Aseptyczne techniki laboratoryjne: przenoszenie objętości za pomocą pipet serologicznych i mikropipet

Podsumowanie

Podczas pracy w laboratorium niezbędne jest zminimalizowanie źródeł kontaminacji. Technika aseptyczna odnosi się do procedur umożliwiających przenoszenie kultur i odczynników przy jednoczesnym unikaniu kontaktu z powierzchniami nieszterylnymi. Pipety serologiczne i mikropipety są wykorzystywane do odmierzania precyzyjnych objętości bez naruszania sterylności roztworów stosowanych w eksperymentach.

Streszczenie

Drobnoustroje znajdują się wszędzie – w powietrzu, glebie i ludzkim organizmie, a także na nieożywionych powierzchniach, takich jak blaty laboratoryjne i klawiatury komputerowe. Powszechność mikrobów sprawia, że w laboratorium istnieje ogromna liczba potencjalnych zanieczyszczeń. Aby zapewnić sukces eksperymentalny, należy zminimalizować liczbę zanieczyszczeń na sprzęcie i powierzchniach roboczych. Powszechnymi technikami w wielu badaniach z zakresu mikrobiologii są metody obejmujące pomiar i przenoszenie kultur zawierających komórki bakteryjne lub cząsteczki wirusowe. Aby wykonać te czynności bez kontaktu z niesterylnymi powierzchniami lub zanieczyszczenia sterylnych pożywek, wymagane jest: (1) przygotowanie sterylnej przestrzeni roboczej, (2) precyzyjne ustawienie i dokładny odczyt urządzeń do aseptycznego przenoszenia cieczy oraz (3) prawidłowe operowanie instrumentami, kolbami z kulturami, butelkami i probówkami w obrębie pola sterylnego. Opanowanie tych procedur wymaga szkolenia i praktyki. Początkowo czynności powinny być wykonywane powoli, świadomie i w sposób kontrolowany, tak aby technika aseptyki stała się naturalnym nawykiem podczas pracy przy stole laboratoryjnym. W niniejszym materiale przedstawiamy kroki pomiaru objętości przy użyciu pipet serologicznych i mikropipet w obrębie pola sterylnego stworzonego przez palnik Bunsena. Pomiarowane objętości wahają się od mikrolitrów (μl) do mililitrów (ml) w zależności od zastosowanego instrumentu. Przenoszone ciecze obejmują zazwyczaj sterylne buliony lub roztwory chemiczne, a także kultury bakterii i zawiesiny fagowe. Postępując zgodnie z tymi procedurami, studenci powinni być w stanie: •Pracować w polu sterylnym stworzonym przez płomień palnika Bunsena. •Używać pipet serologicznych bez naruszania sterylności instrumentu. •Pobierać ciecze za pomocą pipet serologicznych, precyzyjnie odczytując skalibrowane objętości poprzez dopasowanie menisku cieczy do kresek graduacyjnych na pipecie. •Zachować sterylność butelek z kulturami, kolb, probówek i odpowiadających im nakrętek podczas przenoszenia cieczy. •Zidentyfikować różne zastosowania plastikowych i szklanych pipet serologicznych. •Określić ograniczenia dokładności mikropipet. •Precyzyjnie i dokładnie ustawiać objętości na mikropipetach. •Wiedzieć, jak prawidłowo korzystać z pierwszego i drugiego stopnia zatrzymania tłoka w mikropipecie w celu pobrania i przeniesienia prawidłowych objętości.

Protokół

1. Przygotowanie sterylnego miejsca pracy

1. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek procedur sterylizacji w obszarze roboczym, dokładnie umyj ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.
   • Pamiętaj o ponownym umyciu rąk za każdym razem, gdy podejrzewasz zanieczyszczenie wynikające z przeprowadzonych manipulacji eksperymentalnych.
2. Uprzątnij wszystkie materiały zagracające obszar roboczy na blacie laboratoryjnym. Wyjmij z pojemnika nawilżoną chusteczkę dezynfekcyjną i przetrzyj całą powierzchnię. Pozostaw środek dezynfekcyjny do odparowania – nie wycieraj do sucha!
   • Stosuj środki dezynfekcyjne takie jak alkohol (izopropanol lub 70% etanol) lub związki fenolowe (o-fenylfenol).
   • Aby zapobiec aerozolizacji, czyli powstawaniu drobnej mgiełki zawierającej komórki bakteryjne, oraz rozprzestrzenianiu się zanieczyszczeń mikrobiologicznych, unikaj dozowania środka dezynfekcyjnego z butelki z atomizerem.
   • Desykacja mikroorganizmów jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dekontaminacji powierzchni.
   • Nawet jeśli ktoś niedawno korzystał z blatu laboratoryjnego i został on przetarty środkiem dezynfekcyjnym, ZAWSZE rozpoczynaj pracę w laboratorium od przetarcia blatu.
3. Po całkowitym wyschnięciu środka dezynfekcyjnego użyj zapalarki, aby zapalić palnik Bunsena. Wyreguluj płomień tak, aby w jego środku widoczny był niebieski stożek. Płomień wytwarza teraz przeciąg wstępujący, czyli konwekcyjne prądy powietrza, w których ciepłe powietrze unosi się w górę i oddala od płomienia (Rysunek 1). Wraz z unoszeniem się ciepła, mikroorganizmy i cząsteczki kurzu są wypychane w górę i z dala od bezpośredniego obszaru roboczego. Przez cały czas pracuj powoli, ostrożnie i rozważnie w obszarze stworzonym przez palnik Bunsena, nazywanym polem sterylnym. Pozostaw palnik Bunsena zapalony przez cały czas trwania procedury.
   • Wierzchołek niebieskiego stożka jest najgorętszą częścią płomienia.
   • Uważaj, aby nie zakłócić prądu wstępującego gwałtownymi ruchami, które drastycznie zmieniają przepływy powietrza wokół blatu laboratoryjnego. Tworzenie prądu wstępującego za pomocą palnika Bunsena minimalizuje możliwość opadania mikroorganizmów i kurzu na blat lub do otwartych butelek, probówek bądź kolb w obszarze roboczym.
4. Rozmieść na blacie laboratoryjnym, w pobliżu pola sterylnego, wszystkie przybory potrzebne do przeprowadzenia procedury. Upewnij się, że wszystkie materiały są odpowiednio opisane.
   • Przybory mogą obejmować pipety serologiczne i mikropipety, sterylne probówki do hodowli, sterylne kolby, butelki z pożywką płynną, sterylne probówki do mikrocentryfugi, końcówki do mikropipet, statywy na probówki, hodowle komórek bakteryjnych oraz zapasy fagów.
   • Pożywki płynne należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 15 minut w cyklu dla cieczy. Większe objętości pożywek (> 1L) wymagają dłuższego czasu autoklawowania. Szkło laboratoryjne i tworzywa należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez co najmniej 30 minut w cyklu grawitacyjnym (suchym).
   • Ogólnie sterylne roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do 5 miesięcy. Należy pamiętać, że czas przechowywania jest znacznie krótszy dla roztworów zawierających niestabilne składniki, takie jak antybiotyki – zawsze sprawdzaj zalecenia producenta.

