Manualne unieruchamianie i powszechne drogi podawania związków u myszy i szczurów

Podsumowanie

Bezpieczna i humanitarna praca z gryzoniami laboratoryjnymi wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod chwytania i unieruchamiania. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z myszami i szczurami oraz efektywnego podawania im związków chemicznych.

Streszczenie

Umiejętność bezpiecznego i skutecznego unieruchamiania myszy i szczurów jest istotnym elementem prowadzenia badań. Pewna i humanitarna praca z myszami i szczurami wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod obchodzenia się z zwierzętami i ich unieruchamiania. W niniejszym artykule zostaną przedstawione podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z zwierzętami. Przedstawione zostaną techniki unieruchamiania jedną ręką, obiema rękami oraz przy użyciu specjalnie zaprojektowanych przyrządów do unieruchamiania. Często kolejnym etapem badań lub testów z wykorzystaniem zwierząt jest skuteczne podawanie związków myszom i szczurom. Choć istnieje wiele możliwych dróg podania (ograniczonych jedynie wielkością i organami zwierzęcia), większość z nich nie jest regularnie stosowana w badaniach. Film ten zilustruje kilka najczęstszych dróg podania, w tym dożylną, domięśniową, podskórną oraz zgłębnikową (per os). Celem niniejszego artykułu jest zapoznanie widza, który nie zna tych technik, z podstawowymi metodami unieruchamiania i drogami podawania substancji. Film ten nie zastępuje obowiązkowego szkolenia praktycznego w Państwa placówce, lecz ma na celu wzmocnienie i uzupełnienie tego szkolenia.

Protokół

1. Bezpieczne unieruchomienie i delikatne obchodzenie się ze zwierzętami jest kluczowym elementem procedur eksperymentalnych

1. Niniejszy film został zaprojektowany jako uzupełnienie praktycznego szkolenia zapewnianego przez Państwa instytucję.
2. Zawsze upewnij się, że przed rozpoczęciem jakiejkolwiek procedury eksperymentalnej uzyskano zgodę IACUC lub komisji etycznej.
3. Każda osoba pracująca nad protokołem powinna znać szczegóły procedur zatwierdzonych dla tego protokołu, jak i wszelkich innych, nad którymi pracuje.
4. Podchodź do gryzonia z pewnością siebie i obchodź się z zwierzętami delikatnie, ale stanowczo. Zarówno zbyt gwałtowne obchodzenie się, jak i niepewne podejście mogą doprowadzić do pogryzień lub zadrapań osoby obsługującej lub do obrażeń zwierzęcia.
5. Podczas pracy ze zwierzętami zawsze istnieje możliwość ich przypadkowego zwolnienia lub upuszczenia. Większość tych manipulacji najlepiej przeprowadzać nad powierzchnią roboczą, aby w przypadku upuszczenia lub ucieczki zwierzęcia nie odniosło ono obrażeń i można było je łatwo schwytać. Postępuj zgodnie z zasadami swojej instytucji dotyczącymi zwierząt, które miały kontakt z podłogą.
6. Nigdy nie chwytaj zwierząt za sam koniec ogona, ponieważ może to doprowadzić do urazu typu „degloving” (odarcie skóry) ogona. Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku dużych szczurów lub ciężarnych myszy. Podczas podnoszenia zwierzęcia za ogon zawsze używaj drugiej ręki do podtrzymania ciała.
7. Podczas wykonywania wstrzyknięć najlepiej sprawdzają się ostre igły. Choć igły do gryzoni laboratoryjnych są czasami używane do wielokrotnych wstrzyknięć, nie jest to zalecane z wielu powodów, z których najmniej istotnym jest fakt, że stosowany często mały kaliber sprawia, iż igły szybko się tępią.
8. Podczas pracy ze zwierzętami zawsze istnieje ryzyko pogryzienia lub zadrapania. Jeśli pracujesz z substancją lub czynnikiem zakaźnym, który może spowodować obrażenia u ludzi, zastosuj dodatkowe środki ostrożności, takie jak manipulowanie zwierzętami lub czynnikami w dygestoriach lub komorach bezpieczeństwa biologicznego.
9. Delikatne podejście i aklimatyzacja do obchodzenia przed próbą przeprowadzenia procedury mogą przynieść korzyści w postaci zwierząt mniej zestresowanych manipulacjami.
10. Ćwicz unieruchamianie przed próbą podania związku, a podawanie substancji ćwicz najpierw na zwierzętach kontrolnych, a dopiero potem na zwierzętach eksperymentalnych.
11. Regularne ćwiczenie tych technik buduje pewność siebie, a pewność siebie przekłada się na lepsze obchodzenie się ze zwierzętami, mniejszy stres u zwierząt i lepsze wyniki naukowe.
12. W przypadku zastosowania jakiejkolwiek techniki obchodzenia, jeśli zwierzę stawia opór, wypróbuj inną metodę. Zarówno zwierzę, jak i osoba obsługująca mogą odnieść korzyść z ponownego umieszczenia zwierzęcia w klatce i ponownej próby w późniejszym czasie.

