minut. Delikatnie postukaj w płytki, aby poluzować komórki. Sprawdź odłączenie komórek pod mikroskopem. Zneutralizuj trypsynę, pipetując 9 ml pełnej pożywki na płytkę, a następnie przenieś komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
  5. Pobierz 50 μl i policz komórki za pomocą hemocytometru. Zanotuj całkowitą objętość komórek w każdej probówce (około 10 ml).
  6. Zcentryfuguj komórki przy 1500 rpm przez 5 min w RT. Odessij nadsącz i resuspenduj komórki do stężenia 100 000 komórek/100 μl. Na przykład resuspenduj 500 000 komórek w całkowitej objętości 500 μl pełnej pożywki.
  7. Wymieszaj 250 000 komórek zrębu (250 μl) i 100 000 komórek nowotworowych (100 μl) w osobnej probówce. Wiruj w mikrowirówce przez 10 s przy 1000 rpm, a następnie usuń nadsącz za pomocą pipety. Dodaj do komórek 50 μl dostosowanego roztworu kolagenu. Pipetuj w górę i w dół, aby równomiernie rozproszyć komórki. Nanieś pipetą 50 μl na sterylną 6 cm płytkę do hodowli tkanek, tworząc okrągłą kroplę. Inkubuj przeszczep w 37°C przez 10 minut w celu polimeryzacji.
  8. Delikatnie dodaj 5 ml pełnej pożywki na płytkę, przechylając ją pod kątem i powoli pipetując pożywkę przy jednej krawędzi płytki. Obracaj płytkę, aż pożywka pokryje przeszczep.
  9. Inkubuj przez 24 godziny w 37°C. Przeszczep natychmiast.

5. Ortotopowa transplantacja komórek osadzonych w kolagenie u myszy C57BL/6J

  1. Przygotuj cienką szklaną prętkę do operacji transplantacji. Podgrzej szklaną pipetę Pasteura za pomocą palnika Bunsena. Używając pęsety, rozciągnij koniec pipety do grubości 2-3 mm. Pozostaw do ostygnięcia i wysterylizuj 70% etanolem.
  2. Wysterylizuj następujące instrumenty chirurgiczne poprzez autoklawowanie i użycie 70% etanolu: precyzyjne nożyczki chirurgiczne, tępe nożyczki chirurgiczne, tępą pęsetę, cienką pęsetę, klipsy do ran, zszywki chirurgiczne.
  3. Zanestezjuj mysz, stosując 2-3% isofluranu przy użyciu urządzenia do odsysania isofluranu. Średni przepływ O2 wynosi 1 L/minute przez lejek nosowy.
  4. Połóż mysz na plecach i unieruchom kończyny taśmą lub innym usuwalnym klejem. Usuń owłosienie za pomocą chemicznego depilatora, np. Nair. Wysterylizuj brzuch, przecierając go wacikiem nasączonym naprzemiennie 70% etanolem i betadyną, wykonując ruchy od środka na zewnątrz w formie tarczy.
  5. Jedną ręką unieś fragment skóry w obrębie gruczołu mlekowego za pomocą tępej pęsety. Drugą ręką, używając tępych nożyczek chirurgicznych, wykonaj nacięcie w kształcie odwróconego T pomiędzy sutkami nr 9 i 10 lub nr 4 i 5 pachwinowych gruczołów mlekowych, aby odsłonić gruczoły mlekowe.
  6. Za pomocą małych chirurgicznych nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie kieszonkowe pod węzłem chłonnym lub tętnicą gruczołu mlekowego.
  7. Wyjmij graft kolagenowy z naczynia hodowlanego za pomocą pęsety. Usuń nadmiar płynu z graftu kolagenowego, delikatnie przykładając go do sterylnej chusteczki, a następnie całkowicie wsuń graft kolagenowy do kieszonki za pomocą cienkiej szklanej prętki.
  8. Zszyj płat skóry, używając wchłanialnych szwów jelitowych nr 2 lub zszywek chirurgicznych.
  9. Pozostaw mysz w klatce do wybudzenia.
  10. Monitoruj myszy co najmniej dwa razy w tygodniu, badając palpacyjnie pod kątem obecności guzów. Uśmierć myszy, gdy guzy osiągną 1 cm średnicy. Pobierz tkanki do analizy.

6. Reprezentatywne wyniki:

Izolacja i ekstrakcja kolagenu z myszy C57BL/6J

Procedury te zostały zaadaptowane z1. Ekstrakcja białka kolagenu z 5-7 ogonów myszy pozwala na uzyskanie około 1-1,5 mg/ml w końcowej objętości 6 ml, co odpowiada 6-9 mg białka. W barwieniu Coomassie w ścieżkach z próbkami ekstrahowanymi z ogonów myszy wykrywa się prążki odpowiadające 90 kda i 130 kda, co wskazuje odpowiednio na obecność kolagenu typu I oraz prokolagenu (Rycina 1).

Izolacja i hodowla komórek raka piersi oraz fibroblastów z prawidłowych myszy oraz myszy PyVmT C57BL/6J.

