Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej

DOI:

10.3791/2729

⸱

3 maja 2011

 ,  , 
1Optical Imaging Laboratory, Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fotoakustyczna o rozdzielczości optycznej (OR-PAM) to nowa technologia zdolna do obrazowania kontrastów absorpcji optycznej in vivo z rozdzielczością komórkową i czułością. W tym miejscu udostępniamy wizualizowaną instrukcję dotyczącą protokołów eksperymentalnych OR-PAM, w tym konfiguracji systemu, wyrównania systemu, typowych procedur eksperymentalnych in vivo i schematów obrazowania funkcjonalnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia optyczna, dostarczająca cennych informacji na poziomie komórkowym i organelli, została powszechnie uznana za technologię biomedyczną. Mikroskopia fluorescencyjna jedno-/wielofotonowa oraz optyczna tomografia koherentna (OCT), będące podstawą trójwymiarowej (3D) mikroskopii optycznej in vivo, wykazały swoją niezwykłą czułość odpowiednio na kontrasty fluorescencji i rozpraszania optycznego. Jednak optyczny kontrast absorpcyjny tkanek biologicznych, który koduje istotne informacje fizjologiczne/patologiczne, nie został jeszcze oceniony.

Pojawienie się fotoakustyki biomedycznej doprowadziło do powstania nowej gałęzi mikroskopii optycznej, mikroskopii fotoakustycznej o rozdzielczości optycznej (OR-PAM)1, gdzie promieniowanie optyczne jest skupiane do granicy dyfrakcji, aby osiągnąć rozdzielczość boczną na poziomie1 lub nawet subkomórkowym2. Jako cenne uzupełnienie istniejących technologii mikroskopii optycznej, OR-PAM wprowadza co najmniej dwie nowości. Po pierwsze i najważniejsze, OR-PAM wykrywa kontrasty absorpcji optycznej z niezwykłą czułością (tj. 100%). Połączenie OR-PAM z mikroskopią fluorescencyjną3 lub z OCT4 opartym na rozpraszaniu optycznym (lub z obydwoma) zapewnia kompleksowe właściwości optyczne tkanek biologicznych. Po drugie, OR-PAM koduje absorpcję optyczną w postaci fal akustycznych, w przeciwieństwie do czystych procesów optycznych w mikroskopii fluorescencyjnej i OCT, i zapewnia detekcję bez tła. Detekcja akustyczna w OR-PAM łagodzi wpływ rozpraszania optycznego na degradację sygnału i w naturalny sposób eliminuje możliwe zakłócenia (tj. przesłuchy) między wzbudzeniem a detekcją, co jest częstym problemem w mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na nakładanie się widm wzbudzenia i fluorescencji.

Unikalny dla optycznego obrazowania absorpcyjnego, OR-PAM od czasu swojego wynalezienia wykazuje szerokie zastosowania biomedyczne, w tym, ale nie ograniczając się do neurologii5, 6, okulistyki7, 8, biologii naczyniowej9 i dermatologii10. W tym filmie uczymy konfiguracji systemu i wyrównania OR-PAM, a także procedur eksperymentalnych dla funkcjonalnego obrazowania mikronaczyniowego in vivo.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja systemu

