Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Podsumowanie

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Streszczenie

Drobnoustroje znajdują się wszędzie – w powietrzu, glebie i ludzkim organizmie, a także na nieożywionych powierzchniach, takich jak blaty laboratoryjne i klawiatury komputerowe. Powszechność mikrobów sprawia, że w laboratorium istnieje ogromna liczba potencjalnych zanieczyszczeń. Aby zapewnić sukces eksperymentalny, należy zminimalizować liczbę zanieczyszczeń na sprzęcie i powierzchniach roboczych. Powszechnymi technikami w wielu badaniach z zakresu mikrobiologii są metody obejmujące pomiar i przenoszenie kultur zawierających komórki bakteryjne lub cząsteczki wirusowe. Aby wykonać te czynności bez kontaktu z niesterylnymi powierzchniami lub zanieczyszczenia sterylnych pożywek, wymagane jest: (1) przygotowanie sterylnej przestrzeni roboczej, (2) precyzyjne ustawienie i dokładny odczyt urządzeń do aseptycznego przenoszenia cieczy oraz (3) prawidłowe operowanie instrumentami, kolbami z kulturami, butelkami i probówkami w obrębie pola sterylnego. Opanowanie tych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Początkowo czynności powinny być wykonywane powoli, świadomie i w sposób kontrolowany, tak aby technika aseptyki stała się naturalnym nawykiem podczas pracy przy stole laboratoryjnym. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki pomiaru objętości przy użyciu pipet serologicznych i mikropipet w obrębie pola sterylnego stworzonego przez palnik Bunsena. Pomiarowane objętości wahają się od mikrolitrów (μl) do mililitrów (ml) w zależności od zastosowanego instrumentu. Przenoszone ciecze obejmują zazwyczaj sterylne buliony lub roztwory chemiczne, a także kultury bakterii i zawiesiny fagowe. Postępując zgodnie z tymi procedurami, studenci powinni być w stanie: •Pracować w polu sterylnym stworzonym przez płomień palnika Bunsena. •Używać pipet serologicznych bez naruszania sterylności instrumentu. •Pobierać ciecze za pomocą pipet serologicznych, precyzyjnie odczytując skalibrowane objętości poprzez dopasowanie menisku cieczy do kresek graduacyjnych na pipecie. •Zachować sterylność butelek z kulturami, kolb, probówek i odpowiadających im nakrętek podczas przenoszenia cieczy. •Zidentyfikować różne zastosowania plastikowych i szklanych pipet serologicznych. •Określić ograniczenia dokładności mikropipet. •Precyzyjnie i dokładnie ustawiać objętości na mikropipetach. •Wiedzieć, jak prawidłowo korzystać z pierwszego i drugiego stopnia zatrzymania tłoka w mikropipecie w celu pobrania i przeniesienia prawidłowych objętości.

Protokół

1. Przygotowanie sterylnego miejsca pracy

1. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur sterylizacji w obszarze roboczym, dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.
   • Pamiętaj o ponownym umyciu rąk za każdym razem, gdy podejrzewasz zanieczyszczenie w wyniku manipulacji eksperymentalnych.
2. Uprzątnij wszystkie materiały zagracające obszar roboczy na blacie laboratoryjnym. Wyjmij z pojemnika nasączoną chusteczkę dezynfekującą i przetrzyj cały obszar. Pozostaw środek dezynfekcyjny do odparowania – nie wycieraj do sucha!
   • Stosuj środki dezynfekcyjne takie jak alkohol (izopropanol lub 70% etanol) lub związki fenolowe (o-fenylfenol).
   • Aby zapobiec aerozolizacji, czyli powstawaniu drobnej mgiełki zawierającej komórki bakteryjne, oraz rozprzestrzenianiu się zanieczyszczeń mikrobiologicznych, unikaj dozowania środka dezynfekcyjnego z butelek z atomizerem.
   • Desykacja mikroorganizmów jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dekontaminacji powierzchni.
   • Nawet jeśli ktoś niedawno korzystał z blatu laboratoryjnego i został on przetarty środkiem dezynfekcyjnym, ZAWSZE rozpoczynaj pracę w laboratorium od przetarcia blatu.
3. Po całkowitym wyschnięciu środka dezynfekcyjnego, użyj zapalniczki, aby zapalić palnik Bunsena. Wyreguluj płomień tak, aby w jego środkowej części widoczny był niebieski stożek. Płomień generuje teraz prąd wstępujący, czyli konwekcyjne prądy powietrza, w których ciepłe powietrze unosi się do góry i oddala od płomienia (Rycina 1). Wraz z unoszącym się ciepłem mikroorganizmy i cząstki kurzu są wypychane w górę i z dala od bezpośredniego obszaru roboczego. W obrębie tego obszaru stworzonego przez palnik Bunsena, nazywanego polem sterylnym, pracuj przez cały czas powoli, ostrożnie i rozważnie. Palnik Bunsena powinien pozostać zapalony przez całą procedurę.
   • Wierzchołek niebieskiego stożka jest najgorętszą częścią płomienia.
   • Uważaj, aby nie zakłócić prądu wstępującego gwałtownymi ruchami, które drastycznie zmieniają przepływ powietrza wokół blatu laboratoryjnego. Tworzenie prądu wstępującego za pomocą palnika Bunsena minimalizuje możliwość opadania mikroorganizmów i kurzu na blat lub do otwartych butelek, probówek czy kolb w obszarze roboczym.
4. Ułóż wszystkie materiały niezbędne do procedury na blacie laboratoryjnym w pobliżu pola sterylnego. Upewnij się, że wszystkie materiały są odpowiednio oznakowane.
   • Materiały mogą obejmować pipety serologiczne i mikropipety, sterylne probówki hodowlane, sterylne kolby, butelki z pożywką płynną, sterylne probówki do mikrowirówki, końcówki do mikropipet, statywy na probówki, kultury komórek bakteryjnych oraz zapasy fagów.
   • Pożywki płynne należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 15 minut w trybie cieczy. Większe objętości pożywek (> 1L) wymagają dłuższego czasu autoklawowania. Szkło laboratoryjne należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w trybie grawitacyjnym (suchym).
   • Zasadniczo sterylne roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do 5 miesięcy. Należy pamiętać, że czas przechowywania jest znacznie krótszy w przypadku roztworów zawierających niestabilne składniki, takie jak antybiotyki – zawsze sprawdzaj zalecenia producenta.

