Manualne unieruchamianie i powszechne drogi podawania związków u myszy i szczurów

Podsumowanie

Bezpieczna i humanitarna praca z gryzoniami laboratoryjnymi wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod chwytania i unieruchamiania. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z myszami i szczurami oraz efektywnego podawania im związków chemicznych.

Streszczenie

Umiejętność bezpiecznego i skutecznego unieruchamiania myszy i szczurów jest istotnym elementem prowadzenia badań. Pewna i humanitarna praca z myszami i szczurami wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod obchodzenia się z zwierzętami i ich unieruchamiania. W niniejszym artykule zostaną przedstawione podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z zwierzętami. Przedstawione zostaną techniki unieruchamiania jedną ręką, obiema rękami oraz przy użyciu specjalnie zaprojektowanych przyrządów do unieruchamiania. Często kolejnym etapem badań lub testów z wykorzystaniem zwierząt jest skuteczne podawanie związków myszom i szczurom. Choć istnieje wiele możliwych dróg podania (ograniczonych jedynie wielkością i organami zwierzęcia), większość z nich nie jest regularnie stosowana w badaniach. Film ten zilustruje kilka najczęstszych dróg podania, w tym dożylną, domięśniową, podskórną oraz zgłębnikową (per os). Celem niniejszego artykułu jest zapoznanie widza, który nie zna tych technik, z podstawowymi metodami unieruchamiania i drogami podawania substancji. Film ten nie zastępuje obowiązkowego szkolenia praktycznego w Państwa placówce, lecz ma na celu wzmocnienie i uzupełnienie tego szkolenia.

Protokół

1. Bezpieczne unieruchomienie i delikatne obchodzenie się ze zwierzętami jest kluczowym elementem procedur eksperymentalnych

1. Niniejsze wideo zostało zaprojektowane jako uzupełnienie praktycznego szkolenia zapewnianego przez Państwa instytucję.
2. Przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury eksperymentalnej zawsze należy upewnić się, że uzyskano zgodę IACUC lub komisji etycznej.
3. Każda osoba pracująca nad protokołem powinna znać szczegóły procedur zatwierdzonych dla tego protokołu, jak i wszystkich innych, nad którymi pracuje.
4. Do gryzonia należy podchodzić z pewnością siebie i obchodzić się z zwierzętami delikatnie, ale stanowczo. Zarówno zbyt szorstkie obchodzenie się, jak i niepewne podejście mogą skutkować ugryzieniami lub zadrapaniami osoby obsługującej bądź obrażeniami zwierzęcia.
5. Podczas pracy ze zwierzętami zawsze istnieje możliwość ich przypadkowego wypuszczenia lub upuszczenia. Większość tych czynności najlepiej wykonywać nad powierzchnią roboczą, aby w przypadku upuszczenia lub ucieczki zwierzęcia nie odniosło ono obrażeń i można było je łatwo schwytać. Należy przestrzegać przepisów instytucjonalnych dotyczących zwierząt, które miały kontakt z podłogą.
6. Nigdy nie należy chwytać zwierząt za sam koniec ogona, ponieważ może to doprowadzić do urazu w postaci odarcia skóry z ogona. Należy zachować szczególną ostrożność w przypadku dużych szczurów lub ciężarnych myszy. Podnosząc zwierzę za ogon, zawsze należy drugą ręką podtrzymywać ciało.
7. Podczas podawania iniekcji najlepiej sprawdzają się ostre igły. Choć igły do gryzoni laboratoryjnych są czasami używane do wielokrotnych iniekcji, nie jest to zalecane z wielu powodów, z których najmniej istotnym jest fakt, że często stosowany mały rozmiar igieł sprawia, iż szybko się one tępią.
8. Podczas pracy ze zwierzętami zawsze istnieje możliwość zostania ugryzionym lub zadrapanym. W przypadku pracy z substancją lub czynnikiem zakaźnym, który może spowodować obrażenia u ludzi, należy zachować dodatkowe środki ostrożności, np. manipulując zwierzętami lub czynnikami w dygestoriach lub komorach bezpieczeństwa biologicznego.
9. Delikatne podejście i aklimatyzacja do obsługi przed przystąpieniem do procedury mogą przełożyć się na mniejszy stres zwierząt podczas manipulacji.
10. Należy przećwiczyć unieruchamianie przed próbą podania związku oraz poćwiczyć podawanie substancji zwierzętom kontrolnym przed zwierzętami eksperymentalnymi.
11. Regularne ćwiczenie tych technik buduje pewność siebie, a pewność siebie przekłada się na lepszą obsługę, mniejszy stres zwierząt i lepsze wyniki naukowe.
12. W przypadku każdej techniki obsługi, jeśli zwierzę stawia opór, należy spróbować innej metody. Zwierzę (i osoba obsługująca) mogą również odnieść korzyść z ponownego umieszczenia zwierzęcia w klatce i ponownej próby w późniejszym czasie.

