Opisano małoinwazyjny protokół stabilizacji kręgosłupa myszy oraz wykonywania powtarzalnego obrazowania rdzenia kręgowego in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Metoda ta łączy urządzenie do stabilizacji kręgosłupa z reżimem anestezjologicznym w celu zminimalizowania ruchów wywołanych oddychaniem i uzyskania surowych danych obrazowych, które nie wymagają wyrównania ani innego przetwarzania końcowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
In vivo obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej 1 u myszy zmodyfikowanych genetycznie w celu ekspresji białek fluorescencyjnych w konkretnych typach komórek 2-3 znacząco poszerzyło naszą wiedzę na temat procesów fizjologicznych i patologicznych w wielu tkankach in vivo 4-7. W badaniach nad ośrodkowym układem nerwowym (OUN) szeroko stosowano obrazowanie in vivo mózgu, co doprowadziło do licznych, często nieoczekiwanych odkryć dotyczących zachowania komórek, takich jak neurony, astrocyty i mikroglej, w warunkach fizjologicznych lub patologicznych 8-17. Jednakże, głównie komplikacje techniczne ograniczały wdrażanie obrazowania in vivo w badaniach nad żywym rdzeniem kręgowym myszy. W szczególności bliskość anatomiczna rdzenia kręgowego względem płuc i serca generuje znaczące artefakty ruchowe, co sprawia, że obrazowanie żywego rdzenia kręgowego jest zadaniem trudnym.
Opracowaliśmy nową metodę, która pokonuje naturalne ograniczenia obrazowania rdzenia kręgowego poprzez stabilizację kolumny kręgosłupa i ograniczenie ruchów wywołanych oddychaniem, co ułatwia zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do obrazowania rdzenia kręgowego myszy in vivo. Osiągnięto to poprzez połączenie dostosowanego urządzenia do stabilizacji kręgosłupa z metodą głębokiej anestezji, co skutkuje znacznym zmniejszeniem ruchów oddechowych. Niniejszy protokół wideo pokazuje, jak odsłonić niewielki obszar żywego rdzenia kręgowego, który może być utrzymywany w stabilnych warunkach fizjologicznych przez dłuższy czas przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i krwawieniu. Reprezentatywne surowe obrazy pozyskane in vivo szczegółowo ukazują w wysokiej rozdzielczości bliską relację między mikroglejem a układem naczyniowym. Sekwencja timelapse przedstawia dynamiczne zachowanie wypustek mikrogleju w żywym rdzeniu kręgowym myszy. Ponadto ciągłe skanowanie tej samej płaszczyzny z demonstruje wyjątkową stabilność, jaką można osiągnąć za pomocą tej metody w celu generowania stosów obrazów i/lub filmów timelapse, które nie wymagają wyrównywania obrazów po akwizycji. Na koniec pokazujemy, jak metoda ta może być wykorzystana do ponownego obrazowania tego samego obszaru rdzenia kręgowego w późniejszych punktach czasowych, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych nad trwającymi procesami fizjologicznymi lub patologicznymi in vivo.
Protokół
1. Budowa urządzenia do stabilizacji kręgosłupa
- Zamów zaciski do rdzenia kręgowego Narishige STS-A Compact oraz adapter do stabilizacji głowy Narishige MA-6N.
- Zaprojektuj i wykonaj na zamówienie podstawę ze stali nierdzewnej, która utrzyma oba elementy Narishige w jednej linii, tak aby głowa zwierzęcia była podparta podczas zaciskania kręgosłupa i ogona. Należy pamiętać, że całe urządzenie musi zmieścić się pod obiektywem mikroskopu, zazwyczaj na obniżonym stoliku mikroskopowym.
2. Operacja zwierząt
- Podgrzej komorę mikroskopu za pomocą urządzenia grzewczego i utrzymuj temperaturę 37 °C.
- Zważ zwierzę i przygotuj mieszaninę anestetyczną zawierającą 100 mg ketaminy, 15 mg ksylazyny i 2,5 mg acepromazyny na kg masy ciała, rozcieńczoną w 0,9% NaCl w warunkach sterylnych.
- Zanurz zwierzę w znieczuleniu poprzez domięśniowy zastrzyk z mieszaniny anestetycznej (KXA). Należy regularnie uciskać palce, aby zapewnić głęboką anestezję przez cały czas trwania eksperymentu. W razie potrzeby podawaj połowę dawki początkowej co godzinę.