2. Unieruchomienie manualne

1. Unieruczne unieruchomienie myszy
   1. Chwyć mysz u nasady ogona i połóż ją na pokrywie klatki, drucianej kratce górnej lub podobnej chropowatej powierzchni.
      1. Unieruczne unieruchomienie myszy jest zazwyczaj wykonywane niedominującą ręką, pozostawiając rękę dominującą wolną do pracy.
      2. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru pokrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
   2. Wsuń nasadę ogona między 3^rd a 4^ty palec, delikatnie odciągając ogon do tyłu. Spowoduje to, że mysz chwyci powierzchnię wszystkimi czterema łapami i będzie próbowała pociągnąć ciało do przodu.
      1. Nie chwytaj myszy za końcówkę ogona, szczególnie jeśli zawieszasz całą masę ciała zwierzęcia na ogonie. Może to spowodować uraz typu „degloving” (odarcie skóry), w którym skóra z ogona zsuwa się całkowicie.
   3. Następnie, tą samą ręką, która trzyma ogon, mocno chwyć mysz za kark. Chwyć palcem wskazującym i kciukiem w pobliżu nasady czaszki, a następnie rozszerz uchwyt wzdłuż grzbietu myszy, dołączając palec środkowy i serdeczny.
      1. Należy zastosować tylko tyle nacisku na skórę wokół szyi, aby zapobiec obróceniu się lub wykręceniu myszy z uścisku, ale nie należy naciągać skóry tak mocno, aby zwierzę nie mogło oddychać.
      2. Kontrola głowy jest kluczowa. Jeśli mysz może poruszać głową, może dosięgnąć palców operatora i ugryźć. Może to wystąpić, gdy początkujący operatorzy chwytają mysz zbyt nisko na grzbiecie, zamiast bezpośrednio za czaszką.
2. Dworuczne unieruchomienie myszy
   1. Chwyć mysz u nasady ogona i połóż na pokrywie klatki, drucianej kratce lub chropowatej powierzchni.
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru pokrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
   2. Delikatnie odciągnij ogon do tyłu; mysz chwyci powierzchnię czterema łapami i pociągnie ciało do przodu.
   3. Następnie, drugą ręką szybko i mocno chwyć mysz za kark (patrz: unieruchomienie unieruczne powyżej).
   4. Trzymając ogon w jednej ręce, a kark w drugiej, unieś mysz i wsuń nasadę ogona między dłoń a 3^rd lub 4^ty palec ręki trzymającej kark.
      1. Podobnie jak w metodzie unierucznej, mocno chwyć kark, aby zapobiec wykręcaniu się myszy, nie ściskając jednak tak mocno, by zwierzę nie mogło oddychać.
      2. Jeśli mysz stawia opór przy chwytywaniu za kark, delikatny nacisk na grzbiet myszy może pozwolić na przesunięcie dłoni do góry w celu lepszego uchwycenia.
3. Unieruchomienie szczura; chwyt za kark
   1. Chwytanie szczura za kark jest zazwyczaj wykonywane dwuręcznie i tylko u mniejszych szczurów. Nie jest to technika powszechnie stosowana, ponieważ szczury gorzej tolerują ten uchwyt niż myszy, jednak jest on przydatny w niektórych sytuacjach pobierania krwi.
   2. Chwyć szczura za ogon niedominującą ręką i delikatnie odciągnij go do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano powyżej dla myszy).
      1. Należy pamiętać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może się oddzielić, jeśli zostanie chwycona zbyt blisko końcówki.
   3. Mocno trzymaj ogon w dłoni i zbliż się do karku szczura od tyłu.
      1. Na przykład, jeśli ogon szczura znajduje się w lewej ręce operatora, nie należy zbliżać się do szczura od strony nosa, aby chwycić go za kark prawą ręką. Zamiast tego należy sięgnąć nad lewą ręką i podejść do karku od tyłu.
   4. Wyprzyj delikatny nacisk na grzbiet szczura, nad łopatkami, a następnie chwyć kark blisko nasady czaszki pomiędzy palcami a dłonią.
   5. Kontrola głowy jest ważna, aby zapobiec ugryzieniom. Ugryzienia szczurów mogą spowodować poważne obrażenia.
   6. Szczury mogą wydawać dźwięki w czasie unieruchomienia w ten sposób.
4. Unieruchomienie szczura; chwyt nadbarkowy