2. Unieruchomienie manualne

1. Jednoręczne unieruchomienie myszy
   1. Podnieś mysz za nasadę ogona i połóż ją na pokrywie klatki, drucianej kratce górnej klatki lub podobnej chropowatej powierzchni.
      1. Jednoręczne unieruchomienie myszy wykonuje się zazwyczaj ręką niedominującą, pozostawiając rękę dominującą wolną do pracy.
      2. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru zakrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
   2. Wsuń nasadę ogona między 3^rd a 4^th palec, delikatnie odciągając ogon do tyłu. Spowoduje to, że mysz chwyci powierzchnię wszystkimi czterema łapami i będzie próbowała pociągnąć do przodu.
      1. Nie chwytaj myszy za końcówkę ogona, szczególnie jeśli podwieszasz całą masę ciała zwierzęcia za ogon. Może to spowodować uraz typu „degloving” (odarcie skóry), w którym skóra ogona przesuwa się i schodzi.
   3. Następnie, tą samą ręką, która trzyma ogon, mocno chwyć mysz za kark. Chwyć palcem wskazującym i kciukiem w pobliżu nasady głowy i rozszerz chwyt w dół grzbietu myszy, dołączając palec środkowy i serdeczny.
      1. Upewnij się, że wywierasz tylko taki nacisk na skórę wokół szyi, który zapobiegnie obróceniu się lub wykręceniu myszy z uścisku, ale nie odciągaj skóry tak mocno, aby zwierzę nie mogło oddychać.
      2. Kontrola głowy jest kluczowa. Jeśli mysz może poruszać głową, może dosięgnąć palców osoby trzymającej i ugryźć. Może to wystąpić, gdy początkujący operatorzy chwytają mysz zbyt nisko na grzbiecie, zamiast tuż za czaszką.
2. Dwuręczne unieruchomienie myszy
   1. Podnieś mysz za nasadę ogona i połóż na pokrywie klatki, drucianej kratce lub chropowatej powierzchni.
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru zakrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
   2. Delikatnie pociągnij ogon do tyłu; mysz chwyci powierzchnię czterema łapami i pociągnie do przodu.
   3. Następnie, drugą ręką szybko i mocno chwyć mysz za kark (patrz: jednoręczne unieruchomienie powyżej).
   4. Trzymając ogon w jednej ręce, a kark w drugiej, podnieś mysz i wsuń nasadę ogona między wnętrze dłoni a 3^rd lub 4^th palec ręki trzymającej kark.
      1. Podobnie jak w metodzie jednoręcznej, mocno chwyć kark, aby zapobiec wykręcaniu się lub obracaniu myszy, nie ściskając jednak tak mocno, by zwierzę nie mogło oddychać.
      2. Jeśli mysz stawia opór przy chwytywaniu za kark, delikatny nacisk na grzbiet myszy może umożliwić przesunięcie ręki w górę dla lepszego uchwytu.
3. Unieruchomienie szczura; chwyt za kark (scruffing)
   1. Chwytanie szczura za kark wykonuje się zazwyczaj oburącz i tylko u mniejszych szczurów. Nie jest to powszechnie stosowana technika, ponieważ szczury rzadziej akceptują ten zabieg niż myszy, ale jest on przydatny w niektórych sytuacjach pobierania krwi.
   2. Chwyć szczura za ogon niedominującą ręką i delikatnie pociągnij do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano wyżej dla myszy).
      1. Należy uważać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może zejść, jeśli zostanie chwycona blisko końcówki.
   3. Trzymaj ogon mocno w dłoni i zbliż się do karku szczura od tyłu.
      1. Na przykład, jeśli ogon szczura znajduje się w lewej ręce operatora, nie należy podchodzić do szczura od strony nosa, aby chwycić go za kark prawą ręką. Zamiast tego należy sięgnąć nad lewą rękę i podejść do karku od tyłu.
   4. Wywieraj delikatny nacisk na grzbiet szczura, nad łopatkami, a następnie chwyć kark blisko nasady czaszki między palcami a wnętrzem dłoni.
   5. Kontrola głowy jest ważna, aby zapobiec ugryzieniom. Ugryzienia szczura mogą spowodować poważne obrażenia.
   6. Szczury mogą wydawać dźwięki podczas unieruchamiania w ten sposób.
