Wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biodetekcja z fluorescencyjnymi szczepami C. elegans

Summary

Opisano procedurę hodowli i dystrybucji szczepów C. elegans wyrażających fluorescencyjne białka reporterowe, która nie wymaga drogiego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować do wielu indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biodetekcji zanieczyszczeń.

Abstract

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) to skuteczne podejście do identyfikacji chemicznych modulatorów procesów biologicznych. Jednak wiele związków zidentyfikowanych w badaniach przesiewowych przy użyciu modeli hodowli komórkowych często okazuje się toksycznych lub farmakologicznie nieaktywnych in vivo^1-2. Badania przesiewowe na całych modelach zwierzęcych mogą pomóc uniknąć tych pułapek i usprawnić ścieżkę do opracowania leku.

C. elegans to wielokomórkowy organizm modelowy dobrze nadający się do HTS. Jest mały (<1 mm) i może być ekonomicznie hodowany i dozowany w płynach. C. elegans jest również jednym z najbardziej podatnych na badania eksperymentalnie modeli zwierzęcych, pozwalającym na szybką i szczegółową identyfikację sposobu działania leku³.

Opisujemy protokół hodowli i dystrybucji fluorescencyjnych szczepów C. elegans do wysokoprzepustowego badania przesiewowego bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych, które zmieniają ekspresję określonego genu. Duża liczba rozwojowo zsynchronizowanych robaków jest hodowana w płynnej kulturze, zbierana, myta i zawieszana w określonej gęstości. Robaki są następnie dodawane do czarnych, płaskodennych 384-dołkowych płytek za pomocą dozownika płynu perystaltycznego. Małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbek testowych (np. wody, żywności lub gleby) można dodawać do studni z robakami. In vivo intensywność fluorescencji w czasie rzeczywistym mierzy się za pomocą czytnika mikropłytek fluorescencyjnych. Metodę tę można dostosować do dowolnego indukowalnego genu u C. elegans, dla którego dostępny jest odpowiedni reporter. Wiele indukowalnych szlaków stresowych i rozwojowych szlaków transkrypcyjnych jest dobrze zdefiniowanych u C. elegans, a dla wielu z nich istnieją już transgeniczne szczepy reporterowe GFP⁴. W połączeniu z odpowiednimi reporterami transgenicznymi, nasza metoda może być wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem modulatorów szlaku lub do opracowania solidnych testów biosensorów pod kątem zanieczyszczeń środowiskowych.

Demonstrujemy naszą hodowlę C. elegans i protokół dozowania za pomocą testu HTS, który opracowaliśmy do monitorowania czynnika transkrypcyjnego SKN-1 C. elegans cap 'n' collar. SKN-1 i jego ssaczy homolog Nrf2 aktywują geny cytoprotekcyjne podczas stresu oksydacyjnego i ksenobiotycznego^5-10. Nrf2 chroni ssaki przed licznymi zaburzeniami związanymi z wiekiem, takimi jak rak, neurodegeneracja i przewlekłe stany zapalne i stał się głównym celem chemioterapii^11-13. Nasz test opiera się na transgenicznym reporterze GFP dla docelowego genu SKN-1 gst-4 ¹⁴, który koduje transferazę glutationu-s⁶. Reporter gst-4 jest również biosensorem ksenobiotycznych i utleniających substancji chemicznych, które aktywują SKN-1 i mogą być używane do wykrywania niskich poziomów zanieczyszczeń, takich jak akryloamid i metylortęć^15-16.

Protocol

1. Przygotowanie pokarmu dla robaków bakteryjnych

Dzień 1

1. Dodać 5 ml nasyconego E. Kultura bakteryjna coli OP50 do 500 ml Wspaniały bulion uzupełniony 50 μg/ml streptomycyny i rosnący w inkubatorze wstrząsającym (225 obr./min) przez noc w temperaturze 37°C.