2. Przenoszenie cieczy za pomocą pipet serologicznych

1. Pipety serologiczne występują w wielu rozmiarach i wersjach: plastikowe lub szklane, jednorazowe lub wielorazowe, z watowanym korkiem lub bez niego. Są one skalibrowane do pobierania objętości od 0,1 ml do 25 ml.
   • Typowe rozmiary pipet serologicznych to 5 ml, 10 ml i 25 ml; należy ich używać do aseptycznego przenoszenia cieczy o objętości 0,1 ml lub większej (panel A na ryc. 2). Istnieją również większe pipety serologiczne, które mogą pobierać objętości do 100 ml, jednak niniejszy protokół skupia się na częściej stosowanych pipetach o mniejszych rozmiarach.
   • Do eksperymentów z zakresu mikrobiologii i hodowli tkankowych wymagane są pipety wstępnie sterylizowane z watowanym korkiem. Korka nie należy usuwać z górnej części pipety; jest on zaprojektowany tak, aby zapobiegać przepełnieniu pipety.
   • W zależności od zastosowania stosuje się plastikowe lub szklane pipety serologiczne. Szkło jest niezbędne w przypadku rozpuszczalników organicznych. Oba rodzaje można stosować podczas przeprowadzania eksperymentów BSL-1 na blacie laboratoryjnym. Wyłącznie pipety plastikowe można stosować podczas pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza z organizmami BSL-2, gdzie nie można używać palnika Bunsena. Zaleca się również stosowanie plastiku w aplikacjach obejmujących przenoszenie stopionego agaru.
   • Pipety serologiczne dzielą się na dwa typy: TC („to contain” – do zawierania) lub TD („to deliver” – do dostarczania). Pipety TC dostarczają całą objętość, w tym tę znajdującą się w końcówce, i muszą zostać „wydmuchane” lub wypłukane, aby uzyskać określoną objętość. Pipety TD są skalibrowane tak, aby w końcówce pozostała niewielka ilość cieczy, której nie należy wydawać. Należy sprawdzić etykietę na korpusie pipety w pobliżu góry, aby ustalić jej typ (ryc. 3). Najczęściej stosowane są pipety TD, które są oznaczone podwójnymi pierścieniami u góry.
2. Należy wziąć sterylną plastikową pipetę serologiczną (zwaną również pipetą transferową objętościową) i ostrożnie usunąć papierową osłonkę z końca z watowanym korkiem, zdejmując ją podobnie jak skórkę z banana – nie należy usuwać całej osłonki, aby chronić końcówkę pipety, która będzie miała kontakt z przenoszoną cieczą. Górną część pipety (powyżej podziałki) należy dotykać wyłącznie dłońmi.
   • Nigdy nie należy wprowadzać używanej pipety do sterylnego roztworu, nawet jeśli zachowano szczególną ostrożność, aby utrzymać jej sterylność.
   • Szklane pipety serologiczne są zazwyczaj przechowywane w metalowych pojemnikach (panel B na ryc. 2). Należy poluzować górną część pojemnika, ostrożnie zdjąć pokrywkę, a następnie wysterylizować płomieniem otwarte końce pokrywki i pojemnika. Pokrywkę należy położyć na boku na zdezynfekowanym blacie. Jedną pipetę wyjmuje się z pojemnika, trzymając go poziomo i delikatnie potrząsając, tak aby końcówki jednej lub dwóch pipet wystawały na około cal i można je było łatwo chwycić. Należy położyć pojemnik na boku i wyjąć jedną pipetę, uważając, aby nie dotknąć pozostałych pipet w pojemniku. Nie wolno dotykać dolnej końcówki pipety dłońmi i należy unikać kontaktu końcówki z innymi niesterylnymi powierzchniami.
3. Do górnego końca pipety serologicznej należy przymocować pomoc do pipetowania, taką jak gruszka, pompka lub pipetator automatyczny. Należy usunąć papierową osłonkę z plastikowej pipety. Pomoc do pipetowania należy trzymać w prawej dłoni.
   • W przypadku użycia pipety szklanej, dolną jedną trzecią pipety należy przeprowadzić przez niebieski stożek w płomieniu palnika Bunsena na 1–3 sekundy. Podczas przechodzenia przez płomień pipetę należy obrócić o 180°. Pipet plastikowych i probówek nie wolno sterylizować płomieniem.
   • Osoby leworęczne powinny trzymać pomoc do pipetowania w lewej dłoni, a kolejne manipulacje z butelkami z kulturami i probówkami wykonywać prawą ręką.
   • Zanieczyszczenie plastikowych pipet zdarza się najczęściej podczas wyciągania ostatnich centymetrów pipety z osłonki, ponieważ sterylna końcówka styka się z częścią osłonki dotykaną przez dłonie.
4. Należy zdjąć zakrętkę z butelki zawierającej sterylne medium. Zakrętki nie wolno kłaść na blacie laboratoryjnym; należy ją trzymać między palcem serdecznym a wnętrzem prawej dłoni, manipulując pomocą do pipetowania kciukiem, palcem wskazującym i środkowym tej samej dłoni (ryc. 4). Trzymając butelkę pod kątem 45°, należy przeprowadzić jej krawędź przez płomień palnika Bunsena, tworząc sterylne pole wokół otwartej butelki.
