Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przesiewanie wysokoprzepustowe (HTS) jest potężnym podejściem do identyfikacji chemicznych modulatorów procesów biologicznych. Jednakże wiele związków zidentyfikowanych w badaniach przesiewowych z wykorzystaniem modeli kultur komórkowych okazuje się często toksycznych lub farmakologicznie nieaktywnych in vivo1-2. Przesiewanie w modelach całego organizmu może pomóc uniknąć tych pułapek i usprawnić drogę do opracowania leków.
C. elegans jest wielokomórkowym organizmem modelowym, który doskonale nadaje się do HTS. Jest on mały (<1 mm) i może być w sposób ekonomiczny hodowany oraz dozowany w cieczach. C. elegans jest również jednym z najbardziej podatnych na badania eksperymentalne modeli zwierzęcych, umożliwiającym szybką i szczegółową identyfikację mechanizmu działania leku3.
Opisujemy protokół hodowli i dozowania fluorescencyjnych szczepów C. elegans do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych, które zmieniają ekspresję konkretnego genu. Duża liczba zsynchronizowanych rozwojowo nicieni jest hodowana w kulturze płynnej, zbierana, płukana i zawieszana w określonym zagęszczeniu. Następnie nicienie są przenoszone do czarnych płytek 384-dołkowych o płaskim dnie za pomocą perystaltycznego dozownika cieczy. Do dołków z nicieniami można dodać małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbki testowe (np. wodę, żywność lub glebę). Intensywność fluorescencji in vivo w czasie rzeczywistym jest mierzona za pomocą mikroplatego czytnika fluorescencji. Metoda ta może zostać dostosowana do każdego indukowalnego genu u C. elegans, dla którego dostępny jest odpowiedni reporter. Wiele indukowalnych szlaków transkrypcyjnych związanych ze stresem i rozwojem jest dobrze zdefiniowanych u C. elegans, a dla wielu z nich istnieją już transgeniczne szczepy reporterowe GFP4. W połączeniu z odpowiednimi reporterami transgenicznymi nasza metoda może być wykorzystana do przesiewania modulatorów szlaków lub do opracowywania solidnych testów biosensorowych dla zanieczyszczeń środowiskowych.
Prezentujemy nasz protokół hodowli i dozowania C. elegans na przykładzie opracowanego przez nas testu HTS do monitorowania czynnika transkrypcyjnego SKN-1 u C. elegans. SKN-1 oraz jego ssaczy homolog Nrf2 aktywują geny cytoprotekcyjne podczas stresu oksydacyjnego i ksenobiotycznego5-10. Nrf2 chroni ssaki przed licznymi schorzeniami związanymi z wiekiem, takimi jak nowotwory, neurodegeneracja i przewlekłe stany zapalne, i stał się głównym celem chemioterapii11-13. Nasz test opiera się na transgenicznym reporterze GFP dla genu docelowego SKN-1 gst-414, który koduje S-transferazę glutationową6. Reporter gst-4 jest również biosensorem dla substancji ksenobiotycznych i utleniających aktywujących SKN-1 i może być wykorzystywany do wykrywania niskich stężeń zanieczyszczeń, takich jak akryloamid i metylortęć15-16.
Protokół
1. Przygotowanie bakteryjnej pożywki dla nicieni
Dzień 1
- Do 500 ml pożywki Terrific broth uzupełnionej o 50 μg/ml streptomycyny dodać 5 ml nasyconej kultury bakteryjnej E. coli OP50 i inkubować przez noc w inkubatorze wytrząsającym (225 rpm) w temperaturze 37°C.
Dzień 2
- Podziel nocną hodowlę bakteryjną do dziesięciu probótek o pojemności 50 ml i odwiruj bakterie w wirówce chłodzącej przy 2,500 rcf przez 20 minut.