2. Przenoszenie cieczy za pomocą pipet serologicznych

1. Pipety serologiczne występują w wielu rozmiarach i wariantach: plastikowe lub szklane, jednorazowe lub wielorazowe, z korkiem lub bez korka. Są one skalibrowane do pobierania objętości od 0,1 ml do 25 ml.
   • Najczęstsze rozmiary pipet serologicznych to 5 ml, 10 ml i 25 ml; powinny być one stosowane do aseptycznego przenoszenia cieczy o objętości 0,1 ml lub większej (panel A na Rysunku 2). Istnieją również większe pipety serologiczne, które mogą pobierać objętości do 10 ml; jednak w tym protokole skupiono się na powszechniejszych, mniejszych pipetach.
   • Do eksperymentów z zakresu mikrobiologii i hodowli tkankowych wymagane są pipety wstępnie sterylizowane z watowym korkiem. Korka nie należy usuwać z góry pipety; został on zaprojektowany jako bariera zapobiegająca przepełnieniu pipety.
   • W zależności od zastosowania stosuje się plastikowe lub szklane pipety serologiczne. Szkło jest niezbędne w przypadku rozpuszczalników organicznych. Oba rodzaje mogą być stosowane podczas przeprowadzania eksperymentów BSL-1 na blacie laboratoryjnym. W komorze laminarnej przy pracy z organizmami BSL-2, gdzie nie można używać palnika Bunsena, dopuszczalne są wyłącznie pipety plastikowe. Zaleca się również stosowanie plastiku przy przenoszeniu roztopionego agaru.
   • Pipety serologiczne dzielą się na dwa typy: TC („to contain” – do pomiaru objętości zawartej) lub TD („to deliver” – do pomiaru objętości dostarczonej). Pipety TC oddają całą objętość, włącznie z cieczą pozostającą w końcówce, i muszą być „wydmuchane” lub wypłukane, aby uzyskać określoną objętość. Pipety TD są skalibrowane tak, aby w końcówce pozostała niewielka ilość cieczy, której nie należy wydobywać. Należy sprawdzić etykietę na korpusie pipety w pobliżu góry, aby ustalić jej typ (Rysunek 3). Najczęściej stosowane są pipety TD, oznaczone u góry podwójnymi pierścieniami.
2. Wziąć sterylną plastikową pipetę serologiczną (zwaną również pipetą transferową objętościową) i ostrożnie usunąć papierową osłonkę z końca z watowym korkiem, odwijając ją jak skórkę banana – nie należy usuwać całej osłonki, aby chronić końcówkę pipety, która będzie miała kontakt z przenoszoną cieczą. Dotykać dłońmi tylko górnej części pipety (powyżej znaczników skali).
   • Nigdy nie należy wprowadzać używanej pipety do sterylnego roztworu, nawet jeśli dołożono ogromnej staranności, aby zachować jej sterylność.
   • Szklane pipety serologiczne są zazwyczaj przechowywane w metalowych pojemnikach (panel B na Rysunku 2). Poluźnić górną część pojemnika, ostrożnie zdjąć zakrętkę, a następnie wysterylizować płomieniem otwarte końce zakrętki i pojemnika. Położyć zakrętkę bokiem na zdezynfekowanym blacie. Wyjąć jedną pipetę z pojemnika, trzymając go poziomo i delikatnie potrząsając, tak aby górne części jednej lub dwóch pipet wystawały około cala i można je było łatwo chwycić. Położyć pojemnik na boku i wyjąć jedną pipetę, uważając, aby nie dotykać pozostałych pipet w pojemniku. Nie dotykać dłońmi dolnej końcówki pipety i unikać kontaktu końcówki z innymi niesterylnymi powierzchniami.
3. Do górnego końca pipety serologicznej przymocować pomocnik do pipetowania, taki jak gruszka, pompka lub pipetnik automatyczny. Zdjąć papierową osłonkę z plastikowej pipety. Trzymać pomocnik w prawej ręce.
   • W przypadku użycia pipety szklanej, przeprowadzić dolną jedną trzecią pipety przez niebieski stożek w płomieniu palnika Bunsena przez 1-3 sekundy. Obrócić pipetę o 180° podczas przechodzenia przez płomień. Pipet plastikowych i probówek nie wolno sterylizować płomieniem.
   • Osoby leworęczne powinny trzymać pomocnik w lewej ręce i wykonywać kolejne czynności z butelkami i probówkami z kulturą prawą ręką.
   • Kontaminacja w przypadku pipet plastikowych często zdarza się podczas wyciągania ostatnich cali pipety z osłonki, ponieważ sterylna końcówka styka się z częścią osłonki dotykaną dłońmi.
4. Zdjąć zakrętkę z butelki zawierającej sterylną pożywkę. Nie kłaść zakrętki na blacie laboratoryjnym, lecz trzymać ją między palcem serdecznym a dłonią prawej ręki, manipulując pomocnikiem do pipetowania za pomocą kciuka, palca wskazującego i środkowego tej samej ręki (Rysunek 4). Trzymając butelkę pod kątem 45°, przeprowadzić krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena, tworząc pole sterylne wokół otwartej butelki.