   • Choć najlepiej tego unikać, jeśli konieczne jest odłożenie zakrętki, należy ją położyć stroną otwartą do dołu na zdezynfekowanej powierzchni. Przy zakrętce skierowanej do góry istnieje większe ryzyko zanieczyszczenia wskutek ruchu przedmiotów lub rąk, co tworzy prądy powietrzne powodujące opadanie drobnoustrojów i cząsteczek kurzu na wewnętrzną powierzchnię zakrętki.
   • Celem sterylizacji płomieniem nie jest pełna sterylizacja, lecz ogrzanie otworu butelki i wytworzenie konwekcyjnych prądów powietrza unoszących się w górę, z dala od otworu (tzw. prąd wstępujący). Ciepłe, wznoszące się powietrze pomaga zapobiec przedostawaniu się cząsteczek kurzu i innych zanieczyszczeń do wnętrza butelki.
   • Sterylny pojemnik powinien pozostać otwarty jak najkrócej. Ważne jest, aby podczas całej procedury zminimalizować punkty dostępu dla mikroorganizmów przenoszonych drogą powietrzną.
   • Należy unikać kaszlania, kichania, mówienia i innych nieumyślnych ruchów, gdy sterylne pojemniki są otwarte.
   • Po przejściu przez płomień palnika Bunsena nie wolno przesuwać dłoni ani palców nad sterylnym polem (np. nad otwartymi butelkami lub kolbami, wnętrzem probówek i zakrętkami butelek).
   • Podczas otwierania sterylnych probówek lub butelek należy zawsze pracować z otwartym płomieniem. Na blacie nie może znajdować się więcej niż jedna otwarta probówka, butelka lub kolba w tym samym czasie. Sterylizację płomieniem należy przeprowadzać natychmiast po otwarciu i bezpośrednio przed zamknięciem probówek, butelek i kolb.
5. Końcówkę pipety serologicznej należy wprowadzić do butelki zawierającej sterylne medium, a następnie w sposób aseptyczny aspirację, czyli pobrać próbkę z butelki. Do kontrolowania przepływu próbki do pipety należy użyć pomocy do pipetowania. Objętość pobraną do pipety odczytuje się precyzyjnie, dopasowując menisk utworzony na górze słupa cieczy do kresek podziałki na skalibrowanej pipecie (ryc. 5).
   • NIE POBIERAĆ CIECZY USTAMI! Zawsze należy używać pomocy do pipetowania (pompy, gruszki lub pipetatora automatycznego).
   • Przy określaniu pobranej objętości należy zwrócić uwagę na kolejność liczb. Liczby mogą być nadrukowane od końcówki do góry, odwrotnie lub często w obu kierunkach.
   • Podczas odczytu objętości pipetę należy zawsze trzymać pionowo, prostopadle do podłoża, i patrzeć na menisk cieczy bezpośrednio na wysokości oczu.
   • Dokładność pipet serologicznych jest ograniczona do najmniejszej zaznaczonej kreski, która zazwyczaj wynosi 0,1 ml dla pipet 5 ml i 10 ml oraz 0,2 ml dla pipet 25 ml. Jeśli wymagana jest większa precyzja, pipetę serologiczną można stosować w połączeniu z mikropipetą.
6. Krawędź butelki należy ponownie przeprowadzić przez płomień palnika Bunsena, a następnie ponownie zakręcić butelkę. Butelkę z medium należy odstawić.
   • Należy uważać, aby w pośpiechu przy zamykaniu butelki nie oparzyć się palnikiem Bunsena.
7. W lewej dłoni należy trzymać probówkę lub kolbę. Zakrętkę należy zdjąć i trzymać w opisany w kroku 4 sposób. Sterylne pole tworzy się poprzez wysterylizowanie płomieniem krawędzi probówki lub kolby w palniku Bunsena.
8. Medium z pipety należy przelać do probówki lub kolby. Należy kontrolować przepływ próbki tak, aby nie rozpryskiwała się ona poza naczynie.
   • Objętości można mierzyć tak, aby dostarczyć całą zawartość i całkowicie opróżnić pipetę, lub aby uzyskać konkretną objętość poprzez dozowanie między dwoma punktami podziałki (od jednej kreski do drugiej).
9. Krawędź probówki lub kolby należy ponownie przeprowadzić przez płomień palnika Bunsena, a następnie założyć zakrętkę. Probówkę lub kolbę należy odstawić. Należy odłączyć pomoc do pipetowania, a pipetę wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady.
   • Plastikowe pipety serologiczne są jednorazowe, natomiast szklane można sterylizować i używać ponownie. Prawidłowa utylizacja wymaga umieszczenia plastikowych pipet w wyznaczonym pojemniku na odpady ostre (sztywny pojemnik wyłożony plastikowym workiem), natomiast pipety szklane należy początkowo zanurzyć w pojemniku z 10% roztworem wybielacza w celu zdezynfekowania powierzchni wewnętrznych i zewnętrznych. Następnie pipety szklane należy dokładnie umyć detergentem laboratoryjnym, wypłukać wodą destylowaną i wysterylizować w autoklawie.
10. Te same kroki należy stosować podczas inokulacji mediów kulturą bakteryjną lub zapasem fagów, a także podczas przeprowadzania rozcieńczeń seryjnych.

