Myszie kompletne model stazy w zakrzepicy żyły głównej dolnej pozwala na uzyskanie mierzalnych ilości tkanki ściany żyły oraz zakrzepu. Model ten okazał się użyteczny w ocenie oddziaływań między ścianą żyły a zakrzepem zamykającym światło naczynia oraz w analizie przejścia od stanu ostrego do chronicznego stanu zapalnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Myszy w całkowitym modelu zastoju zakrzepicy żyły głównej dolnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakrzepica żylna (VTE) obejmuje zarówno zakrzepicę głęboką żył (DVT), jak i zatorowość płucną (PE). W Stanach Zjednoczonych (U.S.) wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności sprawiają, że VTE stanowi poważny problem zdrowotny 1-2. Po chorobach serca i udarach, VTE jest trzecią najczęstszą chorobą naczyniową 3. Szacuje się, że w samych Stanach Zjednoczonych każdego roku choruje 900 000 osób, a rocznie odnotowuje się 300 000 zgonów 3. Niezbędny jest wiarygodny model zwierzęcy in vivo do badania mechanizmów tej choroby.
Model całkowitego zastoju w żyle głównej dolnej u myszy w zakrzepicy wykazuje szereg zalet. Model mysi umożliwia podawanie bardzo małych objętości substancji testowych o ograniczonej dostępności, co drastycznie redukuje koszty. Najbardziej obiecująca jest możliwość wykorzystania myszy z nokautem genów, co pozwala na dokładne określenie funkcji specyficznych czynników zapalnych i krzepnięcia. Obecne metody analizy molekularnej umożliwiają ilościowe oznaczanie składników ściany żyły, zakrzepu, krwi pełnej oraz osocza. Głównym problemem związanym z tym modelem są jednak ograniczenia operacyjne wynikające z rozmiaru oraz kruchość naczyń. Ponadto, ze względu na niewielką masę próbek IVC (średnio 0,005 g), konieczne jest zwiększenie liczby zwierząt w celu przeprowadzenia dokładnej analizy statystycznej tkanek, zakrzepów i krwi w badaniach takich jak polimeraza łańcuchowa w czasie rzeczywistym (RT-PCR), western blot, test immunoenzymatyczny (ELISA), zymografia, analiza komórkowa ściany żyły i zakrzepu oraz analizy krwi pełnej i osocza 4-8.
Główną wadą modelu stazy jest fakt, że brak przepływu krwi ogranicza maksymalny efekt działania podawanych systemowo środków terapeutycznych na zakrzep i ścianę żyły.
Protokół
1. Procedury znieczulania myszy
- Zwierzęta wyjmuje się z klatki i umieszcza w komorze do przedoperacyjnej indukcji znieczulenia w celu indukcji gazowej przy użyciu 5% isofluranu i 100% tlenu, przy przepływie 0,5 liters per minute (sterowanym przez parowar).
- Myszy są sedowane w komorze indukcyjnej, po czym wyjmuje się je z komory i goli brzuch od strony brzusznej za pomocą strzyżarki elektrycznej; jeśli stosowany jest depilator chemiczny, zwierzęta pozostają w komorze (1min).
- Podczas trwania sedacji zwierzęta są ważone, a ich oczy smarowane sterylną maścią oftalmiczną. Następnie, w znieczuleniu ogólnym z użyciem isofluranu i tlenu, są one kładzione na plecach na urządzeniu grzewczym z cyrkulacją ciepłej wody i wyposażone w maskę nosową. W tym momencie przepływ tlenu jest zmniejszany do 0,2 liters per minute.
- Brzuch spryskuje się roztworem chlorheksydyny (diactan chlorheksydyny działa szybko bakteriobójczo i długotrwale), a następnie przeciera sterylną gazą trzy razy lub do momentu oczyszczenia pola operacyjnego.
2. Procedury mikrochirurgiczne i rekonwalescencja u myszy
- Za pomocą nożyczek irydowych wykonuje się nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej brzucha (2cm) przez skórę i ścianę brzucha, odsłaniając jamę brzuszną. Gazę 2x2in nasączoną sterylną solą fizjologiczną wykorzystuje się do odsunięcia jelit na lewą stronę zwierzęcia. Stosuje się stabilizator dla myszy, co umożliwia wizualizację żyły głównej dolnej (IVC).
- W tym momencie, przez resztę procedury chirurgicznej, stosuje się poziom utrzymania anestezji: 2% izofluranu i 100% tlenu przy przepływie 0,2 liters/min.
- Rozdzielanie tępe przeprowadza się przy użyciu sterylnego aplikatora w formie wymazówki oraz bardzo delikatnych, półzakrzywionych pęset tkankowych typu irydowego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas manipulowania tkankami myszy, ponieważ są one niezwykle kruche. Po wejściu do jamy brzusznej należy użyć gazy 4x4in nasączonej sterylną solą fizjologiczną, aby odsunąć i wyeksponować jelita na sterylnym obłożeniu, co umożliwi wizualizację IVC.