- Odlej pożywkę LB i resuspender każdy osad bakteryjny w 10 ml ciekłego podłoża do wzrostu nicieni (NGM). Wstrząsaj poziomo w inkubatorze z wytrząsaniem przez 15 minut, aby resuspender bakterie. Aby przygotować bufor NGM, dodaj 3 g NaCl do 1 L wody dejonizowanej i wysterylizuj w autoklawie. Ochłodź do 55°C i dodaj kolejno następujące sterylne roztwory: 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4 oraz 25 ml 1 M fosforanu potasu, pH 6,0.
- Odwiruj hodowlę bakteryjną w wirówce chłodzącej przy 2,500 rcf przez 20 minut.
- Odlej bufor NGM i zważ osad bakteryjny.
- Dodaj taką samą objętość buforu NGM, aby resuspender osady, odmierz 3 ml koncentratu bakteryjnego do probótek 15 ml i przechowuj w temperaturze -20°C.
2. Wielkoskalowa hodowla płynna C. elegans
Używamy linii transgenicznej VP596 (dvIs19[pAF15(gst-4::GFP::NLS);vsIs33[dop-3::RFP]) zawierającej dwa konstrukty fluorescencyjne: Pgst-4::GFP14 do monitorowania aktywności SKN-1 oraz Pdop-3::RFP17 służący jako standard do normalizacji liczby nicieni.
Dzień 1
- Wymieszać 150 ml buforu NGM, 1,5 ml pożywki LB, 150 μl cholesterolu o stężeniu 5 mg/ml (w etanolu) oraz 75 μl streptomycyny o stężeniu 100 mg/ml. Mieszaninę wysterylizować przez filtrację i przelać do sterylnej kolby o pojemności 1 litra.
UWAGA: Dodanie 1% pożywki LB do buforu NGM zapobiega przywieraniu nicieni do szkła i tworzyw sztucznych, a ilość ta jest niewystarczająca do wspierania wzrostu bakterii. - Zsynchronizować nicienie, stosując standardową procedurę z użyciem podchlorynu18. Do 0,5 ml nicieni z jajami można przetworzyć w jednej probówce 15 ml z 5 ml roztworu podchlorynu (3,75 ml sterylnej wody, 1 ml domowego wybielacza oraz 250 μl 10 N NaOH). Uwolnione jaja przemyć sterylną wodą i ponownie zawiesić w 10 ml buforu NGM.
- Próbkę jaj rozcieńczyć 100-krotnie w buforze NGM (np. 100 μl w 10 ml) i policzyć liczbę jaj w trzech oddzielnych alikwotach o objętości 5 μl. Średnią liczbę pomnożyć przez 200 000 (czynnik rozcieńczenia 100 x 2 000), aby oszacować całkowitą liczbę jaj.
- Do kolby z buforem NGM dodać od 200 000 do 2 milionów jaj i inkubować kulturę przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm w temperaturze 20°C.
Dzień 2
- Przynajmniej 16 h po dodaniu jaj do kolby, za pomocą sterylnej pipety serologicznej pobrać około 0,5 ml zawiesiny kultury nicieni. Nanieść trzy krople po 5 μl na sterylną pokrywkę szalki Petriego. Umieścić pokrywkę w zamrażarce w temperaturze -20°C na 1-2 minuty, aby sparaliżować nicienie. Obliczyć średnią liczbę żywych, wyklutych nicieni w 5 μl, a następnie pomnożyć tę wartość przez 30 000 (150 ml/5 μl), aby oszacować całkowitą liczbę wyklutych nicieni.
- Rozmrozić probówkę z mrożoną kulturą bakterii OP50 (Protokół 1.6) i dodać 3 ml 50% OP50 do kultury nicieni na każde 500 000 wyklutych nicieni. Inkubować kolbę przy wytrząsaniu z prędkością 100 rpm w temperaturze 20°C. Nicienie rozwiną się do stadium larw L4 i młodych osobników dorosłych w ciągu około 51 godzin. Wartość OD600 bakterii na początku powinna wynosić około 2,200. Monitorować ilość bakterii za pomocą absorbancji i dodawać kolejne porcje, jeśli wartość OD600 spadnie poniżej 0,900.