   1. Chwyć szczura za ogon dominującą ręką i delikatnie odciągnij go do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano powyżej dla myszy).
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru pokrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
      2. Należy pamiętać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może się oddzielić, jeśli zostanie chwycona zbyt blisko końcówki.
   2. Połóż niedominującą rękę na grzbiecie szczura, zbliżając się od tyłu.
   3. Chwyć szczura w okolicy klatki piersiowej, używając palca serdecznego, małego i kciuka. Głowa szczura powinna znajdować się między palcem wskazującym a środkowym.
      1. Nie uciskaj klatki piersiowej.
   4. Szczura można trzymać w ten sposób jedną ręką, jeśli ciało jest ustabilizowane przy operatorze.
5. Unieruchomienie szczura; chwyt podbarkowy
   1. Chwyć szczura za ogon dominującą ręką i delikatnie odciągnij go do tyłu na chropowatej powierzchni (jak opisano powyżej dla myszy).
      1. Alternatywna metoda pozwala technikowi wykorzystać rękaw fartucha laboratoryjnego lub munduru pokrywający przedramię, aby ustawić zwierzę przed unieruchomieniem.
      2. Należy pamiętać, aby chwytać blisko nasady ogona, ponieważ skóra ogona szczura może się oddzielić, jeśli zostanie chwycona zbyt blisko końcówki.
   2. Połóż niedominującą rękę na grzbiecie szczura, zbliżając się od tyłu.
   3. Chwyć szczura w okolicy klatki piersiowej, bezpośrednio pod łopatkami. Przedramiona szczura powinny zostać delikatnie wypchnięte do góry kciukiem i palcem wskazującym.
      1. Przedramiona powinny skrzyżować się pod brodą szczura, co zapobiegnie gryzieniu.
      2. Nie uciskaj klatki piersiowej.
   4. Szczura można trzymać w ten sposób jedną ręką, jeśli ciało jest ustabilizowane przy operatorze.
6. Decapicone
   1. Decapicone to elastyczny, stożkowaty element z cienkiego plastiku z otworem na jednym końcu. Otwór jest na tyle mały, że mysz lub szczur może przez niego wystawić nos, ale nie resztę ciała.
   2. Aby unieruchomić zwierzę, umieść mysz lub szczura w Decapicone o odpowiednim rozmiarze.
   3. Przesuwaj zwierzę do przodu, aż jego nos wystanie z otworu w Decapicone.
   4. Zaciśnij worek wokół ogona lub użyj drucianej wiązadła, aby zamknąć zwierzę w stożku.
   5. Zaletą Decapicone jest to, że cienki plastik umożliwia wykonywanie iniekcji przez materiał.
   6. Wadą jest to, że materiał nie przepuszcza powietrza i zwierzęta mogą się przegrzać. Trzymaj zwierzę w Decapicone tylko przez czas niezbędny do wykonania procedury.
7. Akrylowy/sztywny plastikowy unieruchamiacz
   1. Plastikowe urządzenia do unieruchamiania są szczególnie przydatne, gdy wymagany jest dostęp do ogona zwierzęcia.
   2. Można je nabyć w sprzedaży lub wykonać w laboratorium.
   3. Rozmiar powinien być odpowiedni dla unieruchamianego zwierzęcia – zwierzę nie powinno móc obrócić się wewnątrz urządzenia.
   4. Umieść zwierzę w urządzeniu do unieruchamiania, najpierw delikatnie je unieruchamiając, a następnie wsuwając je głową do przodu do otworu urządzenia.
      1. Pomocne może być skierowanie urządzenia w górę nad klatką, ponieważ gryzonie często wspinają się do bezpiecznych struktur, takich jak rury.
   5. Załóż zamknięcie na końcu urządzenia, uważając, aby nie uszkodzić ogona, łap lub jąder zwierzęcia.
   6. Zminimalizuj czas przebywania w unieruchamiaczach, ponieważ zwierzęta mogą się przegrzać.
8. Zwierzęta mogą być unieruchamiane również w inny sposób, na przykład poprzez owinięcie w mały ręcznik lub po prostu przykrycie zwierzęcia dłonią. Techniki można dostosować do potrzeb zwierzęcia i pracownika. Zawsze dbaj o to, aby uniknąć ugryzień i zadrapań oraz zabezpiecz zwierzę przed przypadkowym uwolnieniem lub upadkiem z wysokości.