4. Unieruchomienie szczura; chwyt nad barkami
   1. Chwyć szczura za ogon dominującą ręką i delikatnie pociągnij do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano wyżej dla myszy).
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru zakrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
      2. Należy uważać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może zejść, jeśli zostanie chwycona blisko końcówki.
   2. Połóż niedominującą rękę na grzbiet szczura, podchodząc od tyłu.
   3. Chwyć szczura w okolicy klatki piersiowej palcem serdecznym, małym i kciukiem. Głowa szczura powinna znajdować się między palcem wskazującym a środkowym.
      1. Nie uciskaj klatki piersiowej.
   4. Szczura można trzymać w ten sposób jedną ręką, jeśli ciało jest ustabilizowane przy operatorze.
5. Unieruchomienie szczura; chwyt pod barkami
   1. Chwyć szczura za ogon dominującą ręką i delikatnie pociągnij do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano wyżej dla myszy).
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru zakrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
      2. Należy uważać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może zejść, jeśli zostanie chwycona blisko końcówki.
   2. Połóż niedominującą rękę na grzbiet szczura, podchodząc od tyłu.
   3. Chwyć szczura w okolicy klatki piersiowej, tuż pod łopatkami. Przedramiona szczura powinny zostać delikatnie wypchnięte w górę kciukiem i palcem wskazującym.
      1. Przedramiona powinny krzyżować się pod brodą szczura, zapobiegając ugryzieniu.
      2. Nie uciskaj klatki piersiowej.
   4. Szczura można trzymać w ten sposób jedną ręką, jeśli ciało jest ustabilizowane przy operatorze.
6. Decapicone
   1. Decapicone to elastyczny, stożkowaty element z cienkiego plastiku z otworem na jednym końcu. Otwór jest na tyle mały, że mysz lub szczur może przez niego wystawić nos, ale nie resztę ciała.
   2. Aby unieruchomić zwierzę, umieść mysz lub szczura w Decapicone o odpowiednim rozmiarze.
   3. Popychaj zwierzę do przodu, aż jego nos wystanie przez otwór w Decapicone.
   4. Przytrzymaj zamknięty worek wokół ogona lub użyj wiązania typu „twist tie”, aby zamknąć zwierzę w stożku.
   5. Zaletą Decapicone jest to, że cienki plastik umożliwia wykonywanie iniekcji przez materiał.
   6. Wadą jest to, że materiał nie przepuszcza powietrza i zwierzęta mogą się przegrzać. Trzymaj zwierzę w Decapicone tylko przez czas niezbędny do wykonania procedury.
7. Akrylowy/sztywny plastikowy unieruchamiacz
   1. Plastikowe urządzenia do unieruchamiania są szczególnie przydatne, gdy wymagany jest dostęp do ogona zwierzęcia.
   2. Można je kupić w handlu lub wykonać w laboratorium.
   3. Rozmiar powinien być odpowiedni dla unieruchamianego zwierzęcia – zwierzę nie powinno być w stanie obrócić się wewnątrz urządzenia.
   4. Umieść zwierzę w urządzeniu do unieruchamiania, najpierw delikatnie je unieruchamiając, a następnie wsuwając je głową do przodu do otworu urządzenia.
      1. Może pomóc skierowanie urządzenia w górę nad klatką, ponieważ gryzonie często wspinają się do bezpiecznych struktur, takich jak rurki.
   5. Załóż zamknięcie na końcu urządzenia, uważając, aby nie uszkodzić ogona, łap lub jąder zwierzęcia.
   6. Zminimalizuj czas przebywania w unieruchamiaczach, ponieważ zwierzęta mogą się przegrzać.
8. Zwierzęta mogą być unieruchamiane również w inne sposoby, np. poprzez owinięcie w mały ręcznik lub po prostu przykrycie zwierzęcia dłonią. Techniki można dostosować do potrzeb zwierzęcia i pracownika. Zawsze dbaj o to, aby uniknąć ugryzień i zadrapań oraz zabezpiecz zwierzę przed przypadkowym uwolnieniem lub upadkiem z wysokości.

