Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Streszczenie

Rozwój i progresja chorób charakteryzują się częstymi aberracjami genetycznymi i epigenetycznymi, w tym rearanżacjami chromosomowymi, przyrostami i ubytkami liczby kopii oraz metylacją DNA. Postępy w technologiach wysokoprzepustowego profilowania całego genomu, takich jak mikromacierze, znacząco poprawiły naszą zdolność do identyfikacji i wykrywania tych specyficznych zmian. Jednak wraz z dalszym rozwojem technologii, ograniczającym czynnikiem pozostaje jakość i dostępność próbek. Co więcej, informacje kliniczne oraz dane o przebiegu choroby są często zbierane lata po pierwotnym pobraniu materiału. Próbki, zazwyczaj utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie (FFPE), są przechowywane w archiwach szpitalnych przez lata lub dziesięciolecia. DNA można wydajnie i skutecznie odzyskać z próbek zatopionych w parafinie, jeśli zastosuje się odpowiednią metodę ekstrakcji. Wysokiej jakości DNA wyekstrahowane z prawidłowo zakonserwowanych i przechowywanych próbek może stanowić podstawę do ilościowych analiz porównawczych tkanek zdrowych i chorych oraz generowania sygnatur genetycznych i epigenetycznych ¹. Aby wyekstrahować DNA z próbek zatopionych w parafinie, rdzenie tkankowe lub tkanki mikroprzesezonowane poddaje się działaniu ksylenu, który rozpuszcza parafinę z tkanki, a następnie rehydratuje za pomocą serii przemyć etanolem. Białka oraz szkodliwe enzymy, takie jak nukleazy, są następnie trawione przez proteinazę K. Dodatek buforu lizującego, który zawiera środki denaturujące, takie jak dodecyla siarczan sodu (SDS), ułatwia trawienie ². Kwasy nukleinowe są oczyszczane z lizatu tkankowego przy użyciu nasyconego buforem fenolu i wirowania przy wysokiej prędkości, co prowadzi do powstania roztworu dwufazowego. DNA i RNA pozostają w górnej fazie wodnej, podczas gdy białka, lipidy i polisacharydy są wydzielane odpowiednio do fazy międzyfazowej i organicznej. Pozyskanie fazy wodnej i powtarzane ekstrakcje fenolem pozwalają uzyskać czystą próbkę. Po ekstrakcjach fenolem dodaje się RNazę A w celu usunięcia zanieczyszczeń w postaci RNA. Dodatkowe ekstrakcje fenolem po inkubacji z RNazą A służą do usunięcia pozostałego enzymu. Dodatek octanu sodu i izopropanolu powoduje precypitację DNA, a wirowanie przy wysokiej prędkości jest wykorzystywane do sformowania granulatu DNA i ułatwienia usunięcia izopropanolu. Nadmiar soli przeniesiony z etapu precypitacji może zakłócać późniejsze analizy enzymatyczne, ale można go usunąć z DNA poprzez przemycie 70% etanolem, a następnie wirowanie w celu ponownego sformowania granulatu DNA ³. DNA jest resuspendowane w wodzie destylowanej lub wybranym buforze, kwantyfikowane i przechowywane w temperaturze -20°C. Oczyszczone DNA może być następnie wykorzystane w dalszych zastosowaniach, które obejmują, między innymi, PCR, komparatywną hybrydyzację genomową na mikromacierzach ⁴ (array CGH), immunoprecypitację zmetylowanego DNA (MeDIP) oraz sekwencjonowanie, co umożliwia integracyjną analizę próbek tkanek/guzów.

Protokół

1. Uwagi proceduralne

• Ksylen i fenol są toksycznymi chemikaliami i powinny być obsługiwane w dygestorium. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiału (MSDS).
• Ksylen rozpuszcza niektóre rodzaje tworzyw sztucznych; należy stosować probówki polipropylenowe, ponieważ są one odporne na te związki.
• Można zakupić specjalne końcówki z wewnętrznym korkiem węglowym, co zapobiega rozpuszczaniu przez ksylen gumowych elementów pipety. Alternatywnie można stosować końcówki z filtrem.

2. Usuwanie parafiny

1. W dygestorium dodaj 800 μl ksylenu (VWR, CABDH6216-4) do oznakowanej probówki zawierającej preparat, a następnie umieść ją na wytrząsarku z delikatnym mieszaniem przez 5 do 15 minut, aby rozpuścić parafinę.
2. Odwirować próbkę z maksymalną prędkością (14 000 rpm lub 16 000 x g) w mikrocentry fudze przez 3 minuty. Ostrożnie odessać nadsącz z ksylenu i przelać go do probówki z polipropylenu przeznaczonej do utylizacji odpadów ksylenowych. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.
3. Powtarzać kroki 1 i 2 płukania ksylenem do czasu całkowitego rozpuszczenia parafiny. Zazwyczaj wymaga to od dwóch do trzech płukań, w zależności od wielkości próbki tkanki. Całkowicie rozpuszczona próbka będzie wydawać się miękka i czasami może stracić spójność strukturalną. Spójność próbki można delikatnie ocenić za pomocą końcówki pipety.