3. Przenoszenie cieczy za pomocą mikropipet

1. Precyzyjne mierzenie i dozowanie niewielkich objętości można przeprowadzić za pomocą mikropipet (nazywanych również Pipetman; Panel A na Rysunku 6). Instrumenty te występują w różnych rozmiarach, z których każdy ma określony zakres objętości: P2 dla 0,2-2 μl, P10 dla 1-10 μl, P20 dla 2-20 μl, P200 dla 20-200 μl oraz P1000 dla 200-1000 μl.
   • Z mikropipetami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ są to instrumenty precyzyjne. Nie należy zostawiać ich bez nadzoru na blacie laboratoryjnym, gdzie mogłyby zostać potrącone i uszkodzone. Nie wolno dopuścić do kontaktu pipet z substancjami żrącymi.
   • W przypadku objętości przekraczających 1000 μl należy użyć pipety serologicznej.
   • Mimo pracy w polu sterylnym stworzonym przez palnik Bunsena, nie należy wypalać mikropipet, probówek i plastikowych końcówek. Probówki i końcówki powinny być wstępnie wysterylizowane. Przed użyciem mikropipety można przetrzeć nawilżoną chusteczką dezynfekującą.
2. Numeryczny wolumetr wskazujący dozowaną objętość można ustawić, obracając pokrętłem regulacyjnym. Należy ustawić objętość przed przejściem do kroku nr 3.
   • NIGDY NIE OBRACAĆ POKRĘTŁA REGULACYJNEGO POWYŻ ZAKRESU PRZEZNACZONEGO!
   • Aby uzyskać maksymalną dokładność podczas zmniejszania ustawienia objętości w mikropipecie, należy powoli obracać kółko kciukiem, uważając, aby nie przekroczyć kreski podziałki.
   • Aby uzyskać maksymalną dokładność podczas zwiększania ustawienia objętości w mikropipecie, należy obrócić kółko kciukiem w górę, przekraczając pożądaną kreskę podziałki o 1/3 obrotu. Następnie należy powoli obracać kółko w dół, aby osiągnąć zamierzoną objętość, uważając, aby nie przekroczyć kreski podziałki.
   
   Wolumetr wskazuje trzy cyfry. W zależności od mikropipety cyfry te interpretuje się inaczej. Należy pamiętać, że dokładność każdej mikropipety jest ograniczona do najmniejszej kreski podziałki.
   P2: Dla objętości od 0,2-2,0 μl. Górna cyfra oznacza objętość w mikrolitrach. Druga cyfra wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl), a trzecia cyfra reprezentuje setne części mikrolitra (0,01 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch tysięcznych (0,002 μl) mikrolitra.
   P10: Dla objętości od 1,0-10,0 μl. Górna cyfra dotyczy dziesiątek mikrolitrów; zazwyczaj jest ustawiona na „0” i powinna być ustawiona na „1” tylko wtedy, gdy pozostałe dwie cyfry są ustawione na „0” podczas dozowania 10,0 μl. Środkowa cyfra oznacza objętość w mikrolitrach. Trzecia cyfra wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch setnych (0,02 μl) mikrolitra.
   P20: Dla objętości od 2,0-20,0 μl. Górna cyfra w kolorze czarnym dotyczy dziesiątek mikrolitrów; powinna być ustawiona na „2” tylko wtedy, gdy pozostałe dwie cyfry są ustawione na „0” podczas dozowania 20,0 μl. Druga cyfra w kolorze czarnym oznacza objętość w mikrolitrach. Trzecia cyfra w kolorze czerwonym wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch setnych (0,02 μl) mikrolitra.
   P200: Dla objętości od 20,0-200 μl. Górna cyfra dotyczy setek mikrolitrów; powinna być ustawiona na „2” tylko wtedy, gdy pozostałe dwie cyfry są ustawione na „0” podczas dozowania 200 μl. Środkowa cyfra wskazuje dozowaną objętość w dziesiątkach mikrolitrów, a trzecia cyfra oznacza objętość w mikrolitrach. Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch dziesiątych (0,2 μl) mikrolitra.
   P1000: Dla objętości od 200-1000 μl. Górna cyfra dotyczy tysięcy mikrolitrów; zazwyczaj jest ustawiona na „0” i powinna być ustawiona na „1” tylko wtedy, gdy pozostałe dwie cyfry są ustawione na „0” podczas dozowania 1000 μl. Środkowa cyfra dotyczy setek mikrolitrów. Dolna cyfra dotyczy dziesiątek mikrolitrów. Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch (2 μl) mikrolitrów.
   