3. Metody podawania związków

1. Nie jest to w żadnym razie lista wyczerpująca i możliwe są inne drogi podania. Niniejszy protokół ma na celu przedstawienie najczęściej stosowanych metod. Inne drogi mogą wymagać znieczulenia zwierzęcia oraz podania leków przeciwbólowych po zabiegu.
2. Niezależnie od zastosowanej metody podania, należy upewnić się, że wszystkie materiały są przygotowane przed unieruchomieniem zwierząt.
3. Materiały wodne są łatwiejsze do wstrzyknięcia niż substancje gęstsze, takie jak związki na bazie olejów. Gęstsze związki należy zawsze wstrzykiwać bardzo powoli, aby uniknąć wysunięcia się igły z strzykawki.
4. Ogólne uwagi dotyczące stosowania igieł i strzykawek.
   1. Strzykawki i igły należy zawsze odpowiednio przechowywać i utylizować.
   2. Jeśli nie mają Państwo doświadczenia w posługiwaniu się strzykawkami i igłami, należy poćwiczyć obsługę strzykawki i wstrzykiwanie przed próbą wykonania zabiegu u zwierzęcia. Idealnie byłoby móc pewnie operować strzykawką i igłą jedną ręką, pozostawiając drugą do unieruchomienia zwierzęcia. Pewna ręka minimalizuje ruch igły, co ogranicza uszkodzenia tkanek.
   3. Igły składają się z ostrza, ścięcia, trzpienia i piasty. Strzykawki posiadają końcówkę, cylinder i tłok (Rycina 1 a i b).
   4. Rozmiar igieł określa się za pomocą wskaźnika gauge oraz długości. Im wyższa wartość gauge, tym mniejsza średnica igły. Małe igły bardzo łatwo ulegają stępieniu (w wyniku powstania zadzioru na ostrzu) i nie powinny być używane do przebijania fiolek wielodawkowych (Rycina 1 c). Zawsze należy wybierać najkrótszą igłę, która pozwoli na podanie związku.
   5. Igła jest mocowana do końcówki strzykawki za pomocą piasty. Niektóre strzykawki mają końcówki z blokadą. Zawsze należy upewnić się, że strzykawka jest bezpiecznie przymocowana do igły.
   6. Igły najlepiej wprowadzać do zwierzęcia ścięciem do góry, szczególnie w przypadku wstrzykiwań dożylnych.
   7. Nigdy nie należy nakładać nasadek na igły ręcznie. Jest to częsta przyczyna zranień nakłuciem igły. Igły i strzykawki należy utylizować w odpowiednich, oznakowanych pojemnikach na odpady ostre. Jeśli konieczne jest założenie nasadki, dostępne są specjalne urządzenia (Rycina 1 d).
5. Donosowo (IN)
   1. Unieruchomić zwierzę zgodnie z powyższym opisem.
   2. Za pomocą strzykawki lub pipety nanieść niewielką ilość materiału do inhalacji do nozdrzy zwierzęcia.
   3. Obserwować, aż materiał zostanie wchłonięty przez nozdrza.
   4. Powtarzać w razie potrzeby, aż do podania pożądanej objętości.
6. Domięśniowo (IM)
   1. Unieruchomić zwierzę zgodnie z powyższym opisem. Upewnić się, że jedna z tylnych kończyn zwierzęcia jest wolna i ustabilizowana do wstrzyknięcia. Unieruchomienie może wymagać dwóch osób. Jeśli zwierzę będzie kopać podczas wstrzykiwania, dojdzie do uszkodzenia mięśni przez igłę.
   2. Iglę należy wprowadzić prostopadle do skóry zwierzęcia. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wprowadzić igłę na głębokość około ścięcia i wstrzyknąć materiał do mięśnia czworogłowego uda (przednia część uda) lub bocznej masy mięśniowej uda.
   3. Nie wstrzykiwać w tylną masę mięśniową, ponieważ istnieje ryzyko uszkodzenia nerwu kulszowego.
   4. Jeśli zwierzęta mają otrzymać wiele wstrzykiwań IM, należy stosować naprzemienne kończyny.
7. Do-otrzewkowo (IP)
   1. Unieruchomić zwierzę zgodnie z powyższym opisem.
   2. Skierować nos zwierzęcia w stronę podłogi, odsłaniając brzuch do wstrzyknięcia.
   3. Zlokalizować linię środkową zwierzęcia i mentalnie podzielić brzuch na kwadranty (Rycina 2). Dolne kwadranty, a szczególnie dolny prawy kwadrant, są odpowiednimi miejscami do wstrzykiwań dootrzewnowych.
      1. Dolny prawy kwadrant wybiera się ze względu na brak anatomicznie istotnych struktur.
   4. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wstrzyknąć materiał do ciała zwierzęcia.
   5. Jeśli zwierzęta mają otrzymywać powtarzające się wstrzyknięcia IP, należy zmieniać miejsce wstrzyknięcia.
8. Podskórnie (SC, SQ)
   1. Unieruchomić zwierzę zgodnie z powyższym opisem. Zwierzę musi być unieruchomione na tyle luźno, aby skóra mogła zostać przemieszczona.
   2. Jeśli zwierzęta mają być rutynowo obsługiwane po wstrzyknięciu SC, nie należy chwytać za kark. Zamiast tego należy użyć skóry na grzbietowej części zadka lub boku. Jeśli zwierzęta mają otrzymać wiele wstrzyknięć SC, należy zmieniać miejsca wstrzyknięcia.
   3. Chwycić skórę i delikatnie pociągnąć ją do góry, tworząc „namiot”.
      1. W przypadku samodzielnego wykonywania wstrzyknięcia, należy wprowadzić igłę i delikatnie unieść skórę do góry igłą, aby potwierdzić, że znajduje się ona w przestrzeni podskórnej.
   4. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wprowadzić igłę pod kątem 30-45° w uniesioną skórę i wstrzyknąć materiał. Wstrzykiwać równolegle do palców trzymających skórę do góry i w kierunku oddalonym od nich.