  1. Naświetlanie optyczne
    1. Źródło promieniowania optycznego: pompowany diodą laser impulsowy na ciele stałym (INNOSLAB, Edgewave) i laser barwnikowy (CBR-D, Sirah).
    2. Wyjściowa wiązka laserowa (szerokość impulsu: 7 ns) jest skupiana przez soczewkę kondensatora (LA1131, Thorlabs) w celu przejścia przez otwór o średnicy 50 μm (P50C, Thorlabs).
    3. Otwór jest umieszczony nieco z dala od ogniska soczewki kondensatora, aby dopasować średnicę otworka do średnicy wiązki w trybie podstawowym w celu skutecznego filtrowania przestrzennego.
    4. Przefiltrowana wiązka jest tłumiona przez filtr o neutralnej gęstości (NDC-50C-2M, Thorlabs), a następnie sprzężona ze światłowodem jednomodowym (P1-460A-FC-2, Thorlabs).
    5. Wyjście światłowodu wypełnia tylną aperturę obiektywu mikroskopu (RMS4X, Thorlabs), aby uzyskać ograniczone dyfrakcją ogniskowanie optyczne ~2,6 μm przy długości fali 570 nm.
  2. Detekcja ultradźwiękowa
    1. Przetwornik ultradźwiękowy: częstotliwość centralna 50 MHz (V214-BB-RM, Olympus-NDT).
    2. Przetwornik ultradźwiękowy jest podłączony do domowej roboty sumatora wiązki akustyczno-optycznej11 do wykrywania ultradźwiękowego, który jest wyrównany współosiowo z ograniczonym dyfrakcyjnie promieniowaniem optycznym.
    3. Sferyczna wnęka jest szlifowana z dna łącznika w celu wytworzenia soczewki akustycznej. Ta soczewka akustyczna ma aperturę numeryczną 0,5 w wodzie i zapewnia średnicę ogniskowej akustycznej 43 μm przy częstotliwości centralnej 50 MHz.
    4. Ogniska optyczne i akustyczne są ustawione konfokalnie, aby zmaksymalizować czułość wykrywania.
  3. Sprzężenie akustyczne
    1. Suche sprzężenie ultradźwiękowe jest stosowane w celu uniknięcia zanurzania zwierząt doświadczalnych w wodzie, co było stosowane we wczesnych systemach obrazowania fotoakustycznego12.
    2. W dnie szalki Petriego (o średnicy 9 cm) otwiera się okienko obrazowania, które jest uszczelnione przezroczystą ultradźwiękowo i optycznie membraną polietylenową.
    3. Żel ultradźwiękowy (Clear Image, SonoTech) pomiędzy membraną polietylenową a obiektem, który ma być obrazowany, sprzęga wygenerowaną falę fotoakustyczną z obiektu do szalki Petriego, a woda dejonizowana na szalce Petriego dalej sprzęga falę z zanurzoną głowicą obrazującą OR-PAM.
  4. elektronika
    1. Sygnał fotoakustyczny wykrywany przez przetwornik ultradźwiękowy jest wzmacniany przez dwa wzmacniacze kaskadowe (ZFL 500LN, Mini-Circuits)
    2. Wzmocniony sygnał jest digitalizowany przez 14-bitową płytkę do akwizycji danych (DAQ) (CompuScope 14200, Gage Applied Sciences) z częstotliwością próbkowania 200 MS/s.
  5. Schemat skanowania
    1. Dwuwymiarowe (2-D) skanowanie rastrowe głowicy obrazującej OR-PAM wzdłuż płaszczyzny poziomej (x-y) jest sterowane przez komputer osobisty, który uruchamia zarówno płytkę DAQ, jak i laser pompujący. Sygnał wyzwalający jest zsynchronizowany z sygnałem wyjścia zegara z płyty DAQ.
    2. Szybka oś skanera 2D jest definiowana jako kierunek skanowania przekroju poprzecznego (B-scan).
    3. Sekwencję obrazów B-scan można uzyskać, przesuwając głowicę obrazującą wzdłuż wolnej osi w celu utworzenia obrazu wolumetrycznego, który można oglądać zarówno w bezpośrednim renderowaniu 3D, jak i w obrazie 2D z projekcją maksymalnej amplitudy (MAP).

