Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to rozwijająca się technologia umożliwiająca obrazowanie kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością i czułością na poziomie komórkowym. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcję wizualną dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, obejmującą konfigurację systemu, jego kalibrację, typowe procedury eksperymentalne in vivo oraz schematy obrazowania funkcjonalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia optyczna, dostarczająca cennych informacji na poziomie komórkowym i organellarnym, jest powszechnie uznawana za kluczową technologię biomedyczną. Jako główne filary trójwymiarowej (3-D) mikroskopii optycznej in vivo, mikroskopia fluorescencyjna jedno- i wielofotonowa oraz optyczna koherentna tomografia (OCT) wykazały wyjątkową czułość odpowiednio na kontrasty fluorescencyjne i rozproszenia optycznego. Jednakże kontrast absorpcji optycznej tkanek biologicznych, który koduje istotne informacje fizjologiczne i patologiczne, nie był dotąd możliwy do oceny.
Powstanie biomedycznej fotoakustyki doprowadziło do rozwoju nowej gałęzi mikroskopii optycznej – fotoakustycznej mikroskopii o rozdzielczości optycznej (OR-PAM)1, w której promieniowanie optyczne jest ogniskowane do limitu dyfrakcyjnego, aby uzyskać rozdzielczość boczną na poziomie komórkowym1 lub nawet subkomórkowym2. Jako wartościowe uzupełnienie istniejących technologii mikroskopii optycznej, OR-PAM wprowadza co najmniej dwie nowości. Po pierwsze i przede wszystkim, OR-PAM wykrywa kontrasty absorpcji optycznej z nadzwyczajną czułością (tj. 100%). Połączenie OR-PAM z mikroskopią fluorescencyjną3 lub z OCT opartą na rozpraszaniu optycznym4 (lub z obiema tymi metodami) pozwala na kompleksowe określenie właściwości optycznych tkanek biologicznych. Po drugie, OR-PAM koduje absorpcję optyczną w postaci fal akustycznych, w przeciwieństwie do czystych procesów optycznych w mikroskopii fluorescencyjnej i OCT, co zapewnia detekcję bez tła. Detekcja akustyczna w OR-PAM łagodzi wpływ rozpraszania optycznego na degradację sygnału i naturalnie eliminuje możliwe interferencje (tj. przesłuchy) między wzbudzeniem a detekcją, co jest częstym problemem w mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na nakładanie się widm wzbudzenia i fluorescencji.
OR-PAM, jako jedyna metoda obrazowania absorpcyjnego w zakresie optycznym, wykazuje szerokie zastosowania biomedyczne od momentu swojego opracowania, obejmujące między innymi neurologię5, 6, okulistykę7, 8, biologię naczyniową9 oraz dermatologię10. W tym filmie przedstawiamy konfigurację i kalibrację systemu OR-PAM, a także procedury eksperymentalne dla funkcjonalnego obrazowania mikrokrążenia in vivo.
Protokół
1. Konfiguracja systemu
- Naświetlanie optyczne
- Źródło naświetlania optycznego: impulsowy laser stały pompowany diodą (INNOSLAB, Edgewave) oraz laser barwnikowy (CBR-D, Sirah).
- Wyjściowa wiązka laserowa (szerokość impulsu: 7 ns) jest ogniskowana przez soczewkę kondensacyjną (LA131, Thorlabs), aby przejść przez otwór o średnicy 50-μm (P50C, Thorlabs).
- Otwór jest umieszczony w niewielkiej odległości od ogniska soczewki kondensacyjnej, aby dopasować średnicę otworu do średnicy wiązki w modzie podstawowym w celu skutecznego filtrowania przestrzennego.
- Przefiltrowana wiązka jest tłumiona przez filtr neutralny (NDC-50C-2M, Thorlabs), a następnie sprzęgana z jednomodowym światłowodem (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
- Wyjście światłowodu wypełnia tylną aperturę obiektywu mikroskopowego (RMS4X, Thorlabs), aby uzyskać ograniczoną dyfrakcyjnie ogniskową optyczną o rozmiarze ~2,6 μm przy długości fali 570 nm.