3. Zbieranie i dozowanie nicieni
Dzień 4
- Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieś około 0.5 ml zawiesiny hodowli nicieni na standardową płytkę z agarem NGM. Obejrzyj nicienie pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że większość z nich to larwy L4 lub młode dorosłe osobniki. Larwy L4 będą miały jasną plamkę na stronie brzusznej w środkowej części ciała. Młode dorosłe osobniki będą nieco większe i nie będą miały tej plamki.
- Przelej hodowlę nicieni do sterylnych probówek 50 ml i umieść probówki w statywie na blacie laboratoryjnym. Pozostaw nicienie do osadzenia na około 10 minut. Usuń nadsącz poprzez aspirację lub pipetowanie.
UWAGA: Ten krok może być istotny w celu usunięcia niewyklutych jaj lub nicieni, które nie rozwinęły się prawidłowo, ponieważ osiadają one wolniej niż larwy L4 i młode dorosłe osobniki. - Zbierz wszystkie nicienie do jednej probówki 50 ml i przemyj 3-4 razy buforem NGM z 1% bulionem LB (NGM+LB), aby usunąć bakterie.
UWAGA: Najlepiej wykonać to w wirówce z koszykami wahadłowymi, wirowując nicienie przy 500 rcf przez 30 sec i zastępując nadsącz świeżym buforem NGM+LB. - Po przemyciu dopełnij probówkę buforem NGM+LB do 50 ml i przelej do specjalnej kolby do dozowania nicieni. Dodaj mały magnes mieszający i mieszaj, aby utrzymać nicienie w zawiesinie. Policz liczbę nicieni w trzech kroplach o objętości 5 μl, zgodnie z powyższymi instrukcjami. Rozcieńczaj buforem NGM+LB, aż uzyskasz 12-15 nicieni na kroplę 5 μl (˜2.5-3.0 nicieni/μl).
UWAGA: Do wypełnienia przestrzeni martwej kolby dozującej i kasety dozownika potrzeba minimum około 20 ml (60 000 nicieni). Każda płytka 384-dołkowa wymaga około 35 000 nicieni lub 11.5 ml zawiesiny nicieni. - Załaduj kasetę dozującą 10 μl i wysterylizuj ją poprzez przepłukanie 70% etanolem. Wypłucz etanol, przepłukując kasetę sterylną wodą.
- Włóż koniec kasety dozującej do kolby tak, aby znajdował się tuż nad magnesem mieszającym, nie zakłócając jego ruchu. Upewnij się, że nicienie pozostają w zawiesinie w całej objętości kolby. Zaprogramuj dozownik na niską prędkość z 2 wstępnymi impulsami. Przepłucz układ i przepuść co najmniej 10 ml zawiesiny nicieni. Napełniaj płytki szybko w miarę potrzeb, aby zapobiec osiadaniu nicieni w rurkach.
- Zapieczętuj płytki przepuszczalną taśmą.
- Umieść płytki na platformie wytrząsowej w inkubatorze w temperaturze odpowiedniej dla danego testu. Nie układaj płytek w stosy.
4. Analiza fluorescencyjna
- Umieść docelową płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studni z zastosowaniem odpowiedniej długości fali emisji i wzbudzenia (Filtry dla naszego testu: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
- Oblicz stosunek GFP/RFP i znormalizuj go względem odczytów ze studni kontrolnych (bez związku aktywującego), aby określić dokładną krotność różnicy w intensywności fluorescencji wynikającą z poszczególnych zabiegów.