   • Kontrola wydajności: Instrumenty te powinny być kalibrowane co roku, aby zapewnić utrzymanie dokładności i precyzji w granicach ± 5% specyfikacji. Należy użyć wagi analitycznej do pomiaru wody, upewniając się, że ustawienia minimalne i maksymalne odpowiadają zamierzonej objętości. Na przykład, użyj P1000 do przeniesienia 200 μl wody do naczynia wagowego na wadze. Ponieważ woda ma gęstość 1, 1 ml wody odpowiada 1 gramowi (g). Zatem 200 μl (0,2 ml) wody powinno odpowiadać 0,2 g. Należy również upewnić się, że końcówka nie przecieka i może utrzymać pożądaną objętość aż do momentu dozowania za pomocą systemu tłoka.
3. Mikropipet należy zawsze używać z plastikowymi końcówkami jednorazowymi. Należy mocno nasadzić końcówkę na koniec korpusu mikropipety. Docisnąć i lekko przekręcić, aby zapewnić szczelność powietrzną.
   • Końcówki są zazwyczaj pakowane w plastikowe pudełka, które można sterylizować w autoklawie. Otwórz pudełko, aby wyciągnąć końcówkę, a następnie zamknij je, aby zminimalizować kontakt z zanieczyszczeniami w powietrzu.
   • Niektóre końcówki posiadają filtry podobne do watowych czopów w pipetach serologicznych. Takie końcówki są często droższe od zwykłych i są stosowane w specjalistycznych zastosowaniach. Na przykład podczas pomiaru lotnych chemikaliów, takich jak chloroform, lub cieczy radioaktywnych, takich jak DNA znakowane ³²P, użycie końcówek z filtrem pomaga zapobiec zanieczyszczeniu korpusu mikropipety.
4. Mikropipetę należy trzymać w pozycji pionowej.
   • Utrzymywanie mikropipety w pionie zapobiegnie przedostawaniu się cieczy do wnętrza i zanieczyszczeniu korpusu mikropipety.
5. Mikropipeta posiada trzy pozycje: (1) pozycja spoczynkowa, (2) pierwszy stopień i (3) drugi stopień (Rysunek 6, panel B). Instrument posiada system tłoka z dwoma stopniami zatrzymania. Pierwszy stopień ma dwie funkcje. Pierwszą jest pobranie pożądanej objętości cieczy do końcówki podczas zwalniania tłoka z pierwszego stopnia do pozycji spoczynkowej. Druga funkcja to dozowanie większości cieczy z końcówki podczas naciskania tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego stopnia. Dalsze naciskanie tłoka do drugiego stopnia pozwala dozować pozostałą w końcówce ciecz.
   Naciśnij przycisk tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego stopnia. Wypchnięte zostanie powietrze o objętości odpowiadającej ustawieniu.
6. Zanurz końcówkę w cieczy, trzymając przycisk wciśnięty do pierwszego stopnia.
   • Nie dotykaj samą mikropipetą ścianek butelek, probówek i kolb; w przeciwnym razie wewnętrzne powierzchnie tych naczyń zostaną zanieczyszczone. Tylko końcówki są sterylne.
7. Powoli zwolnij przycisk, aby aspirować ciecz do końcówki. Zatrzymaj się, gdy przycisk wróci do pozycji spoczynkowej. Odczekaj chwilę, aby ciecz mogła zostać zaciągnięta do końcówki.
   • Objętość cieczy w końcówce będzie odpowiadać ustawionej objętości mikropipety.
   • Ciecze lepkie, np. zawierające glicerol, wymagają więcej czasu na wniknięcie do końcówki.
8. Wyjmij końcówkę z cieczy i sprawdź wizualnie, czy pobrana ciecz osiągnęła oczekiwany poziom w końcówce i czy nie ma w niej pęcherzyków powietrza.
   • W razie potrzeby usuń ciecz i ręcznie mocniej dociśnij końcówkę do mikropipety. Ponownie pobierz ciecz i sprawdź ponownie.
9. Umieść końcówkę pod kątem (10° do 45°) przy ściance probówki przyjmującej ciecz. Aby dozować ciecz, powoli naciśnij przycisk tłoka do pierwszego stopnia. Odczekaj chwilę, a następnie naciśnij przycisk do drugiego stopnia, aby usunąć wszelką pozostałą ciecz z końcówki.
   • Zbyt szybkie naciśnięcie tłoka może spowodować rozbryzgi dozowanej cieczy lub powstanie niepożądanych pęcherzyków w probówce.
10. Przed zwolnieniem tłoka do pozycji spoczynkowej wyjmij końcówkę z cieczy.
11. Wyrzuć końcówki do wyznaczonego pojemnika na odpady ostre, naciskając przycisk wyrzutu w mikropipecie.

4. Sprzątanie miejsca pracy

1. Po zakończeniu eksperymentu wymagającego zastosowania techniki aseptycznej należy wyłączyć palnik Bunsena, a następnie schować wszystkie materiały i odczynniki. Przetrzyj zewnętrzne powierzchnie sprzętu laboratoryjnego (butelek, mikropipet, pudełek z końcówkami do pipet) zwilżoną chusteczką dezynfekującą, aby zapobiec przeniesieniu zanieczyszczeń do miejsca przechowywania.
2. Zanieczyszczone szkło laboratoryjne oraz niebezpieczne odpady należy umieścić w odpowiednim pojemniku do utylizacji. Odpady laboratoryjne obejmują sprzęt taki jak rękawiczki, pipety, końcówki i probówki. Niebezpieczne odpady niezakaźne powstają podczas przeprowadzania eksperymentów z organizmami niepatogennymi (BSL-1), natomiast niebezpieczne odpady zakaźne powstają podczas pracy z organizmami patogennymi (BSL-2 lub wyższym). Odpady zakaźne muszą zostać poddane autoklawowaniu lub dezynfekcji przed ich utylizacją. Należy przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa laboratoryjnego opisanych w BMBL (5^th Ed.) oraz tych dostarczonych przez OSHA i instytucjonalne działy BHP (Environmental Health and Safety).
3. Przetrzyj cały obszar roboczy na blacie laboratoryjnym zwilżoną chusteczką dezynfekującą z pojemnika, ponownie pozwalając środkowi dezynfekującemu odparować.
4. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykładowe zastosowanie pipet serologicznych do przenoszenia cieczy przedstawiono na Rysunku 7. Pipety te są często wykorzystywane w laboratoriach mikrobiologicznych do przygotowywania pożywek do inokulacji kultur bakteryjnych. Przykładowo, sterylne kolby wypełnia się najpierw określoną objętością bulionu hodowlanego, w tym przypadku bulionu Luria (LB), a następnie do pożywki dodaje się niewielką liczbę komórek (np. E. coli). Przy użyciu pipety serologicznej należy najpierw aseptycznie przenieść bulion z butelki z pożywką do kolby. W tym przypadku do sterylnej kolby o pojemności 125 ml dodano 25 ml LB za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Następnie bulion należy zaszczepić komórkami E. coli. Tutaj 10 μl komórek przeniesiono aseptycznie za pomocą mikropipety P20 z kolby z uprzednio wyhodowaną kulturą do 25 ml świeżego LB. Kolbę inkubuje się w komorze wzrostowej przez określony czas, aby umożliwić replikację komórek (w tym przykładzie komórki E. coli inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsowej). Wynikiem jest mętna kultura komórek bakteryjnych, która może być wykorzystana w kolejnych eksperymentach.