Dzień 2

2. Podziel nocną kulturę bakteryjną na dziesięć probówek o pojemności 50 ml i odwiruj bakterie w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 2,500 rcf przez 20 minut.
3. Zdekantować bulion LB i ponownie zawiesić każdą osadę bakteryjną w 10 ml płynnej pożywki hodowlanej nicieni (NGM). Potrząsaj poziomo w wytrząsarce podłogowej przez 15 minut, aby ponownie zawiesić bakterie. Aby zrobić bufor NGM, dodaj 3 g NaCl do 1 l wody dejonizowanej i autoklawu. Schłodzić do temperatury 55°C i dodać kolejno następujące sterylne roztwory: 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M_MgSO4 i 25 ml 1 M fosforanu potasu o pH 6,0.
4. Odwirować kulturę bakteryjną w wirówce z chłodzeniem w temperaturze 2,500 rcf przez 20 minut.
5. Zdekantować bufor NGM i zważyć osad bakteryjny.
6. Dodać równą objętość buforu NGM w celu ponownego zawieszenia granulek, porcjować 3 ml koncentratu bakterii do probówek o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze -20°C.

2. Płynna kultura C. elegans na dużą skalę

Używamy linii transgenicznej VP596 (dvIs19[pAF15(gst-4::GFP::NLS)]; vsIs33[dop-3::RFP]) przenoszący dwa konstrukty fluorescencyjne: Pgst-4::GFP¹⁴ do monitorowania aktywności SKN-1 i Pdop-3::RFP¹⁷ służący jako standard normalizacji liczby robaków.

Dzień 1

1. Wymieszaj 150 ml buforu NGM, 1,5 ml bulionu LB, 150 μl 5 mg/ml cholesterolu (w etanolu) i 75 μl 100 mg/ml streptomycyny. Przefiltrować-wysterylizować mieszaninę i dodać do sterylnej kolby o pojemności 1 litra.
   UWAGA: Dodanie bulionu 1% LB do bufora NGM pomaga zapobiegać przywieraniu robaków do szkła i wyrobów plastikowych, ale ta ilość nie wystarczy, aby wspomóc rozwój bakterii.
2. Zsynchronizuj robaki ze standardową procedurą podchlorynu¹⁸. W jednej probówce o pojemności 15 ml z 5 ml roztworu podchlorynu (3,75 ml sterylnej wody, 1 ml domowego wybielacza i 250 μl 10 N NaOH) można przetworzyć do 0,5 ml robaków grawitacyjnych. Uwolnione jaja umyć sterylną wodą i ponownie zawiesić w 10 ml buforu NGM.
3. Rozcieńczyć próbkę jaj 100-krotnie w buforze NGM (np. 100 μl w 10 ml) i policzyć liczbę jaj w trzech oddzielnych podwielokrotnościach o objętości 5 μl. Pomnóż średnią liczbę przez 200 000 (współczynnik rozcieńczenia 100 x 2 000), aby oszacować całkowitą liczbę jaj.
4. Dodać 200 000 do 2 milionów jaj do kolby z buforem NGM i wstrząsnąć kulturą z prędkością 100 obr./min w temperaturze 20°C.

Dzień 2

5. Co najmniej 16 godzin po dodaniu jaj do kolby należy użyć sterylnej pipety serologicznej w celu usunięcia około 0,5 ml zawieszonej kultury robaków. Odpipetować trzy krople po 5 μl na sterylną pokrywkę szalki Petriego. Umieść pokrywkę w zamrażarce w temperaturze -20°C na 1-2 minuty, aby sparaliżować robaki. Policz średnią liczbę żywych wyklutych robaków na 5 μl, a następnie pomnóż przez 30 000 (150 ml/5 μl), aby oszacować całkowitą liczbę wyklutych robaków.
6. Rozmrozić probówkę z zamrożoną kulturą bakterii OP50 (Protokół 1.6) i dodać 3 ml 50% OP50 do kultury robaków na 500 000 wyklutych robaków. Wstrząsnąć kolbą z prędkością 100 obr./min w temperaturze 20°C. Robaki rozwiną się w larwy L4 i młode dorosłe osobniki w ciągu około 51 godzin. Poziom OD600 bakterii powinien wynosić na początku około 2.200. Monitoruj ilość bakterii przez absorbancję i dodaj więcej, jeśli OD 600 spadnie poniżej 0,900.