3. Metody podawania związków

1. Nie jest to w żadnym razie lista wyczerpująca i możliwe są inne drogi podania. Niniejszy protokół ma na celu przedstawienie najczęściej stosowanych metod. Inne drogi mogą wymagać znieczulenia zwierzęcia i podania leków przeciwbólowych po zabiegu.
2. Niezależnie od zastosowanej metody podania, należy upewnić się, że wszystkie materiały są przygotowane przed unieruchomieniem zwierząt.
3. Materiały wodne są łatwiejsze do wstrzyknięcia niż substancje gęstsze, takie jak związki na bazie olejów. Gęstsze związki należy zawsze wstrzykiwać bardzo powoli, aby uniknąć wysunięcia się igły z strzykawki.
4. Ogólne uwagi dotyczące stosowania igieł i strzykawek.
   1. Strzykawki i igły należy zawsze prawidłowo przechowywać i utylizować.
   2. Jeśli nie masz doświadczenia w posługiwaniu się strzykawkami i igłami, przed próbą wstrzyknięcia substancji zwierzęciu poćwicz obsługę strzykawki i technikę wstrzykiwania. Idealnie byłoby, gdybyś potrafił pewnie operować strzykawką i igłą jedną ręką, pozostawiając drugą do unieruchomienia zwierzęcia. Stabilna ręka minimalizuje ruchy igły, co ogranicza uszkodzenia tkanek.
   3. Igła składa się z czubka, ścięcia, trzonu i nasadki. Strzykawka posiada końcówkę, cylinder i tłok (Rycina 1 a i b).
   4. Rozmiar igieł określa się za pomocą parametru G (gauge) oraz długości. Im wyższa wartość G, tym cieńsza igła. Cienkie igły są bardzo podatne na stępienie (w wyniku powstania zadziora na czubku) i nie powinny być używane do nakłuwania fiolek wielodawkowych (Rycina 1 c). Zawsze wybieraj najkrótszą igłę, która pozwoli na skuteczne podanie związku.
   5. Igła jest mocowana do końcówki strzykawki za pomocą nasadki. Niektóre strzykawki mają końcówki z blokadą. Zawsze upewniaj się, że strzykawka jest bezpiecznie połączona z igłą.
   6. Igły najlepiej wprowadzać do ciała zwierzęcia ścięciem skierowanym do góry, szczególnie w przypadku wstrzyknięć dożylnych.
   7. Nigdy nie nakładaj kapturka na igłę ręcznie. Jest to częsta przyczyna zranień igłowych. Igły i strzykawki utylizuj prawidłowo w oznakowanych pojemnikach na odpady ostre. Jeśli nakładanie kapturków jest konieczne, dostępne są odpowiednie urządzenia (Rycina 1 d).
5. Donosowo (IN)
   1. Unieruchom zwierzę zgodnie z powyższym opisem.
   2. Za pomocą strzykawki lub pipety nanieś niewielką ilość materiału do inhalacji do nozdrzy zwierzęcia.
   3. Obserwuj, aż materiał zostanie wchłonięty przez nozdrza.
   4. Powtarzaj w razie potrzeby, aż do momentu podania pożądanej objętości.
6. Domięśniowo (IM)
   1. Unieruchom zwierzę zgodnie z powyższym opisem. Upewnij się, że jedna z tylnych łap zwierzęcia jest wolna i stabilna w celu wykonania wstrzyknięcia. Unieruchomienie może wymagać udziału dwóch osób. Jeśli zwierzę kopnie podczas wstrzyknięcia, dojdzie do uszkodzenia mięśni przez igłę.
   2. Igłę należy wprowadzać prostopadle do skóry zwierzęcia. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wprowadź igłę na głębokość ścięcia i wstrzyknij materiał w mięsień czworogłowy (przednia część uda) lub w boczną masę mięśniową uda.
   3. Nie wstrzykuj w tylną masę mięśniową, ponieważ istnieje ryzyko uszkodzenia nerwu kulszowego.
   4. Jeśli zwierzęta mają otrzymać wielokrotne wstrzyknięcia domięśniowe, stosuj na zmianę obie łapy.
7. Dosytingalnie (IP)
   1. Unieruchom zwierzę zgodnie z powyższym opisem.
   2. Skieruj nos zwierzęcia w stronę podłogi, odsłaniając brzuch do wstrzyknięcia.
   3. Zlokalizuj linię środkową zwierzęcia i mentalnie podziel brzuch na ćwiadry (Rycina 2). Dolne ćwiadry, a zwłaszcza dolny prawy ćwiadr zwierzęcia, są odpowiednimi miejscami dla wstrzyknięć dosytnio.
      1. Dolny prawy ćwiadr jest wybierany ze względu na brak istotnych anatomicznie struktur.
   4. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wstrzyknij materiał do organizmu zwierzęcia.
   5. Jeśli zwierzęta mają otrzymywać powtarzalne wstrzyknięcia dosytnie, zmieniaj miejsce podania.
8. Podskórnie (SC, SQ)
   1. Unieruchom zwierzę zgodnie z powyższym opisem. Zwierzę musi być unieruchomione na tyle luźno, aby możliwe było zmobilizowanie skóry.
   2. Jeśli zwierzęta mają być rutynowo obsługiwane po wstrzyknięciu podskórnym, nie chwytaj za kark. Zamiast tego użyj skóry na grzbiecie w okolicy krzyżowej lub na boku. Jeśli zwierzęta mają otrzymać wielokrotne wstrzyknięcia podskórne, zmieniaj miejsca podania.
   3. Chwyć skórę i delikatnie pociągnij ją do góry, tworząc „namiot”.
      1. W przypadku wykonywania wstrzyknięcia samodzielnie, wprowadź igłę i delikatnie unieś skórę do góry razem z igłą, aby potwierdzić, że igła znajduje się w przestrzeni podskórnej.
   4. Używając strzykawki i igły o odpowiednim rozmiarze, wprowadź igłę pod kątem 30-45° w uniesioną skórę i wstrzyknij materiał. Wstrzykuj równolegle do palców podtrzymujących skórę i w kierunku przeciwnym do nich.