   • Choć najlepiej tego unikać, jeśli konieczne jest odłożenie zakrętki, należy położyć ją otworem dołu na zdezynfekowanej powierzchni. W przypadku zakrętki skierowanej otworem do góry istnieje większa szansa na kontaminację z powodu ruchu przedmiotów lub dłoni, co tworzy prądy powietrza powodujące opadanie mikroorganizmów i cząsteczek kurzu na wewnętrzną powierzchnię zakrętki.
   • Celem opalania nie jest sterylizacja, lecz rozgrzanie otworu butelki i stworzenie konwekcyjnych prądów powietrza skierowanych w górę, z dala od otworu (tzw. prąd wstępujący). Ciepłe, wznoszące się powietrze pomaga zapobiec przedostawaniu się cząsteczek kurzu i innych zanieczyszczeń do butelki.
   • Pozostawiać sterylny pojemnik otwarty jak najkrócej. Ważne jest, aby przez cały czas trwania procedury minimalizować punkty wniknięcia mikroorganizmów przenoszonych powietrzem.
   • Unikać kaszlania, kichania, rozmowy i innych nieumyślnych ruchów, gdy sterylne pojemniki są otwarte.
   • Nigdy nie przekładać dłoni i palców nad górną częścią pola sterylnego (np. nad otwarte butelki lub kolby, wnętrze probówek i zakrętki butelek) po tym, jak zostały one przeprowadzone przez płomień palnika Bunsena.
   • Zawsze pracować z otwartym płomieniem podczas otwierania sterylnych probówek lub butelek. Nigdy nie otwierać na blacie więcej niż jednej probówki, butelki lub kolby jednocześnie. Opalanie powinno być wykonane natychmiast po otwarciu i tuż przed zamknięciem probówek, butelek i kolb.
5. Wprowadzić końcówkę pipety serologicznej do butelki z jałową pożywką, a następnie zasysać (pobrać aseptycznie) próbkę z butelki. Użyć pomocnika do pipetowania, aby kontrolować przepływ próbki do pipety. Dokładnie odczytać objętość pobraną do pipety, dopasowując menisk utworzony na szczycie słupa cieczy do znaczników skali na skalibrowanej pipecie (Rysunek 5).
   • NIE PIPETOWAĆ USTAMI! Zawsze używać pomocnika do pipetowania (pompy, gruszki lub pipetnika).
   • Zwrócić uwagę na kolejność liczb podczas określania pobranej objętości. Liczby mogą być nadrukowane od końcówki do góry, w odwrotną stronę lub często w obu kierunkach.
   • Podczas odczytu objętości zawsze trzymać pipetę pionowo, prostopadle do podłoża, i patrzeć na menisk cieczy bezpośrednio na wysokości oczu.
   • Dokładność pipet serologicznych jest ograniczona do najmniejszego zaznaczonego przyrostu, który zazwyczaj wynosi 0,1 ml dla pipet 5 ml i 10 ml oraz 0,2 ml dla pipet 25 ml. Jeśli wymagana jest większa precyzja, pipetę serologiczną można stosować w połączeniu z mikropipetą.
6. Ponownie przeprowadzić krawędź butelki przez płomień palnika Bunsena, a następnie zakręcić butelkę. Odstawić butelkę z pożywką.
   • Uważając, aby nie poparzyć się palnikiem Bunsena w pośpiechu przy zamykaniu butelki.
7. Trzymać probówkę lub kolbę w lewej ręce. Zdjąć i trzymać zakrętkę zgodnie z opisem w kroku nr 4 powyżej. Stworzyć pole sterylne, opalając krawędź probówki lub kolby w palniku Bunsena.
8. Przenieść pożywkę z pipety do probówki lub kolby. Kontrolować przepływ próbki tak, aby nie rozpryskiwała się poza probówkę lub kolbę.
   • Objętości można mierzyć tak, aby oddać całą zawartość i całkowicie opróżnić pipetę, lub uzyskać konkretną objętość, wykonując dozowanie punkt do punktu (od jednego znacznika objętości do drugiego).
9. Ponownie przeprowadzić krawędź probówki lub kolby przez płomień palnika Bunsena, a następnie założyć zakrętkę. Odstawić probówkę lub kolbę. Zdjąć pomocnik do pipetowania i wyrzucić pipetę do odpowiedniego pojemnika na odpady.
   • Plastikowe pipety serologiczne są jednorazowe, natomiast szklane pipety serologiczne można sterylizować i używać ponownie. Prawidłowa utylizacja wymaga umieszczenia plastikowych pipet w wyznaczonym pojemniku na odpady ostre (sztywnym pudełku z plastikowym workiem na odpady), natomiast pipety szklane należy początkowo zanurzyć w pojemniku z 10% roztworem wybielacza, aby zdezynfekować powierzchnie wewnętrzne i zewnętrzne. Następnie pipety szklane należy dokładnie umyć detergentem laboratoryjnym, opłukać wodą destylowaną i wysterylizować w autoklawie.
10. Te same kroki należy stosować podczas szczepienia pożywek kulturą bakteryjną lub zapasem fagów, a także przy przeprowadzaniu rozcieńczeń seryjnych.