3. Zbieranie i wydawanie robaków

Dzień 4

1. Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieść około 0,5 ml zawieszonej kultury robaków na standardową płytkę agarową NGM. Zobacz robaki za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby upewnić się, że większość z nich to larwy L4 lub młode dorosłe osobniki. Larwy L4 będą miały brzuszną wyraźną plamę pośrodku ciała. Młodzi dorośli będą nieco więksi i nie będą mieli wyraźnego miejsca.
2. Wlej kulturę robaków do sterylnych probówek o pojemności 50 ml i umieść probówki w stojaku na probówki na blacie. Pozwól robakom osiąść przez około 10 minut. Usunąć supernatant przez aspirację lub pipetowanie.
   UWAGA: Ten krok może być ważny, aby usunąć niewyklute jaja lub robaki, które się nie rozwinęły, ponieważ będą osiadać wolniej niż larwy L4 i młode dorosłe osobniki.
3. Zbierz wszystkie robaki do jednej probówki o pojemności 50 ml i przemyj buforem NGM z bulionem 1% LB (NGM + LB) 3-4 razy, aby usunąć bakterie.
   UWAGA: Najlepiej zrobić to w wirówce z wahadłowym wiadrem, zbierając robaki w temperaturze 500 rcf przez 30 sekund i zastępując supernatant świeżym buforem NGM+LB.
4. Po umyciu napełnij probówkę buforem NGM+LB do 50 ml i wlej do niestandardowej kolby dozującej ślimaki. Dodaj mały pręt mieszający i wymieszaj, aby robaki pozostały zawieszone. Policz liczbę robaków w trzech kroplach po 5 μl, jak wskazano powyżej. Rozcieńczyć NGM+LB, aż uzyskasz 12-15 robaków na kroplę 5 μl ( ̃2,5-3,0 robaków / μl).
   UWAGA: Do wypełnienia martwej przestrzeni kolby dozującej i kasety dozownika potrzeba co najmniej około 20 ml (60 000 robaków). Każda płytka 384-dołkowa wymaga około 35 000 robaków lub 11,5 ml zawieszonych robaków.
5. Załaduj kasetę dozującą o pojemności 10 μl i wysterylizuj, zalewając 70% etanolem. Wypłucz etanol, zalewając go sterylną wodą.
6. Włóż koniec kasety dozującej do kolby tak, aby znajdował się tuż nad mieszadłem, nie zakłócając jego ruchu. Upewnić się, że robaki pozostają zawieszone w całej kolbie. Zaprogramuj dozownik tak, aby dozował z niską prędkością za pomocą 2 impulsów wstępnych. Zalać i uruchomić co najmniej 10 ml zawieszonych robaków. W razie potrzeby szybko napełnij płyty, aby zapobiec osadzaniu się robaków w rurce.
7. Uszczelnij płytki oddychającą taśmą.
8. Umieścić płytki na platformie wibracyjnej w inkubatorze w temperaturze odpowiedniej dla testu. Nie układaj talerzy jeden na drugim.

4. Analiza fluorescencyjna

1. Umieść płytkę docelową w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji każdej studzienki o odpowiedniej długości fali emisji i wzbudzenia (Filtry do naszego testu: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em).
2. Oblicz stosunek GFP/RFP i znormalizuj z odczytami studzienek kontrolnych (bez związku aktywującego), aby określić dokładną różnicę krotności intensywności fluorescencji uzyskaną z poszczególnych zabiegów.