   5. W przypadku prawidłowego wstrzyknięcia widoczny będzie niewielki obrzęk pod skórą.
   6. Po wstrzyknięciu wywrzyj delikatny ucisk, aby zapobiec cofaniu się materiału.
9. Śródskórnie (ID)
   1. W przypadku wstrzyknięć śródskórnych zwierzęta są często golone, aby skóra była widoczna.
   2. Unieruchomienie zwierzęcia przy wielokrotnych wstrzyknięciach śródskórnych może być trudne. W takim przypadku konieczna może być sedacja chemiczna. Miejsca wstrzyknięć ID są takie same jak dla SC.
   3. Wprowadź igłę o odpowiednim rozmiarze w skórę pod kątem 15-30°. Igła nie powinna zostać wprowadzona głęboko, a podczas wstrzykiwania powinien pojawić się opór.
      1. Alternatywną metodą jest delikatne uszczypnięcie skóry sąsiadującej z miejscem wstrzyknięcia i wprowadzenie igły pod bardzo małym kątem. Jest to przydatne u myszy, ponieważ zapobiega ich ruchom podczas procesu wstrzykiwania.
   4. Jeśli wstrzyknięcie przebiegło pomyślnie, pojawi się niewielka pęcherzyk (bleb). Będzie on bledszy niż otaczająca skóra.
   5. Po wstrzyknięciu wywrzyj delikatny ucisk, aby zapobiec cofaniu się materiału.
10. Do naczyniowo (IV)
    1. Lewa i prawa boczna żyła ogonowa są najczęstszymi drogami dostępu naczyniowego stosowanymi u myszy i szczurów.
    2. Inne drogi dostępu naczyniowego są możliwe u myszy i szczurów, lecz zazwyczaj wymagają sedacji i podania leków przeciwbólowych po wstrzyknięciu.
    3. W przypadku wstrzyknięcia do żyły ogonowej unieruchom zwierzę w Decapicone lub plastikowym ograniczniku dla gryzoni.
    4. Umieść ogon zwierzęcia pod lampą lub na zabezpieczonym urządzeniu grzewczym. Sprzyja to rozszerzeniu naczyń krwionośnych, co ułatwia wstrzyknięcie.
       1. Nie doprowadzaj do przegrzania zwierzęcia.
       2. W przypadku dużych samców szczurów, oczyszczenie łusek skórnych z ogona może pozwolić na lepszą wizualizację żyły. Czyszczenie powinno być delikatne, aby nie uszkodzić skóry.
    5. Trzymaj ogon zwierzęcia za końcówkę niedominującą ręką. Pozwoli to na wyprostowanie ogona.
    6. Obróć ogon o ¼ obrotu, aby żyły ogonowe znalazły się po stronie grzbietowej dla łatwiejszego wstrzyknięcia. Zwierzę posiada dwie boczne żyły ogonowe i jedną brzuszną tętnicę ogonową (Rycina 3).
    7. Zbliż igłę do ogona pod kątem 15-20°. Zacznij od dystalnej części ogona.
       1. Żyły są płytkie i igła nie powinna być wprowadzona znacznie głębiej niż do poziomu ścięcia.
       2. Jeśli wstrzykiwanie rozpocznie się jak najdalej dystalnie, w przypadku niepowodzenia pierwszej próby pozostanie więcej nieuszkodzonej żyły do kolejnych prób.
    8. Wstrzyknij materiał. Pomyślne wstrzyknięcie objawia się łatwym wprowadzaniem materiału do żyły bez oporu oraz pobieleniem żyły ogonowej przez cały czas trwania procesu.
       1. Nie aspiruj przed wstrzyknięciem, ponieważ spowoduje to zapadnięcie się żyły.
       2. Delikatny ucisk w miejscu wkłucia po wstrzyknięciu zapobiegnie krwawieniu.
    9. W przypadku nieudanego wstrzyknięcia materiał nie będzie przepływał łatwo. Zamiast tego skóra ogona pobieli się lub materiał w ogóle nie będzie mógł zostać wstrzyknięty.
11. Podanie dożołądkowe (zgłębnik doustny)
    1. Zgłębnik należy podawać wyłącznie unieruchomionym, przebudzonym zwierzętom. Znieczulenie lub sedacja zwiększają ryzyko aspiracji (nieumyślnego przedostania się materiału do płuc).
    2. Wybierz odpowiednio dobraną igłę do karmienia doustnego. Igły te posiadają na końcach kuliste nasadki, które zapobiegają ich przedostaniu się do tchawicy.
    3. Wymaganą długość można określić, trzymając unieruchomione zwierzę i mierząc od kącika ust. Kulista końcówka igły do karmienia powinna sięgać ostatniego żebra zwierzęcia (Rycina 4). Rozmiar igły G określa się na podstawie masy ciała zwierzęcia.
    4. Unieruchom zwierzę tak, aby głowa i ciało znajdowały się w linii prostej, pionowo. Prostuje to przełyk, co ułatwia wprowadzenie igły do karmienia.
    5. Wprowadź kulistą końcówkę igły do pyska zwierzęcia, nad język. Gdy igła znajdzie się na miejscu, podnieś igłę i strzykawkę, lekko dociskając je do podniebienia tak, aby nos zwierzęcia był skierowany ku sufitowi.
       1. U szczurów igłę może być konieczne lekko przekierować podczas przechodzenia przez tylną część gardła. Jakikolwiek opór przy przesuwaniu igły wskazuje na konieczność skorygowania pozycji.
    6. Kontynuuj wprowadzanie igły, aż do osiągnięcia ustalonej odległości. Igła powinna przechodzić łatwo, a zwierzę nie powinno łapać powietrza ani się dławić.
    7. Podaj substancję. Powinna ona swobodnie spłynąć do żołądka. Jeśli pojawi się opór lub zwierzę zacznie łapać powietrze, dławić się lub sineć, natychmiast przerwij czynność i wyjmij igłę. Zwierzęta, które doznały aspiracji, mogą wymagać eutanazji, w zależności od podawanego związku.