3. Rehydratacja w etanolu

1. Dodać 800 μl 100% etanolu (v/v) klasy biologii molekularnej, wymieszać w wortexie, a następnie wirować przez 3 minuty przy 14 000 rpm w mikrowirowce. Usunąć znad osadu nadkład etanolowy, uważając, aby nie naruszyć osadu.
2. Dodać 800 μl 70% etanolu (etanol 100% (v/v) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH₂O)), wymieszać w wortexie i wirować przez 3 minuty przy 14 000 rpm. Ostrożnie usunąć nadkład etanolowy.
3. Dodać 800 μl 50% etanolu (etanol 100% (v/v) rozcieńczony w wodzie destylowanej (dH₂O)), wymieszać w wortexie i wirować przez 5 minut przy 14 000 rpm. Ostrożnie usunąć za pomocą pipety tak dużo etanolu, jak to możliwe. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie naruszyć osadu na tym etapie, ponieważ w pełni rehydratowana tkanka nie osadza się tak dobrze jak tkanka odwodniona.
4. Po usunięciu nadkładu etanolowego suszyć osad na powietrzu przez 5 minut, uważając, aby go nie przesuszyć.

4. Trawienie tkanek

1. Dodaj 200-500 μl buforu do lizy (wg poniższego składu). Resuspenduj osad za pomocą końcówki pipety lub wstrząsarki wortex. Dokładne resuspendowanie tkanki na tym etapie zapewni pełniejszą digestię próbki i lepszą wydajność izolacji DNA.
2. Inkubuj próbki w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub bloku grzejnym.
3. W przypadku rdzeni tkankowych, rano i wieczorem dodaj 20 μl proteinazy K (roztwór stokowy 20 mg/ml, Invitrogen, AM2548).
4. Powtarzaj powyższe etapy digestii przez 2 do 5 dni, aż tkanka zostanie całkowicie rozpuszczona.

Bufor do lizy

• 10 mM Tris-HCl pH 8.0
• 100 mM EDTA pH 8.0
• 50 mM NaCl
• 0.5% SDS
• 200 μg/ml proteinazy K (dodać bezpośrednio przed użyciem)

5. Oczyszczanie DNA

1. Dodaj taką samą objętość fenolu nasyconego buforem (Fisher, BP1750I-400) i wymieszaj przez odwracanie. Wiruj przez co najmniej 5 minut przy 14 000 rpm w mikrocentry fudze.
2. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki. Zwróć uwagę na interfazę: czy znajduje się tam dużo białego materiału?
3. Powtarzaj kroki 1 i 2 w odniesieniu do frakcji wodnej, aż interfaza stanie się przejrzysta (zazwyczaj 3 lub więcej razy). Przeprowadź ekstrakcje powrotne*, gdy interfaza jest rozmyta, aby zwiększyć końcową wydajność.
4. Gdy interfaza będzie przejrzysta, dodaj do wyekstrahowanej frakcji wodnej próbki taką samą objętość mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400). Mieszaj przez 5 minut, a następnie wiruj przez 5 minut przy 14 000 rpm. Pozwala to zredukować pozostałości fenolu i dodatkowo wyostrzyć interfazę, ułatwiając wydzielenie warstwy wodnej.
5. Przenieś warstwę wodną do nowej probówki i potraktuj RNazą A w stężeniu 100 μg/ml przez 1 godzinę w 37°C.
6. Powtórz kroki od 1 do 4, aby usunąć pozostałą RNazę A i zebrać frakcję wodną. Powinno wystarczyć 1 lub 2 etapy z użyciem fenolu nasyconego buforem, ponieważ ilość białka do usunięcia powinna być znacznie mniejsza niż w początkowym lizacie.

*Aby przeprowadzić ekstrakcje zwrotne, należy dodać 50-100 μl dH₂0 do probówki z próbką zawierającej interfazę i frakcję organiczną. Odwrócić probówkę w celu wymieszania, a następnie wirować próbkę w mikrocentryfudze przy 14 000 rpm przez 5 minut. Zebrać fazę wodną i dodać ją do wcześniej uzyskanej ekstrakcji wodnej. Kontynuować ekstrakcje zwrotne do momentu, aż interfaza stanie się przejrzysta.