Pipety serologiczne mogą być również wykorzystywane do przenoszenia pożywek dostarczanych pierwotnie w butelkach do probówek lub między probówkami, co ma miejsce podczas wykonywania rozcieńczeń kultury bakteryjnej. Jeśli podczas tego typu manipulacji z pożywkami nie zostanie zachowana technika aseptyczna, kultury zostaną zanieczyszczone, a kolejne eksperymenty z ich wykorzystaniem zostaną opóźnione, ponieważ konieczne będzie przygotowanie świeżych, niekontaminowanych kultur. Błędy wynikają z nieutrzymania sterylnego pola podczas całej procedury. Na przykład można zapomnieć o zdezynfekowaniu blatu laboratoryjnego lub opaleniu krawędzi butelki z kulturą lub probówki. Można również dotknąć końcówki pipety lub położyć zakrętkę butelki bądź probówki na blacie zamiast trzymać ją w dłoni. Prawidłowa procedura jest krytyczna dla zminimalizowania kontaminacji pożywek i kultur. Rysunek 8A przedstawia przykład czystej oraz zanieczyszczonej kultury E. coli w probówce zawierającej 5 ml LB. Lewy panel pokazuje kulturę wykazującą jednolitne, delikatne zmętnienie typowe dla czystej kultury E. coli. W przeciwieństwie do niej, prawy panel przedstawia kulturę zanieczyszczoną, w której charakterystyka wzrostu odbiega od oczekiwanej dla tego szczepu bakterii.

Podczas manipulowania pipetami serologicznymi mogą wystąpić błędy techniczne skutkujące przeniesieniem nieprawidłowych objętości pożywek między próbówkami. Na przykład można błędnie odczytać objętość na pipecie (np. górna krawędź w stosunku do dolnej krawędzi menisku) lub całkowicie wypuścić pożywkę z pipety typu TD, która została zaprojektowana tak, aby pozostawić niewielką ilość cieczy w końcówce. Podczas przenoszenia pożywki metodą punkt-punkt można użyć niewłaściwych oznaczeń kalibracyjnych i odmierzyć błędną objętość. Rycina 8B przedstawia przykład próbówek z prawidłową i nieprawidłową objętością pożywki. Próbówka po lewej zawiera 3,5 ml LB odmierzone pipetą serologiczną o pojemności 5 ml. Student przeprowadził przenoszenie pożywki metodą punkt-punkt, w której LB pobrano do kreski 5,0 ml i wypuszczono do kreski 1,5 ml. Próbówka po prawej zawiera 2,5 ml LB odmierzone pipetą tej samej wielkości, ponieważ student wykonujący przenoszenie pożywki metodą punkt-punkt błędnie wypuścił ją z kreski 5,0 ml do kreski 2,5 ml. Błąd ten spowoduje otrzymanie hodowli bakteryjnej o wyższym stężeniu niż planowano, co sprawi, że kolejne rozcieńczenia będą nieprawidłowe. Taka propagacja błędów może doprowadzić do niepowodzenia eksperymentu, który musiałby zostać powtórzony z zastosowaniem prawidłowych stężeń komórek.

Przykładowe zastosowanie mikropipet do przenoszenia cieczy przedstawiono na Rysunku 9. Pipety te są wykorzystywane w wielu eksperymentach z zakresu biologii molekularnej i mikrobiologii, w tym podczas przygotowywania próbek do PCR i elektroforezy żelowej oraz przy szczepieniu sterylnych pożywek lub buforów małymi objętościami (poniżej 1,0 ml) komórek bakteryjnych lub cząsteczek fagów. W przedstawionym przykładzie student przeniósł 12,5 μl buforu TE do probówki do wirówki o pojemności 1,8 ml (lewa probówka w panelu A; należy zauważyć, że do buforu dodano barwnik, aby ułatwić wizualizację cieczy wewnątrz przezroczystych probówek). Procedura ta wymagała od studenta najpierw wybrania odpowiedniej mikropipety, w tym przypadku P20, a następnie ustawienia wolumetru na właściwą objętość (panel B). Użyto końcówki z watowym czopem na końcu, aby zapobiec ewentualnemu przedostaniu się zanieczyszczeń z korpusu mikropipety do próbki buforu w końcówce. Środek ostrożności ten nie jest konieczny, jeśli podczas aspiracji cieczy do końcówek zachowuje się staranność, powoli naciskając tłok, tak aby ciecz nie rozprysnęła się do wnętrza pipety. Mogą wystąpić błędy techniczne skutkujące przeniesieniem nieprawidłowych objętości. Na przykład można wybrać niewłaściwą mikropipetę do danego zadania lub ustawić wolumetr w odpowiedniej mikropipecie na błędną objętość. Przed zanurzeniem końcówki w buforze można nacisnąć tłok poza pierwszy stopień, co spowoduje zaciągnięcie nadmiaru buforu do końcówki po zwolnieniu tłoka. Alternatywnie, można nie zanurzyć końcówki wystarczająco głęboko w buforze, przez co do końcówki zostanie zaciągnięte powietrze zamiast buforu. Można zapomnieć o naciśnięciu tłoka do drugiego stopnia podczas dozowania buforu do probówki, co spowoduje wydzielenie z końcówki objętości mniejszej niż zamierzona. Prawa probówka w panelu A na Rysunku 9 przedstawia probówkę zawierającą nieprawidłową objętość buforu w stosunku do probówki po lewej stronie. Zamiast dozować 12,5 μl buforu, student dozował 125 μl. W tym przypadku, mimo że na wolumetrze ustawiono identyczne cyfry, do zadania wybrano niewłaściwą mikropipetę (student użył P200 zamiast P20; panel B), co doprowadziło do pobrania znacznie większej objętości buforu. Gdyby ten roztwór był używany do przygotowania mieszaniny odczynników w zastosowaniu takim jak PCR, błąd ten zmieniłby końcowe stężenie wszystkich odczynników dodawanych następnie do tej samej probówki. W konsekwencji mało prawdopodobne jest, aby eksperyment zakończył się sukcesem, ponieważ procedury biologii molekularnej, takie jak PCR, wymagają, aby wszystkie komponenty znajdowały się w określonych stężeniach, aby reakcja przebiegała prawidłowo.