- Detekcja ultradźwiękowa
- Przetwornik ultradźwiękowy: częstotliwość centralna 50-MHz (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
- Przetwornik ultradźwiękowy jest przymocowany do wykonanego samodzielnie akustyczno-optycznego łącznika wiązek1 do detekcji ultradźwiękowej, który jest wyrównany współosiowo z ograniczonym dyfrakcyjnie naświetlaniem optycznym.
- W dolnej części łącznika wyszlifowano sferyczną wnękę, tworząc soczewkę akustyczną. Soczewka ta ma aperturę numeryczną 0,5 w wodzie i zapewnia akustyczną średnicę ogniskowej 43 μm przy częstotliwości centralnej 50-MHz.
- Ogniska optyczne i akustyczne są wyrównane konfokalnie w celu maksymalizacji czułości detekcji.
- Sprzęganie akustyczne
- Zastosowano suche sprzęganie ultradźwiękowe, aby uniknąć zanurzania zwierząt doświadczalnych w wodzie, co stosowano wczesnych systemach obrazowania fotoakustycznego12.
- W dniey czystej płytki Petriego (o średnicy 9 cm) wycięto okno obrazujące, które uszczelniono membraną polietylenową przezroczystą dla ultradźwięków i światła.
- Żel ultradźwiękowy (Clear Image, SonoTech) pomiędzy membraną polietylenową a obiektem obrazowanym sprzęga generowaną falę fotoakustyczną z obiektu do płytki Petriego, a woda dejonizowana w płytce Petriego dodatkowo sprzęga falę z zanurzoną głowicą obrazującą OR-PAM.
- Elektronika
- Sygnał fotoakustyczny wykryty przez przetwornik ultradźwiękowy jest wzmacniany przez dwa kaskadowe wzmacniacze (ZFL 50LN, Mini-Circuits).
- Wzmocniony sygnał jest digitalizowany przez 14-bitową kartę akwizycji danych (DAQ) (CompuScope 1420, Gage Applied Sciences) przy częstotliwości próbkowania 200 MS/s.
- Schemat skanowania
- Dwuwymiarowe (2-D) skanowanie rastrowe głowicy obrazującej OR-PAM w płaszczyźnie poziomej (x-y) jest sterowane przez komputer osobisty, który wyzwala zarówno kartę DAQ, jak i laser pompowy. Sygnał wyzwalający jest zsynchronizowany z sygnałem zegarowym z karty DAQ.
- Szybka oś skanera 2-D jest zdefiniowana jako kierunek skanowania przekroju poprzecznego (B-scan).
- Sekwencję obrazów B-scan można uzyskać poprzez przesuwanie głowicy obrazującej wzdłuż wolnej osi w celu utworzenia obrazu wolumetrycznego, który może być wyświetlany w formie bezpośredniego renderingu 3-D lub dwuwymiarowej projekcji maksymalnej amplitudy (MAP).
2. Kalibracja systemu
- Użyj ultradźwięków w trybie echo oraz reflektora ultradźwiękowego, aby wyznaczyć pozycję akustycznej płaszczyzny ogniskowania (tj. opóźnienia czasowego od sygnału wyzwalającego do maksymalnego sygnału echo ultradźwiękowego). Krok ten należy wykonać tylko raz podczas budowy systemu OR-PAM.
- Zmaksymalizuj sprawność sprzęgania światłowodu jednomodowego.
- Nałóż żel ultradźwiękowy na obiekt optycznie absorbujący (np. kawałek czarnej taśmy) i delikatnie przymocuj go pod oknem obrazującym w czarce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną.
- Opuść głowicę obrazującą do wody i usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod soczewką akustyczną.
- Reguluj głowicę obrazującą tak długo, aż sygnał fotoakustyczny obiektu absorbującego będzie pochodzić z akustycznej płaszczyzny ogniskowania, co można ocenić na podstawie opóźnienia akustycznego.
- Dostosuj pozycję pionową (tj. pozycję z) obiektywu mikroskopu, aby zmaksymalizować amplitudę sygnału fotoakustycznego generowanego przez płaski obiekt. Maksymalna amplituda sygnału wskazuje, że ognisko optyczne jest zbieżne z ogniskiem akustycznym w kierunku pionowym.
- Reguluj pozycje poziome (tj. pozycje x i y) obiektywu mikroskopu, aż sygnał fotoakustyczny generowany przez cel wykaże symetryczny wzorzec. Symetria sugeruje, że ognisko optyczne jest zbieżne z ogniskiem akustycznym w kierunku poziomym.