4. Reprezentatywne wyniki

W przypadku prawidłowego obchodzenia się z zwierzętami, stres zarówno zwierzęcia, jak i opiekuna jest zminimalizowany. Opiekunowie nie zostają pogryzieni ani podrapani, a zwierzęta są traktowane w sposób humanitarny i kompetentny. Związki są podawane właściwą drogą, przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i jak najmniejszym dyskomforcie dla zwierzęcia.

Jeśli badacze nie mają doświadczenia w pracy ze zwierzętami, pomocne może być ćwiczenie na małym pluszaku. Dostępne są również symulatory zwierząt dla niektórych technik, takie jak szczur Koken. Wielu badaczy ma niewielką możliwość zapoznania się z igłami i strzykawkami przed rozpoczęciem pracy ze zwierzętami. Reprezentatywne części igły i strzykawki przedstawiono na Rysunku 1A i 1B. Przed pierwszym wykonaniem zastrzyku u zwierząt warto przećwiczyć technikę wstrzykiwania. Bardzo cienkie igły, np. o rozmiarach 28 i 30 g, są podatne na uszkodzenia. Podczas pobierania substancji z fiolek wielodawkowych należy w tym celu użyć większej igły, a następnie zastąpić ją igłą o mniejszej średnicy do samego wstrzyknięcia. Igła z zadziorem widoczna jest na Rysunku 1C. Podczas pracy z igłami należy przestrzegać podstawowych zasad bezpieczeństwa, takich jak zakaz ręcznego nakładania nasadek na zużyte igły. Rysunek 1D pokazuje urządzenie do nakładania nasadek na igły w użyciu. Może ono być przydatne badaczom, którzy muszą usunąć igły, na przykład w celu wypchnięcia krwi ze strzykawki, aby uniknąć hemolizy występującej podczas przepychania krwi przez igłę.

Rysunki 2 i 3 przedstawiają punkty orientacyjne dla iniekcji wewnątrzbrzusznej oraz typową budowę ogona, wskazując miejsca docelowe wstrzyknięć. Rysunek 4 zawiera przykłady prawidłowego doboru rozmiaru kaniul do gavage. Kaniule do gavage powinny sięgać od pyska zwierzęcia do miejsca tuż poniżej ostatniego żebra.

Rysunek 1. A) igła i B) części strzykawki, opisane. C) zadzior na igle powstały w wyniku wielokrotnego wbijania igły do fiolki wielodawkowej. D) nakładka na igłę w użyciu.

Rycina 2. Kwadranty brzucha po stronie brzusznej. Wstrzyknąć wyłącznie do dwóch dolnych kwadrantów, najlepiej do prawego dolnego kwadrantu.

Rycina 3. Schemat przekroju poprzecznego ogona, ilustrujący położenie tętnic i żył względem struktur kostnych i ścięgnistych.

Rysunek 4. Dobór rozmiaru igły do gavage u szczurów. A) Igła do gavage zbyt długa. B) Igła do gavage o odpowiedniej długości. C) Pomiar igły do gavage – zbyt krótka. D) Palpacja ostatniego żebra w celu ustalenia odpowiedniej długości igły do gavage.

	Mysz		Szczur
Droga	Zalecana objętość	Zalecany rozmiar i długość igły	Zalecana objętość	Zalecany rozmiar i długość igły
Donosowo1	5-25 μl	Nie dotyczy	5-25 μl	N/A
Domięśniowo1,2	0,005 ml/g	<23 G, 0,5 do 0,75 cala	0,1 ml/kg	<21 g, 0,5 do 0,75 cala
Dos Usuarios brzusznych1,2	0,02 ml/g	<21 g, 0,75 do 1 cala	10 ml/kg	<21 g, 0,75 do 1 cala
Podskórnie1,2	0,01 ml/g	<2 g, 0,5–1 cal	5 ml/kg	<2 g, 0,5 do 1 cala
Wewnątrzskórnie1	0,05-0,1 ml	<26 G, 0,5 cal	0,05-0,1 ml	<26 g, 0,5 cala
Dożylnie1,2	0,05 ml/g - 0,025 ml/g*	<25 g, 0,75 do 1 cala	5 ml/kg-20 ml/kg*	<23 g, 0,75 do 1 cala
Doustne podawanie przez zgłębnik1,2	0,01 ml/g	igła do karmienia 20-2 G	5-10 ml/kg	igła do karmienia 16-20 G

*Pierwsza liczba oznacza objętość podawaną w formie bolusa dożylnego w ciągu około 1 minuty. Druga objętość to dawka, która może być podana w formie powolnej infuzji w ciągu 5-10 minut.

Tabela 1. Zalecane dawki i rozmiary igieł dla różnych dróg podawania związków u myszy i szczurów.

Dyskusja

Niniejszy protokół należy traktować jako wprowadzenie do postępowania ze zwierzętami i podawania substancji, mające na celu uzupełnienie praktycznego szkolenia przeprowadzanego w placówce badawczej. Sposoby unieruchamiania oraz drogi podawania substancji powinny zostać uwzględnione w planie doświadczalnym oraz podczas sporządzania protokołu badawczego lub protokołu komisji etycznej.