3. Przenoszenie cieczy za pomocą mikropipet

1. Precyzyjne pomierzenie i dozowanie niewielkich objętości można przeprowadzić za pomocą mikropipet (zwanych również Pipetman; panel A na rysunku 6). Instrumenty te występują w różnych rozmiarach, z których każdy ma określony zakres objętości: P2 dla 0,2-2 μl, P10 dla 1-10 μl, P20 dla 2-20 μl, P20 dla 20-20 μl i P10 dla 20-100 μl.
   • Z mikropipetami należy obchodzić się z ostrożnością, ponieważ są to instrumenty precyzyjne. Nie należy pozostawiać ich bez nadzoru na blacie laboratoryjnym, gdzie mogłyby zostać potrącone i uszkodzone. Nie wolno dopuścić do kontaktu pipet z chemikaliami żrącymi.
   • W przypadku objętości przekraczających 10 μl należy użyć pipety serologicznej.
   • Mimo pracy w strefie sterylnej wytworzonej przez palnik Bunsena, nie wolno sterylizować płomieniem mikropipet, probówek i plastikowych końcówek. Probówki i końcówki powinny być wstępnie wysterylizowane. Przed użyciem mikropipety można przetrzeć nawilżoną chusteczką dezynfekcyjną.
2. Wartość objętości dozowanej wyświetlana na cyfrowym wolumetrze może być ustawiona za pomocą pokrętła regulacyjnego. Należy ustawić objętość przed przejściem do kroku nr 3.
   • NIGDY NIE PRZEKRACZAĆ ZAKRESU REGULACJI POKRĘTŁEM POWYŻ ZAMIERZONYCH WARTOŚCI!
   • Aby uzyskać maksymalną dokładność podczas zmniejszania ustawienia objętości w mikropipecie, należy powoli obracać kółko nastawcze kciukiem, uważając, aby nie przekroczyć znaku podziałki.
   • Aby uzyskać maksymalną dokładność podczas zwiększania ustawienia objętości w mikropipecie, należy obrócić kółko nastawcze kciukiem, przekraczając pożądaną podziałkę o 1/3 obrotu, a następnie powoli obracać kółko w dół, aż do osiągnięcia zamierzonej objętości, uważając, aby nie przekroczyć znaku podziałki.
   
   Wolumetr pokazuje trzy liczby. W zależności od mikropipety liczby te są interpretowane w różny sposób. Należy pamiętać, że dokładność każdej mikropipety jest ograniczona do najmniejszej podziałki.
   P2: Dla objętości od 0,2-2,0 μl. Górna liczba oznacza objętość w mikrolitrach. Druga liczba wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl), a trzecia liczba reprezentuje setne części mikrolitra (0,01 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch tysięcznych (0,002 μl) mikrolitra.
   P10: Dla objętości od 1,0-10,0 μl. Górna liczba odpowiada dziesiątkom mikrolitrów; zazwyczaj jest ona ustawiona na „0” i powinna być ustawiona na „1” tylko przy pozostałych dwóch liczbach ustawionych na „0”, gdy dozuje się 10,0 μl. Środkowa liczba oznacza objętość w mikrolitrach. Trzecia liczba wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch setnych (0,02 μl) mikrolitra.
   P20: Dla objętości od 2,0-20,0 μl. Górna liczba w kolorze czarnym odpowiada dziesiątkom mikrolitrów; powinna być ustawiona na „2” przy pozostałych dwóch liczbach ustawionych na „0” tylko podczas dozowania 20,0 μl. Druga liczba w kolorze czarnym oznacza objętość w mikrolitrach. Trzecia liczba w kolorze czerwonym wskazuje dziesiąte części mikrolitra (0,1 μl). Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch setnych (0,02 μl) mikrolitra.
   P20: Dla objętości od 20,0-20 μl. Górna liczba odpowiada setkom mikrolitrów; powinna być ustawiona na „2” przy pozostałych dwóch liczbach ustawionych na „0” podczas dozowania 20 μl. Środkowa liczba wskazuje dozowaną objętość w dziesiątkach mikrolitrów, a trzecia liczba oznacza objętość w mikrolitrach. Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch dziesiątych (0,2 μl) mikrolitra.
   P10: Dla objętości od 20-100 μl. Górna liczba odpowiada tysiącom mikrolitrów; zazwyczaj jest ustawiona na „0” i powinna być ustawiona na „1” przy pozostałych dwóch liczbach ustawionych na „0” podczas dozowania 10 μl. Środkowa liczba odpowiada setkom mikrolitrów. Dolna liczba odpowiada dziesiątkom mikrolitrów. Każda kreska podziałki odpowiada przyrostowi dwóch (2 μl) mikrolitrów.
   