5. Reprezentatywne wyniki:
Nasza metoda analizy SKN-1 wykorzystuje szczep z chromosomowo zintegrowanym podwójnym reporterem (VP596). Jak pokazano na Rysunku 1, liczba nicieni jest silnie skorelowana z dozowaną objętością. Jak pokazano na Rysunkach 2A i 2B, całkowita fluorescencja GFP i RFP na studzienkę jest wysoce powtarzalna pomiędzy studzienkami na płytce 384-dołkowej. Jak pokazano na Rysunku 2C, fluorescencja nieindukowanego Pgst-4::GFP jest liniowo skorelowana z Pdop-3::RFP w obrębie 384 studzienek. Po wyrażeniu w postaci stosunku GFP/RFP, fluorescencja staje się wysoce powtarzalna pomiędzy studzienkami na płytce 384-dołkowej (porównaj współczynnik zmienności z Rysunku 2D z Rysunkiem 2A), co wykazuje zdolność reportera Pdop-3::RFP do redukcji zmienności. Jak pokazano na Rysunku 3, indukcja GFP względem RFP za pomocą ksenobiotyku aktywującego SKN-1 (38 μM juglonu) jest silna i wysoce powtarzalna na całej płytce 384-dołkowej.
Rycina 1. Liczba nicieni w funkcji objętości dozowanej. Nicienie rozcieńczono do stężenia około 2/μl i naniesiono na płytkę 24-dołkową w celu ręcznego przeliczenia przy użyciu stereomikroskopu. N = 8 dołków na objętość.
Rysunek 2. Całkowita fluorescencja nicieni naniesionych na płytkę 384-dołkową jest powtarzalna. Nicienie rozcieńczono do stężenia około 2,5/μl, a następnie 30 μl naniesiono do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Fluorescencja GFP (A) i RFP (B) we wszystkich dołkach wykazała współczynnik zmienności poniżej 9%. (C) Fluorescencja GFP jest silnie skorelowana z fluorescencją RFP. (D) Obliczenie stosunku GFP do RFP zredukowało współczynnik zmienności do poziomu poniżej 6%. (A, B i D) Linie ciągłe oznaczają średnie, a linie przerywane oznaczają trzy odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej.
Rycina 3. Aktywacja Pgst-4::GFP jest silna i powtarzalna. Do wszystkich studzienek płytki 384-dołkowej naniesiono około 75 nicieni w stadium L4, a do co drugiej kolumny dodano 38 μM juglonu. Fluorescencję GFP i RFP zmierzono po 21 h inkubacji. Średnie względne stosunki fluorescencji dla wszystkich studzienek kontrolnych (1,0) i z juglonem (8,9) zaznaczono liniami ciągłymi. Trzy odchylenia standardowe powyżej średniej kontrolnej i poniżej średniej dla juglonu zaznaczono liniami przerywanymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy metodę hodowli i dozowania dużych liczb transgenicznych nicieni. Sprzęt używany do hodowli nicieni jest standardowy dla laboratoriów zajmujących się klonowaniem molekularnym, a urządzenia do obsługi cieczy i pomiarów fluorescencji są standardowe dla laboratoriów przetwarzających duże liczby mikropłytek. Inne metody dozowania dużych liczb żywych C. elegans wymagają drogiego sprzętu do sortowania cząstek19. Test Pgst-4::GFP może być wykorzystany do przesiewania małocząsteczkowych ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
C. elegans transgeny zostały udostępnione przez Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Niniejsza praca była wspierana przez grant NIH R21 NS0667678-01 przyznany KS. Wszyscy autorzy uczestniczyli w gromadzeniu, analizie i interpretacji danych. CKL, KS i KPC uczestniczyli w pisaniu i redagowaniu manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| pożywka LB | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Pożywka Terrific Broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek Synergy HT | BioTek | Filtry: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| Dozownik MicroFlo Select | BioTek | ||
| Kolba do dozowania nicieni | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Złożone na zamówienie(352) 284-2531 | |
| mikropłytki 384-dołkowe | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Oddychająca taśma uszczelniająca | Nalge Nunc international | 241205 | |
| Juglon (5-hydroksy-p-naftochinon) | Acros Organics | 121640010 | Juglon rozpuszcza się w DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans szczep transgeniczny | Autor’laboratorium | VP596 | Pgst-4::GFP i Pdop-3::RFP |
Bibliografia
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- WormBase [Internet]. , Available from: http://www.wormbase.org (2012).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , Forthcoming (2009).
- Park, S. -K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. C. elegans, a Practical Guide. , Oxford University Press. (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