Szkolenie w zakresie procedur związanych z wykorzystaniem zwierząt jest kluczowe dla sukcesu badań. Aby przeprowadzić większość eksperymentów, zwierzęta muszą być obsługiwane przez personel badawczy, a im lepsza jest technika obchodzenia się ze zwierzęciem, tym mniejszy jest jego stres ³. Przyzwyczajanie zwierząt do łagodnego kontaktu z człowiekiem może zredukować stres i sprawić, że zwierzęta staną się bardziej uległymi obiektami badawczymi ^4,5. Wykazano, że stres związany z obsługą wpływa na niektóre rodzaje badań ⁶ i jest możliwe, że wpływa również na inne. Unieruchamianie gryzoni powinno być przeprowadzane przy ostrożnym, ale pewnym chwycie (niepewny chwyt może doprowadzić do obrażeń gryzonia oraz osoby obsługującej) i powinno trwać tak krótko, jak to praktycznie możliwe. Metody unieruchamiania są zazwyczaj dobierane w zależności od wielkości zwierzęcia lub pożądanego dostępu do jego ciała. Na przykład chwytanie dorosłych szczurów za kark, choć jest możliwe, często spotyka się z silnym oporem ze strony zwierzęcia, zwłaszcza jeśli osoba obsługująca jest niedoświadczona. Trzymanie myszy lub szczura w ręku może utrudnić dostęp do żył ogonowych, dlatego często wybiera się urządzenie do unieruchamiania, aby zwierzę pozostawało w możliwie największym bezruchu.

Podczas pracy z zwierzętami badacze często dążą do podania związku chemicznego lub preparatu biologicznego w celu przeprowadzenia dalszych badań. Droga podania substancji może wpływać na jej wchłanianie, biodostępność oraz przydatność dla konkretnego eksperymentu. Znajomość różnych dróg podania powinna umożliwić badaczom wybór najodpowiedniejszej metody aplikacji substancji dla celów ich badań. Na przykład drogi sprzyjające szybkiemu wchłanianiu substancji, takie jak dożylna lub dosytnawiczowa, nie powinny być stosowane, jeśli badacz chce podać substancję w sposób wolniej działający. Aktualne przeglądy niektórych z tych technik oraz kwestie dotyczące objętości, sprzętu i substancji rozpuszczonej można znaleźć w dwóch publikacjach autorstwa Turnera et al. ^1,7

Przy każdym podawaniu substancji gryzoniom laboratoryjnym należy zwrócić uwagę na odpowiedni rozmiar sprzętu oraz objętość substancji (opisane w Table 1). Niewłaściwie dobrany sprzęt lub zbyt duże objętości mogą prowadzić do dyskomfortu, obrażeń lub śmierci zwierzęcia. Co do zasady, substancje podawane drogą parenterystyczną powinny być sterylne, chyba że cele badawcze uniemożliwiają zachowanie tej zasady (i.e. w badaniach bakteriologicznych). Związki chemiczne i substancje biologiczne powinny znajdować się w rozpuszczalniku lub nośniku, który wywrze najmniejszy wpływ na zwierzę. pH fizjologiczne (7.3 -7.4) jest zazwyczaj dobrze tolerowane, zwłaszcza w przypadku podawania podskórnego, domięśniowego i dosmaxWidthnienia. Nie fizjologiczne poziomy pH substancji podawanych tymi drogami mogą powodować ból, martwicę oraz uszkodzenia tkanek. Szersze zakresy pH są tolerowane przy podawaniu dożołądkowym i dożylnym ⁷. W przypadku małych gryzoni innym ważnym aspektem jest ryzyko wychłodzenia przy podawaniu dużych objętości płynów w temperaturze pokojowej. Jeśli płyny są podawane dożylnie lub dosmaxWidthnnie, zwłaszcza w celu wsparcia chorego zwierzęcia, powinny zostać ogrzane do temperatury ciała (37 °C).

Drogi podania omówione w niniejszym protokole są powszechnie stosowane w wielu programach badawczych, są łatwe do opanowania i zazwyczaj nie wymagają znieczulenia. Możliwe jest jednak niemal nieskończone zróżnicowanie dróg podania, w tym między innymi dojamczkowo, dokanałowo, znadtwardówkowo, dotchawiczo, doszpikowo oraz dostawowo. Szkolenia w zakresie tych specjalistycznych dróg podania należy odbyć u osób posiadających obszerne doświadczenie w ich stosowaniu oraz potwierdzoną skuteczność.

U gryzoni droga donosowa jest zazwyczaj wykorzystywana do badania substancji wprowadzanych do płuc w sposób bardziej „naturalny” niż w przypadku instylacji dotchawiczej. Myszy i szczury oddychają obligatoryjnie przez nos, dlatego skłonienie ich do wdychania bardzo małych ilości płynu nie jest trudne, nawet u zwierząt przytomnych. Ponieważ błona śluzowa nosa jest dobrze ukrwiona, donosowa administracja niektórych substancji może być zbliżona do podania dożylnego. Ta droga podania nie jest jednak zalecana u zwierząt z zapaleniem błony śluzowej nosa, ponieważ może to upośledzić wchłanianie. Próby podania dużych objętości drogą donosową mogą prowadzić do duszności lub utonięcia zwierzęcia.