6. Wytrącanie DNA

1. Oszacuj objętość zebranej warstwy wodnej.
2. Dodaj 1/10 objętości octanu sodu 3 M o pH 5.2 oraz 1 objętość 100% izopropanolu (v/v) klasy do biologii molekularnej (lub 2,5 objętości 100% etanolu).
3. Dokładnie wymieszaj i pozostaw na lodzie lub w zamrażarce w temperaturze -20°C na 30 minut lub przez noc.
4. Wiruj z maksymalną prędkością (14 000 rpm) w temperaturze 4°C w mikrowirówce przez 10 minut.
5. Odlej nadsącz.
6. Przemyj osad lodowatym 70% etanolem, aby usunąć niepożądane sole.
7. Resuspenduj osad w wybranym buforze (zazwyczaj dH₂O).

7. Oznaczenie ilości DNA

1. Oznacz stężenie DNA. Stosunek A260:A280 powinien wynosić około 1,8. W przypadku niewielkich ilości DNA zaleca się pomiar przy użyciu spektrofotometru NanoDrop.
2. Po oznaczeniu stężenia należy przeprowadzić elektroforezę w żelu, aby sprawdzić jakość próbki DNA i ustalić, czy zanieczyszczający RNA został całkowicie zdegradowany.
3. Wyekstrahowane DNA wysokiej jakości nadaje się teraz do dalszych zastosowań lub może być przechowywane w temperaturze -20°C do późniejszego użycia. Jeśli w próbce wciąż obecny jest RNA, należy powtórzyć etapy oczyszczania i wytrącania DNA, a następnie ponownie oznaczyć stężenie i sprawdzić jakość próbek.

Dyskusja

Tkanki pobrane podczas biopsji lub usunięte chirurgicznie w celu analizy histopatologicznej i diagnostyki są często utrwalane w formalinie i zalewane parapiną (FFPE) w celu długoterminowego przechowywania. W obliczu rosnącego zainteresowania zrozumieniem genetycznych podstaw chorób, możliwość izolacji DNA z tych próbek stanowi niezwykle cenne źródło materiału diagnostycznego, który może zostać wykorzystany w analizach genomicznych i badaniach translacyjnych. Historycznie próbki FFPE nie były uważane za przydatne źródło do analiz molekularnych, ponieważ kwasy nukleinowe mogą ulec silnym modyfikacjom w wyniku tworzenia wiązań krzyżowych białko-kwas nukleinowy oraz białko-białko⁶. Jednak odkrycie, że trawienie proteazą uwalnia pofragmentowane kwasy nukleinowe, które nadają się do dalszych analiz, w tym PCR, array CGH, sekwencjonowania i profilowania metylacji, umożliwia wykorzystanie tych cennych okazów do analiz genetycznych ⁶.

Ekstrakcja DNA z tkanek zatopionych w parafinie jest niezawodną procedurą, która opiera się na różnicach w rozpuszczalności w celu oczyszczenia DNA. Jakość i ilość wyekstrahowanego DNA oraz sukces późniejszej amplifikacji DNA zależą od szeregu parametrów przed, w trakcie i po ekstrakcji. Obejmują one między innymi: rodzaj i ilość tkanki, typ utrwalacza użytego do konserwacji tkanki, czas utrwalania, wiek bloku parafinowego i warunki przechowywania, a także długość pożądanego fragmentu DNA do amplifikacji ^1,7. Usunięcie parafiny z tkanki jest najważniejszym etapem skutecznej ekstrakcji, ponieważ nierozpuszczona parafina prowadzi do niskiej jakości próbki i inhibicji amplifikacji PCR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ksylen	VWR international	CABDH6216- 4	-
Probówki do mikrocentryfugi SafeSeal 1,7 ml	Sorenson BioScience	11510	-
Mikrocentryfuga Spectrafuge 16M	Labnet International	C0160-B	-
Bufor do lizy			10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 μg/ml Proteinazy K
Roztwór zapasowy Proteinazy K	Invitrogen	AM2548	20 mg/ml
Roztwór zapasowy Proteinazy K
Buforowany fenol nasycony pH 6,6/7,9	Fisher Scientific	BP1750I-400	-
Fenol: chloroform: alkohol izoamylowy (25:24:1, pH 6,7/8,0)	Fisher Scientific	BP1752I-400	-
RNaza A	Roche Group	10109169001	100 mg
3M octan sodu pH 5,2			40,81 g NaOAc w 80 ml Dostosować pH do 5,2 za pomocą kwasu octowego lodowatego Dopełnić dH2O do 100 ml Autoklawować
Spektrofotometr ND 3300	NanoDrop	-	-