   • Kontrola wydajności: Instrumenty te powinny być kalibrowane corocznie, aby zapewnić utrzymanie dokładności i precyzji w granicach ± 5% specyfikacji. Należy użyć wagi analitycznej do pomiaru wody, upewniając się, że ustawienia minimalne i maksymalne odpowiadają zamierzonej objętości. Na przykład, należy użyć P100 do przeniesienia 20 μl wody do naczynia wagowego na wadze. Ponieważ woda ma gęstość 1, 1 ml wody odpowiada 1 gramowi (g). Zatem 20 μl (0,2 ml) wody powinno odpowiadać 0,2 g. Należy również upewnić się, że końcówka nie przecieka i może utrzymać pożądaną objętość aż do momentu wydzielenia za pomocą systemu tłoka.
3. Mikropipety muszą być zawsze używane z plastikowymi końcówkami jednorazowymi. Należy ściśle nasadzić końcówkę na koniec korpusu mikropipety. Należy nacisnąć i lekko obrócić, aby zapewnić szczelność powietrzną.
   • Końcówki są zazwyczaj pakowane w plastikowe pudełka, które można sterylizować w autoklawie. Otwórz pudełko, aby wyciągnąć końcówkę, a następnie zamknij je, aby zminimalizować kontakt zanieczyszczeniami z powietrza.
   • Niektóre końcówki posiadają filtry podobne do watowanych korków w pipetach serologicznych. Końcówki te są często droższe od zwykłych i stosuje się je w specjalistycznych zastosowaniach. Na przykład przy pomiarze lotnych chemikaliów, takich jak chloroform, lub cieczy radioaktywnych, takich jak DNA znakowane ³²P, stosowanie końcówek z filtrem pomaga zapobiec zanieczyszczeniu korpusu mikropipety.
4. Mikropipetę należy trzymać w pozycji pionowej.
   • Utrzymywanie mikropipety w pionie zapobiegnie przedostawaniu się cieczy do wnętrza i zanieczyszczeniu korpusu mikropipety.
5. Mikropipeta ma trzy pozycje: (1) pozycja spoczynkowa, (2) pierwszy stopień i (3) drugi stopień (rysunek 6, panel B). Instrument posiada dwustopniowy system tłoka. Pierwszy stopień pełni dwie funkcje. Pierwszą jest pobranie pożądanej objętości cieczy do końcówki podczas zwalniania tłoka z pierwszego stopnia do pozycji spoczynkowej. Druga funkcja polega na wydzieleniu większości cieczy z końcówki podczas naciskania tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego stopnia. Dalsze dociśnięcie tłoka do drugiego stopnia wydziela pozostałą w końcówce ciecz.
   Naciśnij przycisk tłoka z pozycji spoczynkowej do pierwszego stopnia. Zostanie przemieszczona ilość powietrza równa ustawionej objętości.
6. Zanurz końcówkę w cieczy, trzymając przycisk wciśnięty do pierwszego stopnia.
   • Nie dotykaj samą mikropipetą ścianek butelek, probówek i kolb; w przeciwnym razie wewnętrzne powierzchnie tych naczyń zostaną zanieczyszczone. Tylko końcówki są sterylne.
7. Powoli zwolnij przycisk, aby zassać ciecz do końcówki. Przestań, gdy przycisk powróci do pozycji spoczynkowej. Odczekaj chwilę, aby ciecz mogła zostać wciągnięta do końcówki.
   • Objętość cieczy w końcówce będzie równa ustawionej objętości mikropipety.
   • Ciecze lepkie, takie jak te zawierające glicerol, wymagają więcej czasu na dostanie się do końcówki.
8. Wyjmij końcówkę z cieczy i sprawdź wizualnie, czy pobrana ciecz osiągnęła oczekiwany poziom w końcówce i czy wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza.
   • W razie potrzeby wyrzuć ciecz i ręcznie mocniej dociśnij końcówkę do mikropipety. Ponownie pobierz ciecz i sprawdź raz jeszcze.
9. Umieść końcówkę pod kątem (od 10° do 45°) przy ścianie probówki przyjmującej ciecz. Aby wydzielić ciecz, powoli naciśnij przycisk tłoka do pierwszego stopnia. Odczekaj chwilę, a następnie naciśnij przycisk do drugiego stopnia, aby wydzielić resztki cieczy z końcówki.
   • Zbyt szybkie naciśnięcie tłoka może spowodować rozbryzganie wydzielanej cieczy lub powstawanie niepożądanych pęcherzyków w probówce.
10. Zanim zwolnisz tłok do pozycji spoczynkowej, wyjmij końcówkę z cieczy.
11. Wyrzuć końcówki do wyznaczonego pojemnika na odpady ostre, naciskając przycisk wyrzucania w mikropipecie.

4. Sprzątanie miejsca pracy

1. Po zakończeniu eksperymentu wymagającego stosowania technik aseptycznych, wyłączyć palnik Bunsena, a następnie schować wszystkie materiały i odczynniki. Przetrzeć powierzchnie zewnętrzne sprzętu laboratoryjnego (butelek, mikropipet, pudełek z końcówkami do pipet) nasączoną chusteczką dezynfekującą, aby zapobiec przeniesieniu zanieczyszczeń do miejsca przechowywania.
2. Zanieczyszczone szkło laboratoryjne oraz niebezpieczne odpady umieścić w odpowiednim pojemniku na odpady. Odpady laboratoryjne obejmują takie elementy jak rękawiczki, pipety, końcówki i probówki. Niezakaźne odpady niebezpieczne powstają podczas przeprowadzania eksperymentów z organizmami niepatogennymi (BSL-1), natomiast zakaźne odpady niebezpieczne powstają podczas pracy z organizmami patogennymi (BSL-2 lub wyższe). Odpady zakaźne muszą zostać poddane autoklawowaniu lub dezynfekcji przed utylizacją. Należy przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa laboratoryjnego opisanych w BMBL (5^th Ed.) oraz zasad dostarczonych przez OSHA i instytucjonalne działy BHP (Environmental Health and Safety).
3. Przetrzeć cały obszar roboczy na blacie laboratoryjnym nasączoną chusteczką dezynfekującą z pojemnika, ponownie pozwalając środkowi dezynfekcyjnemu odparować.
4. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyć ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.