- Powtarzaj kroki 2.6 i 2.7, aż sygnał fotoakustyczny zostanie zoptymalizowany pod kątem symetrii i amplitudy.
3. Przykładowa procedura eksperymentalna – in vivo OR-PAM naczyń krwionośnych ucha myszy
- Krok ten nie jest wymagany w przypadku myszy nago-. Znieczul zwierzę poprzez doprzewnowłasną iniekcję koktajlu [przepis: 1 ml ketaminy (10 mg/ml), 0,1 ml ksylazyny (100 mg/ml) i 8,9 ml soli fizjologicznej; dawka: 0,1 ml/10 g]. Ogol włosy na uchu, a następnie usuń pozostałą depilację za pomocą kremu Surgi Cream (Kategoria #: 82565, American International Industries) przed oczyszczeniem obszaru wodą dejonizowaną. Należy pamiętać, że taka depilacja może lekko podrażnić naczynia krwionośne skóry, dlatego najlepiej przeprowadzić ją 24 godziny przed planowanym eksperymentem.
- Włącz fotoakustyczny system laserowy i sprawdź wyrównanie systemu.
- Znieczul mysz 3% izofluranem podawanym w formie oparów w gazie wziewnym (typowe natężenie przepływu wynosi 1,0-1,5 l/min, w zależności od masy ciała zwierzęcia), a następnie utrzymuj znieczulenie 1% izofluranem przez cały czas trwania eksperymentu. Jako gaz wziewny zaleca się stosowanie powietrza medycznego, aby utrzymać mysz w normalnym stanie fizjologicznym.
- Przenieś mysz na stolik stereotaktyczny i kontroluj temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C za pomocą mata grzewczego.
- Wypłaszcz ucho myszy na plastikowej płytce i nałóż na nie warstwę żelu ultradźwiękowego. Unikaj zapowietrzania żelu. Następnie umieść ucho pod oknem obrazującym i powoli podnoś stolik ze zwierzęciem, aż żel ultradźwiękowy zetknie się z dołem membrany polietylenowej. Wymagany jest lekki kontakt, ponieważ dociśnięcie ucha do membrany może wpłynąć na przepływ krwi w uchu.
- Zamocuj pulsoksymetr na nodze lub ogonie myszy, aby monitorować jej stan fizjologiczny, i nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu oraz przypadkowemu uszkodzeniu oczu myszy przez laser.
- Obniż głowicę obrazującą, aż soczewka akustyczna zostanie zanurzona w wodzie dejonizowanej, i usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod soczewką akustyczną.
- Sprawdź gęstość energii lasera, aby upewnić się, że mieści się ona w normach bezpieczeństwa laserowego American National Standards Institute13. Gęstość energii lasera nie powinna przekraczać 20 mJ/cm2, co przekłada się na 80 nJ energii impulsu laserowego, gdy wiązka lasera jest ogniskowana na głębokości 150 μm pod powierzchnią skóry.
- Ustaw laser w trybie wyzwalania zewnętrznego i rozpocznij skanowanie próbne. Dostosuj pozycję z głowicy obrazującej, aż najsilniejszy sygnał fotoakustyczny będzie pochodził z płaszczyzny ogniskowej akustycznej.
- Ustaw odpowiednie parametry skanowania i rozpocznij właściwą akwizycję obrazów.
- Po zakończeniu eksperymentu wyłącz laser, podnieś głowicę obrazującą z wody dejonizowanej, obniż stolik ze zwierzęciem, aby zwolnić mysz, oczyść ucho myszy wodą dejonizowaną, wyłącz system znieczulający oraz sterownik temperatury, a następnie zdejmij mysz ze stolika stereotaktycznego.
- Jeśli wymagane jest powtarzalne obrazowanie, umieść mysz w inkubatorze z temperaturą otoczenia ustawioną na 37 °C. Zwróć mysz do zwierzęcia po jej naturalnym wybudzeniu. W przeciwnym razie postępuj zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt w celu przeprowadzenia eutanazji i utylizacji.