Procedury zostały dostosowane na podstawie źródła2. Komórki raka PyVmT oraz fibroblasty można odróżnić na podstawie różnic w morfologii komórek oraz ekspresji specyficznych markerów nabłonkowych i mezenchymalnych. Komórki raka PyVmT rozpoznaje się po brukowatym kształcie oraz koekspresji CK18, markera nabłonkowego luminalnego, i CK14, markera nabłonkowego bazalnego, przy jednoczesnym braku ekspresji α-sma (Rycina 2). Fibroblasty gruczołu mlekowego to większe komórki o fenotypie wrzecionowatym, które wykazują wysoką ekspresję α-sma, ale nie wykazują ekspresji CK14 ani CK18 (Rycina 2). Dane te wskazują na ponad 95% czystość komórek fibroblastów i komórek nabłonkowych przy zastosowaniu opisanych procedur.

Ortotopowa transplantacja komórek zatopionych w kolagenie u myszy C57BL/6J

Procedury te zostały zaadaptowane z3, 4. Myszy biorcy transplantatu są uśmiercane, gdy guzy w którejkolwiek z grup eksperymentalnych osiągną średnicę 1,0 cm lub po około 60 dniach. Podczas gdy sam transplant komórek PyVmT prowadzi do powstania wyczuwalnych guzów po 30–40 dniach, osiągając średnią masę guza 0,335 g w 60. dniu, kotransplantacja komórek raka PyVmT wraz z fibroblastami gruczołu mlekowego skutkuje średnią masą guza 0,630 g, co wskazuje na przyspieszenie wzrostu guza przez fibroblasty (Rysunek 3).

Wynik elektroforezy żelowej SDS-PAGE, przedstawiający analizę stężenia białka BSA, zakres 5-20 µg.
Rycina 1. Analiza barwienia Coomassie ekstrakcji kolagenu typu I z ogonów myszy. BSA (˜ 66 kda) zaznaczono strzałką. Komercyjny kolagen z ogona szczura (20 μg białka) oraz oczyszczony kolagen z ogona myszy (20 μg białka) zaznaczono ramką (białka ˜130 kda, ˜ 90 kda). Std= marker masy cząsteczkowej.

Schemat immunofluorescencji porównujący CK14, CK18, α-sma w komórkach nabłonkowych i fibroblastach.
Rycina 2. Barwienie immunofluorescencyjne komórek raka piersi PyVmT i fibroblastów od dawcy. Panele a i b przedstawiają komórki raka piersi PyVmT poddane immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko CK14 i CK18. Panel c przedstawia fibroblasty zabarwione przeciwciałami przeciwko α-sma. Obrazy przedstawiono z nałożeniem barwienia DAPI przy powiększeniu 20x.

Wykres słupkowy porównujący średnią masę guza (g) z słupkami błędów; wyniki leczenia samym Pmt w porównaniu do Pmt+NAF.
Rycina 3. Rozwój guzów piersi u myszy C57BL/6J w obecności lub przy braku fibroblastów. Guzy piersi pobrano z myszy, którym przeszczepiono komórki raka PyVmT w obecności lub przy braku fibroblastów piersi, a następnie zważono. Średnia + błąd standardowy średniej. N=6 na grupę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Funkcjonalny wkład fibroblastów w progresję nowotworową został wykazany w modelach transplantacyjnych, w których wspólne przeszczepienie fibroblastów związanych z rakiem wraz z łagodnymi komórkami nabłonkowymi piersi prowadzi do zwiększenia wzrostu i inwazyjności guza5. Konwencjonalne podejścia transplantacyjne obejmowały wykorzystanie myszy SCID lub myszy nago w celu wspólnego przeszczepienia komórek zrębu i nabłonka pochodzących z różnych tło genetycznych myszy lub różnych gatunków. Myszy z niedoborami odpor...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Badania na zwierzętach:

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez komisję IACUC w University of Kansas Medical Center.