Ponieważ nie zawsze jest możliwe zapewnienie sterylności mikropipet (zwłaszcza wnętrza cylindra), roztwory stokowe mogą ulec zanieczyszczeniu, co prowadzi do niepowodzenia nawet prób rozwiązywania problemów podczas przeprowadzania eksperymentów. W przypadku używania mikropipet do przenoszenia sterylnych roztworów, zdecydowanie zaleca się przygotowanie aliquotów roztworów stokowych (pożywek, buforów, wody) przy użyciu techniki aseptycznej z wykorzystaniem pipet serologicznych. Powszechną praktyką jest przechowywanie roboczych roztworów stokowych w sterylnych probówkach stożkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Są one często łatwiejsze w obsłudze podczas korzystania z mikropipety i mogą zostać zastąpione nową porcją roztworu stokowego, jeśli dojdzie do zanieczyszczenia podczas przenoszenia określonych objętości.

Rycina 1. Pole sterylne utworzone przez prąd wstępujący płomienia palnika Bunsena. Aby zminimalizować kontaminację sterylnych roztworów i kultur, kluczowe jest przeprowadzanie wszystkich manipulacji w obrębie pola sterylnego. Krawędzie szklanych probówek i kolb należy przeprowadzać przez wierzchołek niebieskiego stożka, czyli najgorętszą część płomienia. Probówki i końcówki plastikowe nie mogą być sterylizowane w płomieniu – powinny one zostać poddane sterylizacji metodami alternatywnymi przed użyciem.

Rysunek 2. Pipety serologiczne stosowane do aseptycznego przenoszenia cieczy. (A) Od lewej do prawej przedstawiono rysunki pipet o objętości 25 ml, 10 ml i 5 ml. (B) Pipety serologiczne mogą być wykonane z tworzywa sztucznego lub szkła. Pipety plastikowe są jednorazowe i zazwyczaj pakowane indywidualnie w papierowe i plastikowe etui, których wszystkie powierzchnie wewnętrzne są sterylne (lewa strona). Pipety szklane mogą być używane wielokrotnie, pod warunkiem że zostaną oczyszczone i wysterylizowane pomiędzy użyciami; zazwyczaj przechowuje się je w metalowych pojemnikach (prawa strona).

Rysunek 3. Pipety serologiczne dzielą się na dwa typy: TC („do zawarcia”) lub TD („do dostarczenia”). Przedstawiono etykietę wyjaśniającą dla pipety TD 5 ml.

Rycina 4. Technika aseptyczna. Podczas aspirowania cieczy z butelki, kolby lub probówki z zakrętkami, nigdy nie kładź zakrętki na blacie. Zamiast tego trzymaj zakrętkę w tej samej ręce co pipetador, manipulując naczyniem z cieczą drugą ręką, tak jak pokazano na rysunku.

Rysunek 5. Menisk powstający podczas pobierania cieczy do pipety serologicznej. Objętość odpowiada kresce graduacyjnej na pipecie, z którą wyrównuje się dolna krawędź menisku. W tym przykładzie menisk wyrównuje się z kreską graduacyjną 2.5 ml.

Rycina 6. Jednokanałowa mikropipeta. (A) Przedstawiono przykładową mikropipetę z plastikowym końcówką przymocowaną do uchwytu końcówki. Wskazano położenie wolumetru, pokrętła kciuka do zmiany ustawienia wolumetru, uchwytu końcówki, przycisku wyrzutnika końcówek oraz przycisku tłoka.

Rysunek 7. Użycie pipet serologicznych do przenoszenia pożywki do sterylnych kolb o pojemności 125 ml. Lewa kolba zawiera jedynie 25 ml pożywki (LB), natomiast prawa kolba zawiera kulturę E. coli, uzyskaną poprzez zaszczepienie pożywki LB komórkami, a następnie inkubację przez noc w temperaturze 37 °C. Zwróć uwagę, że pożywka w kolbie po prawej stronie jest mętna z powodu wzrostu komórek.