5. Reprezentatywne wyniki

Przykładowe zastosowanie pipet serologicznych do przenoszenia cieczy przedstawiono na Rysunku 7. Pipety te są często wykorzystywane w laboratoriach mikrobiologicznych do przygotowywania pożywek do szczepienia kultur bakteryjnych. Na przykład, sterylne kolby wypełnia się najpierw określoną objętością bulionu hodowlanego, w tym przypadku bulionu Luria (LB), a następnie do pożywki dodaje się niewielką liczbę komórek (np. E. coli). Za pomocą pipety serologicznej bulion musi zostać najpierw aseptycznie przeniesiony z butelki z pożywką do kolby. W tym przypadku do sterylnej kolby o pojemności 125 ml dodano 25 ml LB, używając pipety serologicznej o pojemności 25 ml. Następnie bulion musi zostać zaszczepiony komórkami E. coli. Tutaj 10 μl komórek przeniesiono aseptycznie za pomocą mikropipety P20 z kolby z wcześniej namnażaną kulturą do 25 ml świeżego LB. Kolbę inkubuje się w komorze wzrostowej przez określony czas, umożliwiając replikację komórek (w tym przykładzie komórki E. coli inkubowano przez noc w temperaturze 37 °C na platformie wytrząsowej). Wynikiem jest mętna kultura komórek bakteryjnych, która może być wykorzystana w kolejnych eksperymentach.

Pipety serologiczne mogą być również wykorzystywane do przenoszenia pożywek dostarczanych pierwotnie w butelkach do probówek lub między probówkami, co ma miejsce podczas wykonywania rozcieńczeń kultury bakteryjnej. Jeśli podczas tego typu manipulacji z pożywkami nie zostanie zachowana technika aseptyczna, kultury zostaną zanieczyszczone, a kolejne eksperymenty z ich wykorzystaniem ulegną opóźnieniu, ponieważ konieczne będzie przygotowanie świeżych, niezanieczyszczonych kultur. Błędy wynikają z nieutrzymania sterylności w trakcie całej procedury. Na przykład można zapomnieć o zdezynfekowaniu blatu laboratoryjnego lub opaleniu krawędzi butelki z kulturą lub probówki. Można również dotknąć końcówki pipety lub położyć korek butelki lub probówki na blacie zamiast trzymać go w dłoni. Prawidłowa procedura jest kluczowa dla zminimalizowania zanieczyszczeń pożywek i kultur. Rysunek 8A przedstawia przykład czystej oraz zanieczyszczonej kultury E. coli w probówce zawierającej 5 ml LB. Panel lewy pokazuje kulturę wykazującą jednolitne, delikatne zmętnienie typowe dla czystej kultury E. coli. W przeciwieństwie do niej, panel prawy przedstawia kulturę zanieczyszczoną, w której cechy wzrostu odbiegają od tych oczekiwanych dla tego szczepu bakteryjnego.

Podczas posługiwania się pipetami serologicznymi mogą wystąpić błędy techniczne prowadzące do przeniesienia niewłaściwych objętości pożywki między probówkami. Na przykład można błędnie odczytać objętość na pipecie (np. górna krawędź w stosunku do dolnej krawędzi menisku) lub całkowicie opróżnić pożywkę z pipety typu TD, która została zaprojektowana tak, aby niewielka ilość cieczy pozostała w końcówce i nie była dozowana. Przy wykonywaniu odmierzania pożywki metodą punkt-punkt można użyć niewłaściwych kresek kalibracyjnych i odmierzyć błędną objętość. Rysunek 8B przedstawia przykład probówek z poprawnymi i błędnymi objętościami pożywki. Probówka po lewej zawiera 3,5 ml LB odmierzone pipetą serologiczną o pojemności 5 ml. Student zastosował metodę odmierzania punkt-punkt, w której pożywkę LB pobrano do kreski 5,0 ml, a następnie odpompowano do kreski 1,5 ml. Probówka po prawej zawiera 2,5 ml LB odmierzone pipetą o tej samej pojemności, ponieważ student wykonujący odmierzanie punkt-punkt błędnie dozował pożywkę od kreski 5,0 ml do kreski 2,5 ml. Błąd ten spowoduje uzyskanie kultury bakterii o wyższym stężeniu niż planowano, co doprowadzi do błędów w kolejnych rozcieńczeniach. Ta kumulacja błędów może skutkować niepowodzeniem eksperymentu, który musiałby zostać powtórzony przy zastosowaniu prawidłowych stężeń komórek.

Przykładowe zastosowanie mikropipet do przenoszenia cieczy przedstawiono na Rysunku 9. Pipety te są wykorzystywane w wielu eksperymentach z zakresu biologii molekularnej i mikrobiologii, w tym do przygotowywania próbek do PCR i elektroforezy żelowej oraz do szczepienia sterylnych pożywek lub buforów małymi objętościami (poniżej 1,0 ml) komórek bakteryjnych lub cząsteczek fagów. W przedstawionym przykładzie student przeniósł 12,5 μl buforu TE do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,8 ml (lewa probówka w panelu A; należy zauważyć, że do buforu dodano barwnik, aby ułatwić wizualizację cieczy wewnątrz przezroczystych probówek). Procedura ta wymagała od studenta najpierw wybrania odpowiedniej mikropipety, w tym przypadku P20, a następnie ustawienia wolumetru na właściwą objętość (panel B). Użyto końcówki z watowaną zapinką na końcu, aby zapobiec przedostaniu się ewentualnych zanieczyszczeń z korpusu mikropipety do próbki buforu w końcówce. Środek ostrożności ten nie jest konieczny, jeśli podczas aspiracji cieczy do końcówek robi się to uważnie, powoli naciskając tłok, aby ciecz nie rozpryskała się do wnętrza pipety. Mogą wystąpić błędy techniczne skutkujące przeniesieniem niewłaściwych objętości. Na przykład można wybrać niewłaściwą mikropipetę do danego zadania lub ustawić wolumetr w odpowiedniej mikropipetzie na błędną wartość. Przed zanurzeniem końcówki w buforze można nacisnąć tłok poza pierwszy zatrzask, co spowoduje zassanie nadmiaru buforu do końcówki po zwolnieniu tłoka. Alternatywnie, można nie zanurzyć końcówki wystarczająco głęboko w buforze, przez co do końcówki zostanie zassane powietrze zamiast buforu. Można zapomnieć o dociśnięciu tłoka do drugiego zatrzasku podczas dozowania buforu do probówki, co spowoduje wydzielenie z końcówki objętości mniejszej niż pożądana. Prawa probówka w panelu A na Rysunku 9 przedstawia probówkę do mikrowirówki zawierającą niewłaściwą objętość buforu w stosunku do probówki po lewej stronie. Zamiast dozować 12,5 μl buforu, student dozował 125 μl. W tym przypadku, mimo że na wolumetrze ustawiono identyczne cyfry, do zadania wybrano niewłaściwą mikropipetę (student użył P20 zamiast P20; panel B), co doprowadziło do podania znacznie większej objętości buforu. Gdyby ten roztwór był używany do przygotowania mieszaniny odczynników dla aplikacji takiej jak PCR, błąd ten zmieniłby końcowe stężenie wszystkich odczynników dodawanych następnie do tej samej probówki. W konsekwencji mało prawdopodobne jest, aby eksperyment zakończył się sukcesem, ponieważ procedury biologii molekularnej, takie jak PCR, wymagają, aby wszystkie składniki miały określone stężenia, by reakcja przebiegła prawidłowo.