2. Wyrównanie systemu

  1. Użyj ultradźwięków echa impulsowego i reflektora ultradźwiękowego, aby określić położenie akustycznej płaszczyzny ogniskowej (tj. opóźnienie czasowe od sygnału wyzwalającego do maksymalnego sygnału ultradźwiękowego echa). Ten krok należy wykonać tylko raz podczas budowy systemu OR-PAM.
  2. Zmaksymalizuj wydajność sprzężenia światłowodu jednomodowego.
  3. Nałóż żel ultradźwiękowy na przedmiot pochłaniający optycznie (np. kawałek czarnej taśmy) i delikatnie przymocuj go pod okienkiem obrazowania na szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną.
  4. Opuść głowicę obrazującą do wody i usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod soczewką akustyczną.
  5. Wyreguluj głowicę obrazującą tak, aż sygnał fotoakustyczny obiektu absorbującego będzie pochodził z akustycznej płaszczyzny ogniskowej, którą można ocenić na podstawie opóźnienia akustycznego.
  6. Dostosuj pozycję pionową (tj. pozycję z) obiektywu mikroskopu, aby zmaksymalizować amplitudę sygnału fotoakustycznego generowanego przez płaski obiekt. Zmaksymalizowana amplituda sygnału sugeruje, że ogniskowanie optyczne jest wyrównane ze skupieniem akustycznym w kierunku pionowym.
  7. Dostosuj pozycje poziome (tj. pozycje x i y) obiektywu mikroskopu, aż sygnał fotoakustyczny generowany przez cel pokaże symetryczny wzór. Symetria sugeruje, że ognisko optyczne jest wyrównane ze skupieniem akustycznym w kierunku poziomym.
  8. Powtarzaj kroki 2.6 i 2.7, aż sygnał fotoakustyczny zostanie zoptymalizowany zarówno pod względem symetrii, jak i amplitudy.

3. Przykładowa procedura eksperymentalna - in vivo OR-PAM unaczynienia uszu myszy

  1. Ten krok nie jest wymagany w przypadku nagich myszy. Znieczulić zwierzę wstrzyknięciem dootrzewnowym koktajlu [przepis: 1 ml ketaminy (100 mg/ml), 0,1 ml ksylazyny (100 mg/ml) i 8,9 ml soli fizjologicznej; dawkowanie: 0,1 ml/10 g]. Ogol włosy w uchu i dalej depiluj pozostałe włosy za pomocą kremu Surgi Cream (kategoria #: 82565, American International Industries) przed czyszczeniem go wodą dejonizowaną. Należy pamiętać, że taka depilacja może lekko podrażniać naczynia krwionośne skóry, dlatego najlepiej wykonywać ją 24 godziny przed planowanym eksperymentem.
  2. Włącz fotoakustyczny system laserowy i sprawdź wyrównanie systemu.
  3. Znieczulić mysz 3% izofluranem odparowanym przez gaz inhalacyjny (typowe natężenie przepływu wynosi 1,0-1,5 l/min, w zależności od masy ciała zwierzęcia) i Utrzymuj znieczulenie z 1% izofluranem przez cały czas trwania eksperymentu. Jako gaz inhalacyjny zaleca się powietrze klasy medycznej, aby utrzymać mysz w normalnym stanie stan fizjologiczny.
  4. Przełącz mysz w tryb stereotaktyczny i kontroluj temperaturę jej ciała na poziomie 37 °C za pomocą poduszki grzewczej.
  5. Spłaszcz ucho myszy na plastikowej płytce i nałóż warstwę żelu ultradźwiękowego na wierzch ucha. Unikaj zatrzymywania pęcherzyków powietrza wewnątrz żelu. Następnie umieść ucho pod okienkiem obrazowania i powoli podnoś stadium zwierzęce, aż żel ultradźwiękowy zetknie się z dnem membrany polietylenowej. Wymagany jest miękki kontakt, ponieważ dociskanie ucha do błony może wpływać na przepływ krwi w uchu.
  6. Zamocuj pulsoksymetr na nodze lub ogonie myszy, aby monitorować jej stan fizjologiczny, i nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i przypadkowemu uszkodzeniu laserowym oczu myszy.
  7. Opuść głowicę obrazowania, aż soczewka akustyczna zostanie zanurzona w wodzie dejonizowanej i usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod soczewką akustyczną.
  8. Sprawdź fluencję lasera, aby upewnić się, że jest zgodna ze standardami bezpieczeństwa lasera American National Standards Institute13. Fluencja lasera nie powinna przekraczać 20 mJ/cm2, co przekłada się na 80 nJ energii impulsu laserowego, gdy wiązka lasera skupiona jest na głębokości 150 μm pod powierzchnią skóry.
  9. Ustaw laser w trybie wyzwalania zewnętrznego i rozpocznij skanowanie próbne. Dostosuj pozycję z głowicy obrazującej do momentu, gdy najsilniejszy sygnał fotoakustyczny będzie pochodził z akustycznej płaszczyzny ogniskowej.
  10. Ustaw prawidłowe parametry skanowania i rozpocznij formalną akwizycję obrazu.
  11. Po eksperymencie wyłącz laser, wyjmij głowicę obrazującą z wody dejonizowanej, opuść stopień zwierzęcy, aby uwolnić mysz, wyczyść ucho myszy wodą dejonizowaną, wyłącz system znieczulenia i regulator temperatury i rozładuj mysz ze stopnia stereotaktycznego.
  12. Jeśli wymagane jest powtórzenie obrazowania, umieść mysz w inkubatorze z temperaturą otoczenia ustawioną na 37 °C. Zwróć mysz do obiektu dla zwierząt po naturalnym przebudzeniu. W przeciwnym razie postępuj zgodnie z protokołami dotyczącymi zwierząt, aby go uśpić i zutylizować.