   5. W przypadku udanego wstrzyknięcia widoczny będzie niewielki obrzęk pod skórą.
   6. Po wstrzyknięciu zastosować delikatny ucisk, aby zapobiec cofaniu się materiału.
9. Śródskórnie (ID)
   1. W przypadku wstrzykiwań śródskórnych zwierzęta są często golone, aby skóra była widoczna.
   2. Unieruchomienie zwierzęcia przy wielu wstrzyknięciach śródskórnych może być trudne. W takim przypadku konieczna może być sedacja chemiczna. Miejsca wstrzykiwań ID są takie same jak w przypadku SC.
   3. Wprowadzić igłę o odpowiednim rozmiarze w skórę pod kątem 15-30°. Igła nie zostanie wprowadzona głęboko, a podczas wstrzykiwania powinien pojawić się opór.
      1. Alternatywnym podejściem jest delikatne uszczypnięcie skóry sąsiadującej z miejscem wstrzyknięcia i wprowadzenie igły pod bardzo małym kątem. Jest to przydatne u myszy, ponieważ zapobiega ich ruchom podczas procesu wstrzykiwania.
   4. W przypadku udanego wstrzyknięcia pojawi się mała pęcherzyk (bleb). Będzie on bledszy od otaczającej skóry.
   5. Po wstrzyknięciu zastosować delikatny ucisk, aby zapobiec cofaniu się materiału.
10. Do naczyniowo (IV)
    1. Lewa i prawa boczna żyła ogonowa są najczęstszymi drogami dostępu naczyniowego stosowanymi u myszy i szczurów.
    2. Inne drogi dostępu naczyniowego są możliwe u myszy i szczurów, ale zazwyczaj wymagają sedacji i przeciwbólowego leczenia po wstrzyknięciu.
    3. W przypadku wstrzyknięcia do żyły ogonowej unieruchomić zwierzę w Decapiconie lub plastikowym ograniczniku dla gryzoni.
    4. Umieścić ogon zwierzęcia pod lampą lub na zabezpieczonym urządzeniu grzewczym. Sprzyja to rozszerzeniu naczyń krwionośnych, co ułatwia wstrzyknięcie.
       1. Nie doprowadzać do przegrzania zwierzęcia.
       2. W przypadku dużych samców szczurów oczyszczenie łusek skóry z ogona może pozwolić na lepszą wizualizację żyły. Czyszczenie powinno być delikatne, aby nie uszkodzić skóry.
    5. Trzymać ogon zwierzęcia za końcówkę niedominującą ręką. Pozwoli to na wyprostowanie ogona.
    6. Obrócić ogon o ¼ obrotu, aby żyły ogonowe znajdowały się po stronie grzbietowej dla łatwiejszego wstrzyknięcia. Zwierzę posiada dwie boczne żyły ogonowe oraz brzuszna tętnica ogonowa (Rycina 3).
    7. Zbliżyć igłę do ogona pod kątem 15-20°. Zacząć od dystalnej części ogona.
       1. Żyły są płytkie i igła nie powinna być wprowadzona znacznie głębiej niż do poziomu ścięcia.
       2. Jeśli wstrzyknięcie rozpocznie się jak najbardziej dystalnie, w przypadku niepowodzenia pierwszej próby pozostanie więcej nieuszkodzonej żyły do kolejnej próby.
    8. Wstrzyknąć materiał. Udane wstrzyknięcie objawi się wejściem materiału do żyły bez oporu oraz pobieleniem żyły ogonowej przez czas trwania wstrzykiwania.
       1. Nie aspirować przed wstrzyknięciem, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się żyły.
       2. Delikatny ucisk w miejscu wkłucia po wstrzyknięciu zapobiegnie krwawieniu.
    9. W przypadku nieudanego wstrzyknięcia materiał nie będzie płynął swobodnie. Zamiast tego skóra ogona pobieli się lub materiał w ogóle nie będzie mógł zostać wstrzyknięty.
11. Podanie do żołądka (zgłębnik rozwodny)
    1. Zgłębnik należy podawać wyłącznie unieruchomionym, rozbudzonym zwierzętom. Znieczulenie lub sedacja zwiększają ryzyko aspiracji (przypadkowego dostania się materiału do płuc).
    2. Wybrać odpowiednio dobraną pod względem rozmiaru igłę do karmienia doustnego. Igły te mają na końcach kuliste zakończenia, aby zapobiec ich przedostaniu się do tchawicy.
    3. Potrzebną długość można określić, trzymając unieruchomione zwierzę w pionie i mierząc od kącika ust. Kuliste zakończenie igły do karmienia powinno sięgać ostatniego żebra zwierzęcia (Rycina 4). Wartość gauge igły określa się na podstawie masy zwierzęcia.
    4. Unieruchomić zwierzę tak, aby głowa i ciało znajdowały się w prostej, pionowej linii. Prostuje to przełyk, co ułatwia wprowadzenie igły do karmienia.
    5. Wprowadzić kuliste zakończenie igły do pyska zwierzęcia, ponad język. Po umieszczeniu igły na miejscu unieść igłę i strzykawkę, delikatnie dociskając do podniebienia, tak aby nos zwierzęcia był skierowany w stronę sufitu.
       1. U szczurów igła może wymagać lekkiej korekty kierunku podczas przechodzenia przez tylną część gardła. Jakiekolwiek napięcie igły wskazuje na konieczność korekty pozycji.
    6. Kontynuować wprowadzanie igły, aż do osiągnięcia wyznaczonej odległości. Igła powinna przechodzić łatwo, a zwierzę nie powinno łapać powietrza ani dławić się.
    7. Podać substancję. Powinna ona spłynąć do żołądka. Jeśli pojawi się opór lub zwierzę zacznie łapać powietrze, dławić się lub sinieć, należy natychmiast przerwać i usunąć igłę. Zwierzęta, które doznały aspiracji, mogą wymagać eutanazji w zależności od podawanego związku.