Ponieważ nie zawsze jest możliwe zapewnienie sterylności mikropipet (zwłaszcza wnętrza cylindra), roztwory zapasowe mogą ulec zanieczyszczeniu, co prowadzi do niepowodzeń nawet w przypadku prób rozwiązania problemów podczas przeprowadzania eksperymentów. W przypadku użycia mikropipet do przenoszenia sterylnych roztworów zdecydowanie zaleca się przygotowanie alikwotów roztworów zapasowych (pożywek, buforów, wody) przy użyciu techniki aseptycznej z wykorzystaniem pipet serologicznych. Powszechną praktyką jest przechowywanie roboczych roztworów zapasowych w sterylnych probówkach stożkowych o pojemności 15 ml lub 50 ml. Są one często łatwiejsze w obsłudze podczas pracy z mikropipetą i mogą zostać zastąpione świeżym alikwotem roztworu zapasowego w przypadku zanieczyszczenia podczas przenoszenia objętości.

Rysunek 1. Pole sterylne utworzone przez prąd wstępujący płomienia palnika Bunsena. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia sterylnych roztworów i kultur, kluczowe jest, aby wszystkie manipulacje były wykonywane w obrębie pola sterylnego. Krawędzie szklanych probówek i kolb należy przeprowadzić przez wierzchołek niebieskiego stożka, czyli najgorętszą część płomienia. Probówek i końcówek plastikowych nie można opalaniać – powinny one zostać wysterylizowane alternatywnymi metodami przed użyciem.

Rycina 2. Pipety serologiczne stosowane do aseptycznego przenoszenia cieczy. (A) Od lewej do prawej przedstawiono rysunki pipet o pojemności 25 ml, 10 ml i 5 ml. (B) Pipety serologiczne mogą być plastikowe lub szklane. Pipety plastikowe są jednorazowe i zazwyczaj pakowane indywidualnie w papierowe i plastikowe etui, w których wszystkie powierzchnie wewnętrzne są sterylne (lewa strona). Pipety szklane mogą być używane wielokrotnie, pod warunkiem, że są czyszczone i sterylizowane pomiędzy użyciami; są one zazwyczaj przechowywane w metalowych pojemnikach (prawa strona).

Rysunek 3. Pipety serologiczne występują w dwóch typach: TC („do pomiaru objętości zawartej” – to contain) lub TD („do pomiaru objętości odmierzonej” – to deliver). Przedstawiono etykietę objaśniającą pipetę TD o pojemności 5 ml.

Rysunek 4. Technika aseptyczna. Podczas pobierania cieczy z butelki, kolby lub probówki z nakrętką, nigdy nie należy kłaść nakrętki na blacie. Zamiast tego należy trzymać nakrętkę w tej samej dłoni cotętęcie pipety, manipulując naczyniem z cieczą drugą ręką, zgodnie z przedstawionym schematem.

Rysunek 5. Menisk powstający podczas pobierania cieczy do pipety serologicznej. Objętość odpowiada znacznikowi graduacji na pipetcie, z którym wyrównuje się dolna krawędź menisku. W tym przykładzie menisk wyrównuje się ze znacznikiem graduacji 2,5 ml.

Rysunek 6. Mikropipeta jednokanałowa. (A) Przedstawiono przykładową mikropipetę z plastikowym końcówką zamocowaną do uchwytu końcówek. Wskazano położenie wolumetru, pokrętła do zmiany ustawienia wolumetru, uchwytu końcówek, przycisku wyrzucającego końcówki oraz przycisku tłoka. (B) Dwustopniowy system tłoka w mikropipecie.

Rycina 7. Użycie pipet serologicznych do przenoszenia pożywki do sterylnych kolb o pojemności 125 ml. Lewa kolba zawiera jedynie 25 ml pożywki (LB), natomiast prawa kolba zawiera kulturę E. coli powstałe w wyniku zaszczepienia pożywki LB komórkami, a następnie inkubowania przez noc w temperaturze 37 °CZauważ, że pożywka w kolbie po prawej stronie jest mętna z powodu wzrostu komórek.