- Użyj maty grzewczej dla małych zwierząt, aby zapewnić wsparcie termiczne podczas przeprowadzania procedury chirurgicznej.
- Nałóż maść z sztucznymi łzami na oczy, aby zapobiec odwodnieniu i uszkodzeniu rogówki.
- Wygol grzbiet zwierzęcia najpierw za pomocą trymera, a następnie ostrą żyletką, aby całkowicie usunąć sierść z obszaru wokół nacięcia.
- Usuń wygolone włosy i zdezynfekuj powierzchnię skóry gazikiem nasączonym alkoholem.
- Wykonaj niewielkie (~1,5 cm) podłużne nacięcie skóry nad wybranym poziomem kręgosłupa (tutaj przedstawiono kręgi piersiowe).
- Odsłoń mięśnie grzbietu, ostrożnie odsuwając podskórną tkankę łączną.
- Ostrożnie oddziel mięśnie przykręgowe od kręgosłupa na wybranym poziomie. Wykonaj jak najmniejszą liczbę nacięć, aby odłączyć mięśnie z obu stron każdego wyrostka kolczystego, a następnie zeskrob odłączone mięśnie z powierzchni blaszki łukowatej.
- Wybierz blaszkę łukowatą do usunięcia i przygotuj miejsca wprowadzenia zacisków kręgosłupowych po obu stronach kręgosłupa, bezpośrednio rostralnie i kaudalnie względem laminektomii. Ostrożnie przesuń tkankę mięśniową, tworząc cztery kieszonki, w które zostaną wstawione zaciski.
- Unieś kręgosłup za pomocą pęsety z prostymi ząbkami, aby umożliwić bezpieczne wprowadzenie zakrzywionych nożyczek tępych pod blaszkę łukowatą bez dotykania rdzenia kręgowego. Wykonaj laminektomię, powoli przecinając kość z jednej, a następnie z drugiej strony.
- Użyj patyczka bawełnianego lub wprowadź docięte małe kawałki wchłanialnej gąbki żelatynowej (gelfoam) obok nacięć, aby ograniczyć niewielkie krwawienie. W razie potrzeby użyj kauteryzatora do małych naczyń, aby opanować dalsze krwawienie. Do przemywania tkanek użyj podgrzanego, sterylnego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF).
3. Stabilizacja kręgosłupa i przygotowanie do obrazowania in vivo
- Umieść zwierzę na podkładce podnoszącej na płycie podstawy urządzenia do stabilizacji kręgosłupa i zabezpiecz głowę w adapterze do utrzymywania głowy.
- Umieść zaciski rdzeniowe urządzenia STS-A wzdłuż osi przednio-tylnej zwierzęcia w przygotowanych wcześniej kieszeniach flankujących laminektomię (Rycina 1). Dwa zaciski powinny zostać umieszczone pod kątem ~45° względem osi rostro-kaudalnej zwierzęcia, aby zapewnić wystarczającą przestrzeń do opuszczenia obiektywu imersyjnego nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym (Rycina 1).
- Umieść trzeci zacisk urządzenia STS-A u nasady ogona, tak aby ciało zwierzęcia mogło zostać zawieszone w powietrzu po usunięciu podkładki podnoszącej na czas eksperymentów obrazowych (Rycina 1).
- Uformuj wokół odsłoniętego rdzenia kręgowego niewielką ściankę z Gelseal (Amersham Biosciences Corp.), aby ułatwić utrzymanie rdzenia kręgowego w ACSF oraz zanurzenie obiektywu mikroskopu w tym roztworze podczas obrazowania in vivo.
4. Obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej
- Przenieś zwierzę na urządzeniu do stabilizacji kręgosłupa do wnętrza podgrzanej komory osłaniającej mikroskop i zabezpiecz je na opuszczonym stole mikroskopu, umieszczając miejsce laminektomii bezpośrednio pod obiektywem (Rysunek 1).
- Ostrożnie zanurz obiektyw imersyjny w roztworze ACSF, upewniając się, że nie dotyka on zacisków rdzenia kręgowego ani Gelsealu.
- Użyj epifluorescencji, aby zidentyfikować obszar zainteresowania i ustawić na nim ostrość. Przełącz urządzenie w tryb skanowania laserowego i przeprowadź obrazowanie in vivo, stosując odpowiednią długość fali wzbudzenia laserem dwufotonowym, filtry dichroiczne i filtry przepustowe dla fluoroforów obecnych w obrazowanej tkance.