4. Reprezentatywne wyniki

Prawidłowe obchodzenie się ze zwierzętami minimalizuje stres zarówno u zwierzęcia, jak i u opiekuna. Dzięki temu opiekunowie nie są gryzione ani drapane, a zwierzęta są traktowane w sposób humanitarny i kompetentny. Związki są podawane odpowiednią drogą, z minimalnym uszkodzeniem tkanek i przy jak najmniejszym dyskomforcie dla zwierzęcia.

Jeśli badacze nie mają doświadczenia w pracy ze zwierzętami, pomocne może być ćwiczenie na małym pluszowym zwierzątku. Dostępne są również symulatory zwierząt do niektórych technik, takie jak szczur Koken. Wielu badaczy ma niewielką możliwość zapoznania się z igłami i strzykawkami przed rozpoczęciem pracy ze zwierzętami. Reprezentatywne części igły i strzykawki zilustrowano na rycinie 1A i 1B. Przed pierwszym podaniem zastrzyku zwierzętom warto poćwiczyć technikę iniekcji. Bardzo cienkie igły, np. 28 i 30 g, są podatne na uszkodzenia. Podczas pobierania substancji z fiolek wielodawkowych należy użyć igły o większej średnicy, a następnie zastąpić ją igłą o mniejszym rozmiarze w celu wykonania iniekcji. Igłę z zadziorem pokazano na rycinie 1C. Podczas pracy z igłami należy przestrzegać podstawowych zasad bezpieczeństwa, takich jak unikanie ręcznego nakładania nasadek na zużyte igły. Na rycinie 1D przedstawiono urządzenie do nakładania nasadek na igły w trakcie użycia. Może być ono cenne dla badaczy, którzy muszą usunąć igły, aby na przykład wypchnąć krew ze strzykawki, unikając hemolizy występującej podczas przeciskania krwi przez igłę.

Rysunki 2 i 3 przedstawiają punkty orientacyjne dla iniekcji wewnątrzbrzusznej oraz typową budowę ogona, wskazując miejsca docelowe wstrzykiwania. Rysunek 4 prezentuje przykłady prawidłowego doboru rozmiaru kaniul do gavage. Kaniule do gavage powinny sięgać od pyska zwierzęcia do miejsca bezpośrednio poniżej ostatniego żebra.

Rycina 1. A) Części igły oraz B) strzykawki, opisane. C) Zadziory na igle powstałe w wyniku wielokrotnego wbijania igły do fiolki wielodawkowej. D) Nakładka do nakładania nasadek na igły w użyciu.

Rycina 2. Kwadranty brzusznej ściany brzucha. Wstrzykuj wyłącznie do dwóch dolnych kwadrantów, preferencyjnie do prawego dolnego kwadrantu.

Rycina 3. Schemat przekroju poprzecznego ogona, przedstawiający położenie tętnic i żył względem struktur kostnych i ścięgnistych.

Rysunek 4. Dobór rozmiaru kaniuli do gavage u szczurów. A) Kaniula do gavage zbyt długa. B) Kaniula do gavage o odpowiedniej długości. C) Pomiar kaniuli do gavage wskazujący zbyt krótką długość. D) Palpacja ostatniego żebra w celu ustalenia odpowiedniego rozmiaru kaniuli do gavage.

	Mysz		Szczur
Droga podania	Zalecana objętość	Zalecany rozmiar i długość igły	Zalecana objętość	Zalecany rozmiar i długość igły
Donosowa1	5-25 μl	n/d	5-25 μl	n/d
Domięśniowa1,2	0.00005 ml/g	<23 g, 0.5 to 0.75 in	0.1 ml/kg	<21 g, 0.5 to 0.75 in
Doszczepna1,2	0.02 ml/g	<21 g, 0.75 to 1 in	10 ml/kg	<21 g, 0.75 to 1 in
Podskórna1,2	0.01 ml/g	<22 g, 0.5 to 1 in	5 ml/kg	<22 g, 0.5 to 1 in
Doskórna1	0.05-0.1 ml	<26 g, 0.5 in	0.05-0.1 ml	<26 g, 0.5 in
Dożylna1,2	0.005 ml/g -0.025 ml/g*	<25 g, 0.75 to 1 in	5 ml/kg-20 ml/kg*	<23 g, 0.75 to 1 in
Zgłębnik doprzystronny1,2	0.01 ml/g	igła do karmienia 20-22 g	5-10 ml/kg	igła do karmienia 16-20 g

*Pierwsza liczba to objętość podawana w formie bolusa dożylnego w ciągu około 1 minuty. Druga objętość to objętość, którą można podać w formie powolnej infuzji w ciągu 5-10 minut.

Tabela 1. Zalecane dawki i rozmiary igieł dla różnych dróg podawania związków u myszy i szczurów.

Dyskusja

Niniejszy protokół należy traktować jako wprowadzenie do postępowania ze zwierzętami i podawania substancji, mające na celu uzupełnienie praktycznego szkolenia przeprowadzanego w placówce badawczej. Sposoby unieruchamiania oraz drogi podawania substancji powinny zostać uwzględnione w planie doświadczalnym oraz podczas sporządzania protokołu badawczego lub protokołu komisji etycznej.