Rysunek 8. Użycie pipet serologicznych do przenoszenia medium do sterylnych probówek. (A) Lewa probówka zawiera 5 ml czystej E. coli hodowla, natomiast prawa probówka zawiera 5 ml zanieczyszczonej hodowli komórek bakteryjnych. Należy zwrócić uwagę na różnice w charakterystyce wzrostu obu hodowli. Choć obie są mętne, hodowla po prawej stronie została zanieczyszczona grzybem lub innymi drobnoustrojami przeniesionymi drogą powietrzną, co nadało jej kolor i konsystencję odmienną od spodziewanej dla E. coli komórki. (B) Lewa probówka zawiera 3,5 ml LB, natomiast prawa probówka zawiera tylko 2,5 ml LB. Ta różnica w objętości była wynikiem błędu popełnionego podczas sekwencyjnego dozowania pożywki do probówek.

Rycina 9. Użycie mikropipet do przenoszenia buforu do sterylnych probówek do mikrowirówki. (A) Lewa probówka do mikrowirówki zawiera jedynie 12.5 μl buforu TE, natomiast w prawej probówce znajduje się 125 μl. Należy zwrócić uwagę, że do buforu dodano barwnik, aby ułatwić wizualizację cieczy wewnątrz przezroczystych probówek do mikrowirówki. (B) Lewy wolumetr należy do mikropipety P20, natomiast prawy do mikropipety P20. Częstym błędem jest wybór niewłaściwej mikropipety. Mimo że na wolumetrach P20 i P20 ustawiono identyczne wartości, wybór niewłaściwej mikropipety skutkuje przeniesieniem nieprawidłowych objętości.

Rycina 10. Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza stosowane w celu zapobiegania kontaminacji roztworów i kultur. Przedstawiono komorę bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzoną do pracy z organizmami klasy BSL-2.

Dyskusja

Technika aseptyczna odnosi się do zestawu rutynowych procedur stosowanych w celu zapobiegania zanieczyszczeniu sterylnych roztworów i kultur niepożądanymi mikroorganizmami w laboratorium. Techniki te są niezbędne w eksperymentach wymagających hodowli komórek. Choć nie jest możliwe osiągnięcie całkowicie sterylnych warunków pracy, procedury takie jak dezynfekcja powierzchni laboratoryjnych, tworzenie strefy sterylnej za pomocą palnika Bunsena, ograniczanie ekspozycji niezakorkowanych kultur i mediów na powietrze, sterylizacja materiałów, takich jak butelki, probówki i pipety szklane, oraz unikanie kontaktu sterylnych narzędzi z niesterylnymi powierzchniami, zmniejszają ryzyko zanieczyszczenia roztworów i kultur podczas eksperymentu. Celem jest, aby te środki ostrożności stały się odruchowe, co osiąga się poprzez szkolenie i praktykę podczas pracy w laboratorium.

Przenoszenie objętości sterylnych roztworów i kultur przy użyciu takich instrumentów jak pipety serologiczne i mikropipety jest jednym z wielu rodzajów rutynowych technik wykonywanych w laboratorium. Różne zastosowania eksperymentalne wymagają instrumentów zdolnych do przenoszenia odmiennych, a jednocześnie precyzyjnych i dokładnych objętości. Pipety serologiczne są stosowane w laboratoriach mikrobiologicznych do przygotowywania kultur komórkowych wymagających sporządzenia pożywek w objętościach wyrażonych w mililitrach, podczas gdy mikropipety są niezbędne w eksperymentach biologii molekularnej, w których potrzebne są jedynie mikrolitrowe ilości roztworów. Stosowanie technik aseptycznych przy użyciu tych instrumentów minimalizuje kontaminację podczas przenoszenia objętości, niezależnie od ilości cieczy czy rodzaju eksperymentu.

Choć nie omówiono tego w niniejszym protokole, innym powszechnie stosowanym sposobem zapobiegania kontaminacji jest praca wdymającej powietrze laminarnej komorze z nawiewem (Rysunek 10). Sprzęt ten jest niezbędny w hodowlach tkankowych oraz w eksperymentach przeprowadzanych z mikroorganizmami sklasyfikowanymi jako BLS-2 lub wyższymi. Komora z nawiewem laminarnym posiada filtr HEPA (wysokowydajny filtr cząsteczkowy), który usuwa z powietrza zanieczyszczenia przed jego wpłynięciem do komory, zapobiegając jednocześnie przedostawaniu się nieprzefiltrowanego powietrza z pomieszczenia do przestrzeni roboczej. Należy zauważyć, że wewnątrz komory z nawiewem laminarnym nie można używać palnika Bunsena, ponieważ ciepło generowane przez płomień zaburza przepływ powietrza, który jest kluczowy dla prawidłowego funkcjonowania urządzenia.

Podczas przeprowadzania eksperymentów często pomocne jest sprawdzenie jakości zastosowanej techniki aseptycznej. Aby potwierdzić, że roztwory i pożywki nie uległy zanieczyszczeniu podczas manipulacji eksperymentalnych, należy zawsze przygotować kontrolę negatywną. Na przykład, przygotowując probówki z pożywką płynną do hodowli bakterii, jednej probówki nie należy szczepić, pozostawiając w niej jedynie sterylną pożywkę. Inkubuje się ją razem ze zaszczepionymi probówkami, a następnie sprawdza, czy w niezaszczepionej probówce kontrolnej nie pojawiły się oznaki kontaminacji, takie jak zmętnienie wynikające z wzrostu niepożądanych komórek nieumyślnie wprowadzonych do naczynia. Jeśli probówka kontrolna jest zanieczyszczona, prawdopodobnie zanieczyszczone są również probówki eksperymentalne, a eksperyment będzie wymagał powtórzenia. Te środki ostrożności powinny być stosowane przy każdym doświadczeniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka LB	Difco Laboratories	244620	Przepis dostępny również w referencji 6
Bufor TE:
EDTA sól disodowa dwuwodna	Sigma-Aldrich	E5134
Trizma-HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories	8504	Środek dezynfekcyjny
Ethanol	Fisher Scientific	A406	Do użytku jako środek dezynfekcyjny, przygotować roztwór 70%(v/v) w wodzie destylowanej