5. Powtarzalne obrazowanie i opieka pooperacyjna
- Po zakończeniu eksperymentów obrazowych wyjmij mysz z urządzenia do stabilizacji rdzenia kręgowego i ostrożnie usuń Gelseal z obszaru wokół laminektomii. Dokładnie oczyść ten obszar.
- Przywróć i zaszyj mięśnie grzbietu nad miejscem laminektomii.
- Przywróć i zaszyj skórę nad miejscem laminektomii, a następnie przemyj ją betadyną.
- Podaj podskórnie 1 ml roztworu Lactated Ringers (Baxter Healthcare) jako suplement odżywczy i nawadniający, a także lek przeciwbólowy (0,1 mg/kg buprenorfiny).
- Podaj do jam brzusznych środek antyseptyczny (0,03 ml na mysz, 2,27% enrofloksacyna w roztworze do wstrzykiwań).
- Umieść zwierzę na podgrzewanym podłożu aż do pełnego wybudzenia z anestezji, a następnie przenieś je do indywidualnego klatkowania.
- Powtarzaj podawanie antyseptyku codziennie przez pierwsze 3-5 dni po operacji oraz podawanie leku przeciwbólowego co 8-12 godzin przez 2-3 dni po zabiegu. Monitoruj zwierzę codziennie, aby upewnić się, że wykazuje prawidłowe zachowanie i w pełni powróciło do zdrowia.
- W przypadku ponownego obrazowania przez tę samą laminektomię, rozszij skórę oraz mięśnie i powtórz kroki opisane w sekcjach 2-4.
- Ponownie zlokalizuj wcześniej obrazowany obszar, wykorzystując naczynia krwionośne jako mapę, zgodnie z wcześniejszym opisem 10.
6. Reprezentatywne wyniki
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez instytucjonalne komisje ds. opieki i użytkowania zwierząt (Animal Care and Use Committees) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco oraz są zgodne z przepisami federalnymi. Zdjęcie urządzenia do stabilizacji kręgosłupa oraz schemat przedstawiający ułożenie myszy w urządzeniu pod obiektywem mikroskopu pokazano na Rysunku 1. Pozostawienie odpowiedniej przestrzeni na ruchy oddechowe pod ciałem zwierzęcia zapewnia stabilne obrazowanie in vivo rdzenia kręgowego. Rysunek 2 pokazuje bliską relację między mikroglejem a układem naczyniowym podczas obrazowania in vivo w rdzeniu kręgowym transgenicznych myszy Cx3cr1GFP/+18, w których mikroglej jest endogennie znakowany białkiem GFP. Rysunek 3 przedstawia przykłady powtarzalnego obrazowania in vivo przeprowadzonego w tych samych obszarach rdzenia kręgowego u myszy wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w aksonach rdzeniowych (linia YFP-H 3) oraz w mikrogleju (u myszy Cx3cr1GFP/+).
Rysunek 1. Stabilizacja kręgosłupa myszy do obrazowania in vivo z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. (A) Do podparcia i wyrównania kompaktowych zacisków do rdzenia kręgowego STS-A Narishige oraz adaptera do unieruchamiania głowy MA-6N Narishige użyto wykonanej na zamówienie stalowej płyty bazowej, jak pokazano tutaj. (B) Prawidłowe ułożenie dorosłych myszy transgenicznych znieczulonych środkiem znieczulającym KXA na urządzeniu do stabilizacji kręgosłupa. Wstawka przedstawia rozmieszczenie zacisków kręgosłupowych bezpośrednio rostralnie i kaudalnie względem laminektomii oraz odsłoniętej tkanki rdzenia kręgowego.
Rycina 2. Obrazowanie in vivo mikrogleju o wysokiej gęstości oraz naczyń krwionośnych w rdzeniu kręgowym znieczulonych myszy. Projekcje niewyrównanych stosów z-stack (A) gęstego mikrogleju GFP-dodatniego (zielony) w rdzeniu kręgowym myszy CX3CR1GFP/+ w bliskim sąsiedztwie naczyń krwionośnych (czerwony, znakowany poprzez dożylne wstrzyknięcie dekstranu z rodamyną). (B) Powiększony obraz, znakowany jak w (A), pojedynczej komórki mikrogleju przylegającej do ściany naczynia krwionośnego, z wypustkami rozciągającymi się wokół naczynia i w stronę miąższu rdzenia kręgowego. Paski skali, 10μm.