4. Funkcjonalny OR-PAM całkowitego stężenia i nasycenia tlenem hemoglobiny

  1. Oksyhemoglobina (HbO2) i deoksyhemoglobina (HbR) to dwie główne formy hemoglobiny, dominującego endogennego źródła fotoakustycznego w widzialnym zakresie widmowym. HbO2 i HbR mają wyraźne widma absorpcji optycznej, a zatem mogą być różnicowane spektralnie w celu ilościowego określenia zarówno całkowitego stężenia (HbT), jak i nasycenia tlenem (sO2) hemoglobiny5. Oto dwie wskazówki, które pomogą wybrać odpowiednie długości fal optycznych do pomiarów sO2 :
  2. Długości fal powinny być wybierane w paśmie Q widma absorpcji hemoglobiny (tj. 550-600 nm), aby zapewnić wystarczający stosunek sygnału do szumu i odpowiednią penetrację.
  3. Zalecane są długości fal, w których współczynniki absorpcji HbO2 i HbR mają wyraźną różnicę (np. 561 nm z dominacją HbR i 578 nm z dominacją HbO2).

Oprócz sO2, HbT można obliczyć dodając do siebie [HbR] i [HbO2], lub można je bezpośrednio zmierzyć na izosbestowych długościach fal widm współczynnika ekstynkcji molowej hemoglobiny (np. 530 nm, 545 nm, 570 nm i 584 nm)14, gdzie HbR i HbO2 mają równe współczynniki ekstynkcji molowej.