4. Funkcjonalny OR-PAM całkowitego stężenia i wysycenia hemoglobiny tlenem
- Oksyhemoglobina (HbO2) i deoksyhemoglobina (HbR) to dwie główne formy hemoglobiny, która jest dominującym endogennym źródłem fotoakustycznym w zakresie widzialnym widma. HbO2 i HbR mają odmienne widma absorpcji optycznej, dzięki czemu można je rozróżnić widmowo w celu ilościowego oznaczenia całkowitego stężenia (HbT) oraz wysycenia tlenem (sO2) hemoglobiny5. Poniżej przedstawiono dwie wytyczne pomocne przy wyborze odpowiednich długości fal optycznych do pomiarów sO2:
- Długości fal należy wybierać w obrębie pasma Q widma absorpcji hemoglobiny (tj. 50-60 nm), aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu oraz odpowiednią penetrację.
- Zaleca się stosowanie długości fal, dla których współczynniki absorpcji HbO2 i HbR wykazują wyraźną różnicę (np. 561 nm z dominacją HbR oraz 578 nm z dominacją HbO2).
Oprócz sO2, HbT można obliczyć poprzez zsumowanie [HbR] i [HbO2], lub zmierzyć bezpośrednio przy długościach fal izosbestycznych widm współczynnika ekstynkcji molowej hemoglobiny (np. 530 nm, 545 nm, 570 nm i 584 nm)14, gdzie HbR i HbO2 mają równe współczynniki ekstynkcji molowej.
5. Reprezentatywne wyniki:
Na rysunku 1 przedstawiono anatomię naczyniową oraz sO2 w uchu żywej myszy nago, obrazowane za pomocą dwufalowej (561 i 570 nm) optycznej mikroskopii fotoakustycznej (OR-PAM). Typowy czas akwizycji obrazu dla pomiarów sO2 o dwóch długościach fal w takim obszarze zainteresowania (rozmiar obrazu: 10 mm x 10 mm; wielkość kroku: 2.5 μm x 5 μm) wynosi ~80 min.
Rysunek 1. In vivo fotoakustyczna mikroskopia o rozdzielczości optycznej. Obrazy MAP (A) całkowitego stężenia hemoglobiny ukazujące anatomię naczyniową (pozyskane przy 570 nm) oraz (B) stopnia nasycenia hemoglobiny tlenem (pozyskane przy 561 nm i 570 nm) w uchu myszy nagoj. (C) Powiększenie obszaru zaznaczonego ramką na panelu (A). Pasek skali na panelu (A) odnosi się zarówno do (A), jak i (B).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym filmie przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące protokołów eksperymentalnych OR-PAM, w tym konfiguracji systemu, wyrównania systemu oraz typowych procedur eksperymentalnych. Bezznakownikowy, nieinwazyjny OR-PAM umożliwił badanie funkcjonowania i metabolizmu mikronaczyniowego w obrębie pojedynczych naczyń włosowatych, dzięki czemu posiada potencjał do poszerzenia naszej wiedzy na temat fizjologii i patologii związanych z mikrokrążeniem. System OR-PAM jest obecnie produkowany przez firmę Microphotoacoust...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem dotyczącym zwierząt laboratoryjnych, zatwierdzonym przez Komitet ds. Badań nad Zwierzętami Szkoły Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis.
Podziękowania
Autorzy dziękują dr Lynnei Brumbaugh za wnikliwą lekturę manuskryptu. Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health R01 EB000712, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 oraz 5P60 DK02057933. Prof. Lihong V. Wang posiada interesy finansowe w firmach Microphotoacoustics, Inc. oraz Endra, Inc., które jednak nie wspierały niniejszej pracy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Własnoręcznie wykonany akustyczno-optyczny łącznik wiązek: | |||
| pryzmat prostokątny | Edmund Scientific | NT32-545 | |
| pryzmat romboidalny | Edmund Scientific | NT49-419 | |
| olej silikonowy | Clearco Products | 1000cSt | |
| system OR-PAM | Microphotoacoustics |
Bibliografia
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).
- Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo. Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).
- Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).
- Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).
- Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).
- Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography. Opt. Lett. 35, 1-3 (2010).
- Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).
- Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence. Blood. , Forthcoming Forthcoming.
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).
- Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).
- Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136. , American National Standards Institute Inc. New York, NY. (2007).
- Jacques, S. L., Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin . Oregon Medical Laser Center [Internet]. , Available from: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