Rycina 3. Powtarzalne obrazowanie in vivo tych samych segmentów aksonalnych i mikrogleju podczas ich relokalizacji i ponownego obrazowania w rdzeniu kręgowym znieczulonych myszy w różne dni. (A) Aksony znakowane YFP w dniu 0 i 5. (B). Te same struktury naczyniowe i otaczające je komórki mikrogleju obrazowane in vivo w rdzeniu kręgowym myszy Cx3cr1GFP/+ w dniu 0 i 1. Paski skali, 10μm.
Film 1. Reprezentatywna sekwencja timelapse uzyskana in vivo z rdzenia kręgowego myszy. Sekwencja ta szczegółowo pokazuje dynamikę cienkich wypustek mikrogleju (zielony) oraz ich interakcje z naczyniami krwionośnymi (czerwony, znakowane poprzez dożylne wstrzyknięcie dekstranu z rodamyną) w czasie, w obrębie tkanki gęsto zasiedlonej przez struktury fluorescencyjne. Obrazy surowe zostały poddane jedynie korekcji szumu tła, jasności i kontrastu, a film timelapse powstał poprzez projekcję z (z-projection) sekwencyjnie pozyskanych stosów obrazów, bez wyrównywania obrazów, uśredniania lub selekcji poszczególnych płaszczyzn z. Naczynia krwionośne przechodzą przez podobny zakres płaszczyzn z co obrazy mikrogleju. Głębokość płaszczyzny z: 38 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Film 2. Sekwencja timelapse demonstrująca surową stabilność metody obrazowania na poziomie pojedynczej płaszczyzny z. Szybka akwizycja tej samej pojedynczej płaszczyzny z w rdzeniu kręgowym myszy CX3CR1GFP/+ umieszczonej na urządzeniu do stabilizacji rdzenia pod narkozą KXA wykazuje minimalne przesunięcie obrazu pomiędzy kolejnymi klatkami przy częstotliwości skanowania 1 klatka/s, co jest wartością szybszą niż częstotliwość oddychania myszy. Niewielkie pozostałe przesunięcie wynika prawdopodobnie z bicia serca. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda umożliwia stabilne i powtarzalne obrazowanie in vivo gęsto rozmieszczonych fluorescencyjnych struktur komórkowych w rdzeniu kręgowym znieczulonych myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej. Osiągnięta stabilność jest wynikiem zastosowania specjalnie wykonanego urządzenia do stabilizacji rdzenia oraz schematu znieczulenia, który redukuje artefakty ruchowe wywołane oddychaniem. Urządzenie do stabilizacji rdzenia zapewnia przestrzeń do oddychania pod ciałem myszy i może zostać zbudowane p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez grant RG4595A1/T National Multiple Sclerosis Society przyznany DD oraz granty NIH/NINDS NS051470, NS052189 i NS066361 przyznane K.A. Ryciny i filmy zostały zaadaptowane i/lub przedrukowane z Davalos et al., J Neurosci Methods. 2008 Mar 30;169(1):1-7 Copyright 2008, za zgodą wydawnictwa Elsevier.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dekstran z rodamyną B | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, rozcieńczony w ACSF (3% w/v) |
| Ketamina HCl | Bioniche Pharma | NDC No: 67457-001-10 | Do wstrzykiwania, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd, Inc. | NADA No: 139-236 | Ksylazyna do wstrzykiwania, 20mg/ml |
| Acepromazyna | Vedco, Inc. | NADA No: 117-531 | Do wstrzykiwania, 10mg/ml |
| Maść z sztucznymi łzami | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | NDC No: 57319-760- 25 | Lubrykant |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-061617 | |
| Nożyczki McPherson-Westcott | World Precision Instruments, Inc. | 555500S | Zakrzywione nożyczki z tępymi końcami |
| Pęseta prosta | World Precision Instruments, Inc. | 555047FT | Pęseta z ząbkowanymi końcami |
| Kauteryzator do małych naczyń | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Mixer Mill MM400 | |
| Kompaktowe klamry do rdzenia kręgowego | Narishige International | STS-A | |
| Adapter do stabilizacji głowy | Narishige International | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham | 80-6421-43 | |
| Płyn Ringera z mleczanem | Baxter Internationl Inc. | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC No: 12496- 6757-1 | Buprenorfina, do wstrzykiwania |
| Baytril | Bayer AG | NADA 140-913 | Enrofloksacyna, antybiotyk do wstrzykiwania 2,27% (20ml) |
| Mata grzewcza - duża | Fine Science Tools | 21060-10 |
Bibliografia
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer's disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