Podziękowania

Projekt ten został sfinansowany z grantu NIH/NCI nr R00 CA127357 oraz z funduszy University of Kansas Cancer Center Endowment.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Myszy C57BL/6NHarlan LaboratoriesN/A
Myszy transgeniczne MMTV-PyVmTJackson Laboratory002374
Płodowa surowica bydlęcaFisher ScientificSH3039603PR
DMEMVWR international10000113873
Penicylina/streptomycynaFisher ScientificMT-30-001
amfoterycynaFisher ScientificBP2645-20
Kolumny filtracyjne Amicon ultracel 50kEMD MilliporeUFC905008
Probówki do rotora Beckman TIBeckman Coulter Inc.355618
Kolagen z ogona szczuraFisher ScientificCB 40236
10x EBSSSigma-AldrichE7510-100ML
Trypsyna 1X, 0,25% w HBSS bez wapnia i magnezuFisher ScientificMT-25-050-CI
Kwas octowy lodowatyFisher ScientificA491-212
Błękit CoomassieFisher ScientificBP101 25
TrypsynaSigma-AldrichT3924-100ml
Kolagenaza ASigma-Aldrich
hialuronidazaSigma-AldrichH3884
DNazaSigma-AldrichD5025
Standard białkowy KaleidoscopeBio-Rad1610375
Lamelki szklaneFisher Scientific12545-78
Przykrywki szklaneVWR international101400-042
Przeciwciało przeciwko wimentynie S-20Santa Cruz Biotechnology, Inc.SC-7558
Przeciwciało przeciwko α-aktynie mięśni gładkichAbcamab5694
Przeciwciało przeciwko CK14Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-53253
Przeciwciało przeciwko CK18Abcamab668
DAPISigma-AldrichD9542
Biotynilowane przeciwciało anty-mysieVector LaboratoriesBA9200Dystrybuowane przez Fisher
Anti-mouse-alexa-568InvitrogenA10037
Anti-mouse- alexa-488InvitrogenA11001
Streptawidyna- alexa-488InvitrogenS11226
DAPIInvitrogenD21490
Prolong antifadeInvitrogenP-36930
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools91400-12
Precyzyjne nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-02
Pinceta tępaFine Science Tools11002-12
Precyzyjna pinceta nr 5Fine Science Tools11251-10
Nici chirurgiczne z jelita chromowanegoFisher ScientificNC9326254
Szklana pipeta PasteuraFisher Scientific22-042-815
EtanolFisher ScientificA406P 4
BetadynaFisher ScientificNC9386574
Klamry do ranFisher Scientific12032-07
Zszywki do ranFisher Scientific12031-07

Bibliografia

  1. Hayward, S., Haughney, P. C., Rosen, M. A., Greulich, K. M., Weier, H. U., Dahiya, R., Cunha, G. R. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-131 (1998).
  2. Cunha, G., Hom, Y. K., Young, P., Brody, J. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
  3. Ethier, S. P., Ammerman, C. A., Dziubinski, M. L. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
  4. Medina, D., Kittrell, F. Methods in Mammary Gland Biology. Asch, B. B., Ip, M. M. , Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. (2000).
  5. Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
  6. DeNardo, D. G., Johansson, M., Coussens, L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis. 27, 11-18 (2008).
  7. Naito, M. Macrophage differentiation and function in health and disease. Pathol Int. 58, 143-155 (2008).
  8. Firestein, G. S. The T cell cometh: interplay between adaptive immunity and cytokine networks in rheumatoid arthritis. J Clin Invest. 114, 471-474 (2004).
  9. Cheng, N., Chytil, A., Shyr, Y., Joly, A., Moses, H. L. Enhanced Hepatocyte Growth Factor Signaling by Type II Transforming Growth Factor-{beta} Receptor Knockout Fibroblasts Promotes Mammary Tumorigenesis. Cancer Res. 67, 4869-4877 (2007).
  10. Qiu, T. H. Global expression profiling identifies signatures of tumor virulence in MMTV-PyMT-transgenic mice: correlation to human disease. Cancer Res. 64, 5973-5981 (2004).
  11. Schaffhausen, B. S., Roberts, T. M. Lessons from polyoma middle T antigen on signaling and transformation: A DNA tumor virus contribution to the war on cancer. Virology. 384, 304-316 (2009).
  12. Cepko, C. L. Immortalization of neural cells via retrovirus-mediated oncogene transduction. Annu Rev Neurosci. 12, 47-65 (1989).
  13. O'Hare, M. J. Conditional immortalization of freshly isolated human mammary fibroblasts and endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 646-651 (2001).
  14. Shay, J. W., Wright, W. E., Werbin, H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization. Biochim Biophys Acta. 1072, 1-7 (1991).
  15. Gudjonsson, T., Villadsen, R., Ronnov-Jessen, L., Petersen, O. W. Immortalization protocols used in cell culture models of human breast morphogenesis. Cell Mol Life Sci. 61, 2523-2534 (2004).
  16. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  17. Shen, G. Immortalization of endothelial cells differentiated from mouse embryonic stem cells. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 218-228 (2002).
  18. Wang, S. J., Greer, P., Auerbach, R. Isolation and propagation of yolk-sac-derived endothelial cells from a hypervascular transgenic mouse expressing a gain-of-function fps/fes proto-oncogene. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 292-299 (1996).
  19. Tiede, B. J., Owens, L. A., Li, F., DeCoste, C., Kang, Y. A novel mouse model for non-invasive single marker tracking of mammary stem cells in vivo reveals stem cell dynamics throughout pregnancy. PLoS One. 4, e8035-e8035 (2009).
  20. Guzman, R. Intracarotid injection of fluorescence activated cell-sorted CD49d-positive neural stem cells improves targeted cell delivery and behavior after stroke in a mouse stroke model. Stroke. 39, 1300-1306 (2008).
  21. Duda, D. G. Differential transplantability of tumor-associated stromal cells. Cancer Res. 64, 5920-5924 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ekstrakcja kolagenuizolacja komórekhodowla tkankowatworzenie guzamyszy immunokompetentnegruczoł mlekowy
Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.