Iniekcje domięśniowe zapewniają szybką absorpcję substancji. W przypadku szczurów i myszy iniekcje domięśniowe mogą być trudne ze względu na ich niewielki rozmiar i odpowiadająco małe mięśnie. Są one wykonywane w kończynach tylnych. Ze względu na ryzyko uszkodzenia nerwu kulszowego, preferowanym miejscem wstrzyknięcia jest mięsień czworogłowy uda.

Choć zarówno droga podskórna, jak i śródskórna obejmują skórę, istnieją różnice w biodostępności substancji podanych do skóry w porównaniu z tkanką podskórną. Podanie podskórne jest często uważane za drogę „depozytową”, charakteryzującą się wolniejszą wchłanialnością niż w przypadku innych dróg, takich jak dożylna czy dosytrojna. Podanie śródskórne stosuje się dla bardzo małych objętości substancji, zazwyczaj substancji immunostymulujących, takich jak mieszaniny adiuwant-antygen. W obu przypadkach podawane substancje powinny mieć pH fizjologiczne i nie powinny działać drażniąco. Iniekcji śródskórnych lub podskórnych nie należy wykonywać w obrębie karku, ponieważ jest to miejsce powszechnie wykorzystywane do unieruchamiania gryzoni.

Podawanie dożylne i dootrzewnowe są często uważane za równoważne u gryzoni. Drogi podania dożylnego zapewniają jednak szybsze wchłanianie związków, podczas gdy podawanie dootrzewnowe należy uznać za mniej więcej równoważne podaniu doustnemu ⁸. Należy zachować ostrożność przy związkach podawanych dootrzewnowo, ponieważ mogą one powodować ból, jeśli nie zostaną odpowiednio zbuforowane. Powszechną drogą podania dożylnego w formie bolusa u gryzoni są żyły ogonowe. Jeśli wymagane jest przewlekłe podawanie substancji dożylnie, należy rozważyć implantację kaniul żylnych lub tętniczych. Substancje podawane dożylnie powinny być wprowadzane aseptycznie i winny być sprawdzone pod kątem bezpieczeństwa podania dożylnego. Na przykład substancje, które mogą wywołać hemolizę, zakrzepicę lub zapalenie naczyń, nie nadają się do podawania dożylnego.

Droga podania wewnątrzżołądkowego lub przez zgłębnik (gavage) jest często stosowana w celu odwzorowania typowej drogi podawania leków u ludzi. Pozwala ona również na precyzyjne dawkowanie substancji w porównaniu z podawaniem doustnym poprzez pokarm lub wodę. Biodostępność związków podawanych za pomocą zgłębnika różni się w zależności od stanu sytości lub głodówki zwierzęcia, a także od rozpuszczalnika lub nośnika związku lub substancji biologicznej. Igły do podawania lub karmienia powinny mieć odpowiedni rozmiar dostosowany do gatunku i wielkości zwierzęcia oraz być czyszczone pomiędzy kolejnymi osobnikami, jeśli stosowanie jednorazowych igieł nie jest praktyczne. Urazy spowodowane podawaniem przez zgłębnik nie są rzadkie i obejmują m.in. przedostanie się substancji do płuc lub przerwanie ciągłości ściany żołądka lub przełyku. Szkolenie powinno odbywać się pod nadzorem doświadczonego specjalisty i być przeprowadzane najpierw na zwierzętach uśpionych (eutanazowanych), następnie na zwierzętach pod narkozą (które zostaną poddane eutanazji), zanim przystąpi się do prób u zwierząt budzących się. Pierwsze próby podawania przez zgłębnik u zwierząt budzących się powinny obejmować osobniki o średniej wielkości i niewielkie objętości substancji, np. soli fizjologicznej, która nie spowoduje obrażeń w przypadku niepowodzenia procedury. Po zabiegu zwierzęta należy uważnie oceniać pod kątem objawów stresu lub dyskomfortu, takich jak duszność, sinica, krwawienie lub nadmierne ślinienie, i w razie potrzeby poddać eutanazji. Jeśli konieczna jest eutanazja, należy przeprowadzić sekcję zwłok zwierzęcia, aby ustalić przyczynę niepowodzenia procedury podawania przez zgłębnik.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły	Różne	Różne	Igły są sprzedawane według średnicy (gauge) i długości. Przed zamówieniem należy sprawdzić oba parametry.
Strzykawki	Różne	Różne	Zawsze należy dobrać odpowiedni rozmiar do objętości podawanej substancji.
DecapiCones	Braintree Scientific	DC-200, DCL-120, MDC-200	Dostępne w rozmiarach dla myszy i szczurów.
Restryktory dla gryzoni	Harvard Apparatus, Braintree Scientific, Plas-Labs, inne		Dostępne z przezroczystego pleksiglasu, z regulowanego tworzywa sztucznego, w rozmiarach dla myszy i szczurów.
Probówka stożkowa 50 ml	Różne
Igły do karmienia	VWR, Popper and Sons	Różne	Średnicę i długość igły należy dobrać do zwierząt zgodnie z powyższym opisem. Dostępne są igły do karmienia jednorazowe oraz wielorazowe.