Szkolenie w zakresie procedur związanych z wykorzystaniem zwierząt jest kluczowe dla sukcesu badań. Aby przeprowadzić większość eksperymentów, zwierzęta muszą być obsługiwane przez personel badawczy, a im lepsza jest technika obchodzenia się ze zwierzęciem, tym mniejszy jest jego stres ³. Przyzwyczajanie zwierząt do łagodnego kontaktu z człowiekiem może zredukować stres i sprawić, że zwierzęta staną się bardziej uległymi obiektami badawczymi ^4,5. Wykazano, że stres związany z obsługą wpływa na niektóre rodzaje badań ⁶ i jest możliwe, że wpływa również na inne. Unieruchamianie gryzoni powinno być przeprowadzane przy ostrożnym, ale pewnym chwycie (niepewny chwyt może doprowadzić do obrażeń gryzonia oraz osoby obsługującej) i powinno trwać tak krótko, jak to praktycznie możliwe. Metody unieruchamiania są zazwyczaj dobierane w zależności od wielkości zwierzęcia lub pożądanego dostępu do jego ciała. Na przykład chwytanie dorosłych szczurów za kark, choć jest możliwe, często spotyka się z silnym oporem ze strony zwierzęcia, zwłaszcza jeśli osoba obsługująca jest niedoświadczona. Trzymanie myszy lub szczura w ręku może utrudnić dostęp do żył ogonowych, dlatego często wybiera się urządzenie do unieruchamiania, aby zwierzę pozostawało w możliwie największym bezruchu.

Podczas pracy z zwierzętami badacze często dążą do podania związku chemicznego lub preparatu biologicznego w celu przeprowadzenia dalszych badań. Droga podania substancji może wpływać na jej wchłanianie, biodostępność oraz przydatność dla konkretnego eksperymentu. Znajomość różnych dróg podania powinna umożliwić badaczom wybór najodpowiedniejszej metody aplikacji substancji dla celów ich badań. Na przykład drogi sprzyjające szybkiemu wchłanianiu substancji, takie jak dożylna lub dosytnawiczowa, nie powinny być stosowane, jeśli badacz chce podać substancję w sposób wolniej działający. Aktualne przeglądy niektórych z tych technik oraz kwestie dotyczące objętości, sprzętu i substancji rozpuszczonej można znaleźć w dwóch publikacjach autorstwa Turnera et al. ^1,7

Przy każdym podawaniu substancji gryzoniom laboratoryjnym należy zwrócić uwagę na odpowiedni rozmiar sprzętu oraz objętość substancji (opisane w Table 1). Niewłaściwie dobrany sprzęt lub zbyt duże objętości mogą prowadzić do dyskomfortu, obrażeń lub śmierci zwierzęcia. Co do zasady, substancje podawane drogą parenterystyczną powinny być sterylne, chyba że cele badawcze uniemożliwiają zachowanie tej zasady (i.e. w badaniach bakteriologicznych). Związki chemiczne i substancje biologiczne powinny znajdować się w rozpuszczalniku lub nośniku, który wywrze najmniejszy wpływ na zwierzę. pH fizjologiczne (7.3 -7.4) jest zazwyczaj dobrze tolerowane, zwłaszcza w przypadku podawania podskórnego, domięśniowego i dosmaxWidthnienia. Nie fizjologiczne poziomy pH substancji podawanych tymi drogami mogą powodować ból, martwicę oraz uszkodzenia tkanek. Szersze zakresy pH są tolerowane przy podawaniu dożołądkowym i dożylnym ⁷. W przypadku małych gryzoni innym ważnym aspektem jest ryzyko wychłodzenia przy podawaniu dużych objętości płynów w temperaturze pokojowej. Jeśli płyny są podawane dożylnie lub dosmaxWidthnnie, zwłaszcza w celu wsparcia chorego zwierzęcia, powinny zostać ogrzane do temperatury ciała (37 °C).

Drogi podania omówione w niniejszym protokole są powszechnie stosowane w wielu programach badawczych, są łatwe do opanowania i zazwyczaj nie wymagają znieczulenia. Możliwe jest jednak niemal nieskończone zróżnicowanie dróg podania, w tym między innymi dojamczkowo, dokanałowo, znadtwardówkowo, dotchawiczo, doszpikowo oraz dostawowo. Szkolenia w zakresie tych specjalistycznych dróg podania należy odbyć u osób posiadających obszerne doświadczenie w ich stosowaniu oraz potwierdzoną skuteczność.

U gryzoni droga donosowa jest zazwyczaj wykorzystywana do badania substancji wprowadzanych do płuc w sposób bardziej „naturalny” niż w przypadku instylacji dotchawiczej. Myszy i szczury oddychają obligatoryjnie przez nos, dlatego skłonienie ich do wdychania bardzo małych ilości płynu nie jest trudne, nawet u zwierząt przytomnych. Ponieważ błona śluzowa nosa jest dobrze ukrwiona, donosowa administracja niektórych substancji może być zbliżona do podania dożylnego. Ta droga podania nie jest jednak zalecana u zwierząt z zapaleniem błony śluzowej nosa, ponieważ może to upośledzić wchłanianie. Próby podania dużych objętości drogą donosową mogą prowadzić do duszności lub utonięcia zwierzęcia.