Rysunek 8. Wykorzystanie pipet serologicznych do przenoszenia pożywek do sterylnych probówek. (A) Lewa probówka zawiera 5 ml czystej hodowli E. coli, natomiast prawa probówka zawiera 5 ml zanieczyszczonej hodowli komórek bakteryjnych. Należy zwrócić uwagę na różnice w charakterystyce wzrostu obu hodowli. Choć obie są mętne, hodowla po prawej stronie została zanieczyszczona grzybem lub innymi mikroorganizmami przenoszonymi drogą powietrzną, co nadało jej kolor i konsystencję inną niż oczekiwana dla komórek E. coli. (B) Lewa probówka z hodowlą zawiera 3,5 ml LB, podczas gdy prawa probówka zawiera tylko 2,5 ml LB. Ta różnica w objętości wynika z błędu popełnionego podczas punktowego dozowania pożywki do probówek.

Rycina 9. Wykorzystanie mikropipet do przenoszenia buforu do sterylnych probówek do mikrowirówki. (A) Lewa probówka zawiera jedynie 12,5 μl buforu TE, natomiast prawa probówka zawiera 125 μl. Należy zwrócić uwagę, że do buforu dodano barwnik, aby ułatwić wizualizację cieczy wewnątrz przezroczystych probówek. (B) Lewy wolumetr pochodzi z mikropipety P20, natomiast prawy wolumetr pochodzi z mikropipety P200. Częstym błędem jest wybór niewłaściwej mikropipety. Mimo że na wolumetrach P20 i P200 ustawiono identyczne wartości, wybór niewłaściwej mikropipety skutkuje przeniesieniem nieprawidłowych objętości.

Rysunek 10. Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza wykorzystywane do zapobiegania kontaminacji roztworów i kultur. Przedstawiono komorę bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzoną do pracy z organizmami klasy BSL-2.

Dyskusja

Technika aseptyczna odnosi się do zestawu rutynowych procedur stosowanych w celu zapobiegania zanieczyszczeniu sterylnych roztworów i kultur niepożądanymi mikroorganizmami w laboratorium. Techniki te są niezbędne w eksperymentach wymagających hodowli komórek. Choć nie jest możliwe osiągnięcie całkowicie sterylnych warunków pracy, procedury takie jak dezynfekcja powierzchni laboratoryjnych, tworzenie strefy sterylnej za pomocą palnika Bunsena, ograniczanie ekspozycji niezakorkowanych kultur i mediów na powietrze, sterylizacja materiałów, takich jak butelki, probówki i pipety szklane, oraz unikanie kontaktu sterylnych narzędzi z niesterylnymi powierzchniami, zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia roztworów i kultur podczas eksperymentu. Celem jest, aby te środki ostrożności stały się odruchowe, co osiąga się poprzez szkolenie i praktykę podczas pracy w laboratorium.

Przenoszenie objętości sterylnych roztworów i kultur przy użyciu takich instrumentów jak pipety serologiczne i mikropipety jest jednym z wielu rodzajów rutynowych technik wykonywanych w laboratorium. Różne zastosowania eksperymentalne wymagają instrumentów zdolnych do przenoszenia odmiennych, a jednocześnie precyzyjnych i dokładnych objętości. Pipety serologiczne są stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych do przygotowywania kultur komórkowych wymagających sporządzenia pożywek w objętościach wyrażonych w mililitrach, podczas gdy mikropipety są niezbędne w eksperymentach biologii molekularnej, w których potrzebne są jedynie mikrolitrowe ilości roztworów. Stosowanie technik aseptycznych przy użyciu tych instrumentów minimalizuje kontaminację podczas przenoszenia objętości, niezależnie od ilości cieczy czy rodzaju eksperymentu.

Choć nie omówiono tego w niniejszym protokole, innym powszechnie stosowanym sposobem zapobiegania kontaminacji jest praca wdymającej powietrze laminarnej komorze z nawiewem (Rysunek 10). Sprzęt ten jest niezbędny w hodowlach tkankowych oraz w eksperymentach przeprowadzanych z mikroorganizmami sklasyfikowanymi jako BLS-2 lub wyższymi. Komora z nawiewem laminarnym posiada filtr HEPA (wysokowydajny filtr cząsteczkowy), który usuwa z powietrza zanieczyszczenia przed jego wpłynięciem do komory, zapobiegając jednocześnie przedostawaniu się nieprzefiltrowanego powietrza z pomieszczenia do przestrzeni roboczej. Należy zauważyć, że wewnątrz komory z nawiewem laminarnym nie można używać palnika Bunsena, ponieważ ciepło generowane przez płomień zaburza przepływ powietrza, który jest kluczowy dla prawidłowego funkcjonowania urządzenia.

Podczas przeprowadzania eksperymentów często pomocne jest sprawdzenie jakości zastosowanej techniki aseptycznej. Aby potwierdzić, że roztwory i pożywki nie uległy zanieczyszczeniu podczas manipulacji eksperymentalnych, należy zawsze przygotować kontrolę negatywną. Na przykład, przygotowując probówki z pożywką płynną do hodowli bakterii, jednej probówki nie należy szczepić, pozostawiając w niej jedynie sterylną pożywkę. Inkubuje się ją razem ze zaszczepionymi probówkami, a następnie sprawdza, czy w niezaszczepionej probówce kontrolnej nie pojawiły się oznaki kontaminacji, takie jak zmętnienie wynikające z wzrostu niepożądanych komórek nieumyślnie wprowadzonych do naczynia. Jeśli probówka kontrolna jest zanieczyszczona, prawdopodobnie zanieczyszczone są również probówki eksperymentalne, a eksperyment będzie wymagał powtórzenia. Te środki ostrożności powinny być stosowane przy każdym doświadczeniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka LB	Difco Laboratories	244620	Przepis dostępny również w referencji 6
Bufor TE:
EDTA sól disodowa dwuwodna	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	Środek dezynfekcyjny
Ethanol	Fisher Scientific	A406	Do użytku jako środek dezynfekcyjny, przygotować roztwór 70%(v/v) w wodzie destylowanej