5. Reprezentatywne wyniki:

Na rysunku 1 pokazano anatomię naczyń krwionośnych i sO2 w żywym uchu nagiej myszy zobrazowanym przez OR-PAM o podwójnej długości fali (561 i 570 nm). Typowy czas akwizycji obrazu dla pomiarów sO2 o podwójnej długości fali takiego obszaru zainteresowania (rozmiar obrazu: 10 mm x 10 mm; rozmiar kroku: 2,5 μm x 5 μm) wynosi ~80 min.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Mikroskopia fotoakustyczna in vivo o rozdzielczości optycznej. Obrazy MAP (A) całkowitego stężenia hemoglobiny pokazujące anatomię naczyń krwionośnych (uzyskaną przy 570 nm) i (B) nasycenie hemoglobiny tlenem (uzyskane przy 561 nm i 570 nm) w nagim uchu myszy. (C) Zbliżenie obszaru ramkowego w panelu (A). Podziałka liniowa w panelu (A) ma zastosowanie zarówno do (A), jak i (B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym filmie przedstawiamy szczegółową instrukcję dotyczącą eksperymentalnych protokołów OR-PAM, w tym konfiguracji systemu, dostrojenia systemu i typowych procedur eksperymentalnych. Niewymagający znakowania, nieinwazyjny OR-PAM umożliwił badania nad funkcjonowaniem i metabolizmem mikronaczyń krwionośnych na pojedynczych naczyniach włosowatych, a tym samym ma potencjał do poszerzenia naszej wiedzy na temat fizjologii i patologii związanej z mikrokrążeniem. Microphotoacoustics jest obecnie producentem tego systemu OR-PAM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach laboratoryjnych zatwierdzonym przez Komitet Studiów nad Zwierzętami Szkoły Medycznej Uniwersytetu Waszyngtońskiego w St. Louis.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają uważną lekturę rękopisu przez dr Lynneę Brumbaugh. Praca ta była sponsorowana przez National Institutes of Health Grants R01 EB000712, R01 EB008085, R01 CA134539, U54 CA136398 i 5P60 DK02057933. Prof. Lihong V. Wang ma udziały finansowe w Microphotoacoustics, Inc. i Endra, Inc., które jednak nie wspierały tych prac.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Domowy akustyczno-optyczny łącznik wiązki:
pryzmat kątowyEdmund ScientificNT32-545
pryzmat romboidalnyEdmund ScientificNT49-419
olej silikonowyClearco Products1000cSt
System OR-PAMMikrofotoakustyka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt. Lett. 33, 929-931 (2008).
  2. Zhang, C., Maslov, K., Wang, L. V. Subwavelength-resolution label-free photoacoustic microscopy of optical absorption in vivo. Opt. Lett. 35, 3195-3197 (2010).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. V. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE. Trans. Biomed. Eng. 57, 2576-2578 (2010).
  4. Jiao, S., Xie, Z., Zhang, H. F., Puliafito, C. A. Simultaneous multimodal imaging with integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt. Lett. 34, 2961-2963 (2009).
  5. Hu, S., Maslov, K., Tsytsarev, V., Wang, L. V. Functional transcranial brain imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. J. Biomed. Opt. 14, 040503-040503 (2009).
  6. Hu, S., Yan, P., Maslov, K., Lee, J. M., Wang, L. V. Intravital imaging of amyloid plaques in a transgenic mouse model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt. Lett. 34, 3899-3901 (2009).
  7. Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free Photoacoustic Ophthalmic Angiography. Opt. Lett. 35, 1-3 (2010).
  8. Jiao, S. L., Jiang, M. S., Hu, J. M., Fawzi, A., Zhou, Q. F., Shung, K. K., Puliafito, C. A., Zhang, H. F. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt. Express. 18, 3967-3972 (2010).
  9. Oladipupo, S., Hu, S., Santeford, A., Yao, J., Kovalski, J. R., Shohet, R., Maslov, K., Wang, L. V., Arbeit, J. M. Conditional HIF-1 induction produces multistage neovascularization with stage-specific sensitivity to VEGFR inhibitors and myeloid cell independence. Blood. , Forthcoming Forthcoming.
  10. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. In vivo functional chronic imaging of a small animal model using optical-resolution photoacoustic microscopy. Med. Phys. 36, 2320-2323 (2009).
  11. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt. Lett. 36, 1134-1136 (2011).
  12. Wang, X., Pang, Y., Ku, G., Xie, X., Stoica, G., Wang, L. V. Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat. Biotechnol. 21, 803-806 (2003).
  13. Laser Institute of America, American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136. , American National Standards Institute Inc. New York, NY. (2007).
  14. Jacques, S. L., Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin . Oregon Medical Laser Center [Internet]. , Available from: http://omlc.ogi.edu/spectra/hemoglobin/index.html (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

In Vivo Microvascular ImagingOptical Absorption ContrastAcoustic Detection SystemLaser Excitation MethodUltrasonic Transducer AlignmentMulti Wavelength ImagingHemoglobin Oxygen SaturationTotal Hemoglobin ConcentrationBiomedical Photoacoustics

Powiązane artykuły