5. Reprezentatywne wyniki:

Nasz test SKN-1 wykorzystuje chromosomalnie zintegrowany podwójny szczep reporterowy (VP596). Jak pokazano na rysunku 1, liczba robaków jest dobrze skorelowana z dozowaną objętością. Jak pokazano na rysunkach 2A i 2B, całkowita fluorescencja GFP i RFP na studzienkę jest wysoce odtwarzalna od studni do studni na płytce 384-dołkowej. Jak pokazano na rysunku 2C, nieindukowana fluorescencja Pgst-4::GFP jest liniowo skorelowana z Pdop-3::RFP w 384 dołkach. Wyrażona jako stosunek GFP/RFP, fluorescencja staje się wysoce odtwarzalna od studni do studni na płytce 384-dołkowej (porównaj współczynnik zmienności z rysunku 2D do 2A), co pokazuje zdolność reportera Pdop-3::RFP do zmniejszania zmienności. Jak pokazano na rysunku 3, indukcja GFP w stosunku do RFP za pomocą ksenobiotyku aktywującego SKN-1 (juglon 38 μM) jest solidna i wysoce powtarzalna na płytce 384-dołkowej.

Rysunek 1. Liczba robaków w stosunku do objętości wydanej. Robaki rozcieńczono do około 2/μl i dozowano do 24-dołkowej płytki w celu ręcznego liczenia za pomocą mikroskopu stereoskopowego. N = 8 studzienek na objętość.

Rysunek 2. Całkowita fluorescencja robaków dozowanych do Płytka 384-dołkowa jest powtarzalna. Robaki rozcieńczono do około 2,5 μl i dozowano 30 μl do każdego dołka na płytce 384-dołkowej. GFP (A) i RFP (B) Fluorescencja wszystkich studni miała współczynnik zmienności poniżej 9%. (C) Fluorescencja GFP jest silnie skorelowana z fluorescencją RFP. D) Obliczanie stosunku zwykłej dobrej praktyki rolniczej do RFP zmniejszyło współczynnik zmienności do poziomu poniżej 6% (A, B i D) Linie ciągłe wskazują średnie, a linie przerywane oznaczają trzy odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej.

Rysunek 3. Aktywacja Pgst-4::GFP jest solidna i spójna. Około 75 robaków L4 zostało dozowanych do wszystkich studzienek na płytce 384-dołkowej, a 38 μM juglonu dodano do co drugiej kolumny. Fluorescencję GFP i RFP zmierzono po 21 godzinach inkubacji. Średnie względne współczynniki fluorescencji wszystkich studzienek kontrolnych (1.0) i studzienek juglonowych (8.9) są oznaczone liniami ciągłymi. Trzy odchylenia standardowe powyżej średniej kontrolnej i poniżej średniej juglonu są oznaczone liniami przerywanymi.

Discussion

Przedstawiamy metodę hodowli i dozowania dużej liczby nicieni transgenicznych. Sprzęt używany do hodowli robaków jest standardem dla laboratoriów wykonujących klonowanie molekularne, a sprzęt do obsługi cieczy i fluorescencji jest standardem dla laboratoriów przetwarzających dużą liczbę mikropłytek. Inne metody dozowania dużych ilości żywych C. elegans wymagają drogiego sprzętu do sortowania cząstek¹⁹. Test Pgst-4::GFP może być stosowany do badań przesiewowych w kierunku modulatorów małych...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bulion LB	Produkty Badawcze Międzynarodowa Corp.	L24066
Wspaniały bulion	Produkty Badawcze International Corp.	T15100
Synergy HT Wielomodowy czytnik mikropłytek	BioTek		Filtry: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em
Dozownik MicroFlo Select	BioTek
Kolba dozująca ślimaki	Southern Scientific Inc., Micanopy, FL		Zmontowane na zamówienie(352) 284-2531
384 mikropłytki	Greiner Bio-One	5678-1209
Oddychająca taśma uszczelniająca	Nalge Nunc international	241205
(5-hydroksy-p-naftoqinon)Juglone	Acros Organics	121640010	Juglone rozpuszcza się w DMSO
DMSO	Sigma-Aldrich	D-5879
C. elegans szczep transgeniczny	Autor' s laboratorium	VP596	Pgst-4::GFP i Pdop-3::RFP