Iniekcje domięśniowe zapewniają szybką absorpcję substancji. W przypadku szczurów i myszy iniekcje domięśniowe mogą być trudne ze względu na ich niewielki rozmiar i odpowiadająco małe mięśnie. Są one wykonywane w kończynach tylnych. Ze względu na ryzyko uszkodzenia nerwu kulszowego, preferowanym miejscem wstrzyknięcia jest mięsień czworogłowy uda.

Choć zarówno droga podskórna, jak i śródskórna obejmują skórę, istnieją różnice w biodostępności substancji podanych do skóry w porównaniu z tkanką podskórną. Podanie podskórne jest często uważane za drogę „depozytową”, charakteryzującą się wolniejszą wchłanialnością niż w przypadku innych dróg, takich jak dożylna czy dosytrojna. Podanie śródskórne stosuje się dla bardzo małych objętości substancji, zazwyczaj substancji immunostymulujących, takich jak mieszaniny adiuwant-antygen. W obu przypadkach podawane substancje powinny mieć pH fizjologiczne i nie powinny działać drażniąco. Iniekcji śródskórnych lub podskórnych nie należy wykonywać w obrębie karku, ponieważ jest to miejsce powszechnie wykorzystywane do unieruchamiania gryzoni.

Podawanie dożylne i dootrzewnowe są często uważane za równoważne u gryzoni. Drogi podania dożylnego zapewniają jednak szybsze wchłanianie związków, podczas gdy podawanie dootrzewnowe należy uznać za mniej więcej równoważne podaniu doustnemu ⁸. Należy zachować ostrożność przy związkach podawanych dootrzewnowo, ponieważ mogą one powodować ból, jeśli nie zostaną odpowiednio zbuforowane. Powszechną drogą podania dożylnego w formie bolusa u gryzoni są żyły ogonowe. Jeśli wymagane jest przewlekłe podawanie substancji dożylnie, należy rozważyć implantację kaniul żylnych lub tętniczych. Substancje podawane dożylnie powinny być wprowadzane aseptycznie i winny być sprawdzone pod kątem bezpieczeństwa podania dożylnego. Na przykład substancje, które mogą wywołać hemolizę, zakrzepicę lub zapalenie naczyń, nie nadają się do podawania dożylnego.

Droga podania wewnątrzżołądkowego lub przez zgłębnik (gavage) jest często stosowana w celu odwzorowania typowej drogi podawania leków u ludzi. Pozwala ona również na precyzyjne dawkowanie substancji w porównaniu z podawaniem doustnym poprzez pokarm lub wodę. Biodostępność związków podawanych za pomocą zgłębnika różni się w zależności od stanu sytości lub głodówki zwierzęcia, a także od rozpuszczalnika lub nośnika związku lub substancji biologicznej. Igły do podawania lub karmienia powinny mieć odpowiedni rozmiar dostosowany do gatunku i wielkości zwierzęcia oraz być czyszczone pomiędzy kolejnymi osobnikami, jeśli stosowanie jednorazowych igieł nie jest praktyczne. Urazy spowodowane podawaniem przez zgłębnik nie są rzadkie i obejmują m.in. przedostanie się substancji do płuc lub przerwanie ciągłości ściany żołądka lub przełyku. Szkolenie powinno odbywać się pod nadzorem doświadczonego specjalisty i być przeprowadzane najpierw na zwierzętach uśpionych (eutanazowanych), następnie na zwierzętach pod narkozą (które zostaną poddane eutanazji), zanim przystąpi się do prób u zwierząt budzących się. Pierwsze próby podawania przez zgłębnik u zwierząt budzących się powinny obejmować osobniki o średniej wielkości i niewielkie objętości substancji, np. soli fizjologicznej, która nie spowoduje obrażeń w przypadku niepowodzenia procedury. Po zabiegu zwierzęta należy uważnie oceniać pod kątem objawów stresu lub dyskomfortu, takich jak duszność, sinica, krwawienie lub nadmierne ślinienie, i w razie potrzeby poddać eutanazji. Jeśli konieczna jest eutanazja, należy przeprowadzić sekcję zwłok zwierzęcia, aby ustalić przyczynę niepowodzenia procedury podawania przez zgłębnik.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły	Różne	Różne	Igły są sprzedawane według średnicy (gauge) i długości. Przed zamówieniem należy sprawdzić oba parametry.
Strzykawki	Różne	Różne	Zawsze należy dobrać odpowiedni rozmiar do objętości podawanej substancji.
DecapiCones	Braintree Scientific	DC-200, DCL-120, MDC-200	Dostępne w rozmiarach dla myszy i szczurów.
Restryktory dla gryzoni	Harvard Apparatus, Braintree Scientific, Plas-Labs, inne		Dostępne z przezroczystego pleksiglasu, z regulowanego tworzywa sztucznego, w rozmiarach dla myszy i szczurów.
Probówka stożkowa 50 ml	Różne
Igły do karmienia	VWR, Popper and Sons	Różne	Średnicę i długość igły należy dobrać do zwierząt zgodnie z powyższym opisem. Dostępne są igły do karmienia jednorazowe oraz wielorazowe.