- Wszystkie tylne odgałęzienia IVC, od żył nerkowych do bifurkacji biodrowej, są kauteryzowane, natomiast odgałęzienia boczne są podwiązywane nieaktywnym szwem z prolenu 7-0.
- Żyłę IVC oddziela się od aorty, tuż poniżej żył nerkowych. Do podwiązania IVC stosuje się prolen 7-0.
- Miejsce laparotomii zamyka się dwuwarstwowo. W naszym laboratorium do zamknięcia ściany brzucha stosuje się syntetyczny szew vicryl 5-0 w szwie ciągłym. Do zamknięcia skóry używa się kleju skórnego. Brak jest zewnętrznych szwów wymagających usunięcia.
- Myszy są następnie przekładane do indywidualnych klatek, obserwowane pooperacyjnie (od 45 minut do 2 godzin) pod lampą grzewczą (minimalna odległość od klatki – 24 inches), a następnie wracają do swoich pierwotnych klatek zbiorczych. Można stosować leki przeciwbólowe i przeciwzapalne, o ile nie zakłóca to celu badania. Wymagane jest naukowe uzasadnienie zaniechania podawania leków przeciwbólowych oraz zgoda weterynaryjna i ICUCA. W naszym laboratorium ustalono, że Buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg SQ jest doskonałym środkiem przeciwbólowym przed i po operacji u myszy. Dodatkowo, w sytuacjach, gdy systemowe leki przeciwbólowe mogą zakłócić wyniki doświadczenia, w miejsce nacięcia można podać Lidokainę w dawce 4mg/kg (0,4 ml/kg roztworu 1%).
- Zwierzęta z grup kontrolnych (sham) z każdej grupy eksperymentalnej przechodzą powyższą dyssekcję służącą dostępowi chirurgicznemu, z wyjątkiem tego, że IVC oraz jakiekolwiek odgałęzienia odprowadzające nie są podwiązywane ani kauteryzowane.
- Eutanazja jest przeprowadzana zgodnie z zaleceniami określonymi w wytycznych American Veterinary Medical Association Guidelines on Euthanasia dla gryzoni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Myszowy model całkowitej stazy w zakrzepicy żyły głównej dolnej może być przeprowadzany na wielu szczepach myszy w różnym wieku. Model ten najlepiej sprawdza się u myszy o masie co najmniej 20 g. Ten zwierzęcy model zakrzepicy żylnej pozwala badaczom na analizę oddziaływań zapalnych pomiędzy ścianą żyły a zamykającym jej zakrzepem żylnym. Z naszego doświadczenia wynika, że w celu uzyskania istotności statystycznej między grupami w zakresie masy zakrzepów, liczby komórek zapalnych w ścianie żyły, zawartości białek w ścian...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Gaz izofluranowy | |||
| Nici Prolene 7-0 | |||
| Nici Vicryl 5-0 | |||
| Klej tkankowy do skóry | |||
| Lubrykant do oczu | |||
| Roztwór Nolvasan lub roztwór bakteriostatyczny | |||
| Stereomikroskop | |||
| MediCapture | |||
| Patyczki bawełniane | |||
| Gaza 2x2 | |||
| Mata grzewcza | |||
| Aparat do znieczulania | |||
| Sterylizator narzędzi z szklanymi kuleczkami | |||
| Mikrochirurgiczne instrumenty | |||
| Stabilizatory brzuszne |
Bibliografia
- Naess, I. A., Christiansen, S. C., Romundstad, P., Cannegieter, S. C., Rosendaal, F. R., Hammerstrom, J. Incidence and mortality of venous thrombosis: a population-based study. J Thromb Haemost. 5, 692-699 (2007).
- White, R. H., Keenan, C. R. Effects of race and ethnicity on the incidence of venous thromboembolism. Thromb Res. 123, Suppl 4. S11-S17 (2009).
- Heit, J. A. The epidemiology of venous thromboembolism in the community. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, 370-372 (2008).
- Henke, P. K., Varga, A., De, S. Deep vein thrombosis resolution is modulated by monocyte CXCR2-mediated activity in a mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 1130-1137 (2004).
- McDonald, A. P., Meier, T. R., Hawley, A. E. Aging is associated with impaired thrombus resolution in a mouse model of stasis induced thrombosis. Thromb Res. 125, 72-78 (2010).
- Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
- Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
- Myers, D. D. J. r, Rectenwald, J. E., Bedard, P. W. Decreased venous thrombosis with an oral inhibitor of P selectin. J Vasc Surg. 42, 329-336 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
