Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Podsumowanie

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Streszczenie

Po wewnątrzsercowym podaniu komórek MDA-MB-231-luc-D3H2LN myszom Nu/Nu u zwierząt poddanych procedurze rozwinęły się przerzuty systemowe. Do monitorowania rozprzestrzeniania się i rozwoju komórek nowotworowych po procedurze podania zastosowano obrazowanie bioluminescencyjne przy użyciu systemu IVIS Spectrum, w tym rekonstrukcję DLIT w celu pomiaru sygnału nowotworowego i określenia jego lokalizacji.

Rozwój zmian przerzutowych w tkankach kostnych wywołuje aktywność osteolityczną, a zmiany w kościach piszczelowych i udowych oceniano podłużnie za pomocą mikro-CT. Obrazowanie przeprowadzono przy użyciu systemu Quantum FX micro CT z zastosowaniem szybkiego obrazowania i niskiej dawki promieniowania rentgenowskiego. Niska dawka promieniowania pozwala na przeprowadzenie wielu sesji obrazowania z kumulatywną dawką promieniowania znacznie poniżej LD50. Aby sekwencyjnie obrazować myszy zarówno za pomocą IVIS Spectrum, jak i Quantum FX, użyto urządzenia do transportu myszy, co pozwoliło na dokładne pozycjonowanie zwierząt zarówno w obrazach bioluminescencyjnych, jak i CT. Zbiory danych optycznych i CT zarejestrowano wspólnie w trzech wymiarach przy użyciu oprogramowania Living Image 4.1. To wielomodalne podejście umożliwia jednoczesne, ścisłe monitorowanie wzrostu i rozwoju guza oraz aktywności osteolitycznej.

Protokół

Obrazowanie podłużne jest stosowane w badaniach przedklinicznych do śledzenia postępu choroby lub pomiaru efektu działania terapeutyku. W onkologii metody optyczne stanowią rygorystyczne narzędzia do monitorowania wzrostu guza i precyzyjnego określania ilościowego wzrostu komórek lub ekspresji genów w każdym punkcie czasowym takiego badania. Zmiany anatomiczne można mierzyć za pomocą techniki o wysokiej rozdzielczości, takiej jak microCT, jednak w przypadku obrazowania podłużnego należy stosować niską dawkę promieniowania rentgenowskiego, aby uniknąć artefaktów biologicznych. Obrazy optyczne i microCT mogą być współrejestrowane w celu uzyskania kombinacji danych funkcjonalnych i anatomicznych, co zapewnia wydobycie maksymalnej ilości informacji z modelu zwierzęcego.

1. Przygotowanie komórek

1. Firma Caliper dostarcza szereg linii komórkowych raka wykazujących ekspresję lucyferazy do badań przedklinicznych w modelach mysich.
2. MDA-MB-231-luc-D2H2LN to ludzka linia komórkowa guza piersi wykazująca ekspresję genu lucyferazy, która może służyć jako optyczny wskaźnik tumorigenzy in vivo. Linia ta powstała z samoistnej przerzutnej do węzła chłonnego, która wywodzi się z guza w poduszce tłuszczowej piersi D3H1 i znana jest z agresywnego tworzenia przerzutów.
3. Komórki dostarczane są w formie mrożonej hodowli wolnej od patogenów, która łatwo rośnie w standardowych mediach bez konieczności stosowania markerów selekcyjnych.
4. Aby zweryfikować aktywność lucyferazy przed wstrzyknięciem do zwierzęcia, pobiera się komórki z kolby o 90% konfluencji metodą trypsynizacji. Aktywność lucyferazy mierzy się poprzez naniesienie 50 000 komórek na płytkę mikrotitracyjną i przeprowadzenie rozcieńczeń seryjnych.

2. Wewnątrzsercowe wstrzykiwanie komórek u zwierząt

1. Przed wstrzyknięciem zwierzęta poddaje się anestezji z użyciem 3% izofluranu.
2. Do lewej komory wstrzykuje się od 1 do 3 milionów komórek w objętości 50ul. Zawiesina komórkowa zawiera 150ug/ml D-Luciferin w celu walidacji techniki wstrzykiwania.
3. Aby potwierdzić prawidłowe wstrzyknięcie wewnątrzsercowe, myszy poddaje się obrazowaniu w systemie IVIS. Myszy wykazujące sygnał BLI w całym organizmie zostały wstrzyknięte prawidłowo. Jeśli sygnał jest zlokalizowany, oznacza to, że komórki nie zostały prawidłowo wstrzyknięte do serca.

3. Obrazowanie BLI w celu monitorowania przerzutów

1. Karetka do obrazowania stabilizuje mysz podczas akwizycji danych zarówno w systemie IVIS Spectrum, jak i w systemie mikroCT QuantumFX.
2. Karetka pomaga utrzymać zwierzę w tej samej pozycji podczas obrazowania i zawiera markery fiducyjne ułatwiające automatyczną korejestrację. Komora jest połączona z parownikiem isofluranu w celu utrzymania znieczulenia.
3. Kreator obrazowania w oprogramowaniu Living Image 4.1 może być wykorzystany do automatycznego wyboru czasu ekspozycji, wartości przysłony (f-stop) oraz binningu, co zapewnia ilościowy pobór danych.
4. W badaniach podłużnych, obejmujących od sekund do miesięcy w zależności od charakteru eksperymentu, można pozyskać i porównać wiele obrazów.
5. W 6. dobie po wstrzyknięciu komórek obrazowanie BLI w systemie IVIS Spectrum wykazuje przerzuty do kości u siedmiu z dziewięciu myszy.

4. Podłużne monitorowanie zmian osteolitycznych przy użyciu mikro-TK

1. Myszy, u których stwierdzono wyraźne przerzuty do kości widoczne w BLI, poddano obrazowaniu w systemie mikro-CT Quantum FX.
2. System mikro-CT Quantum FX dostarcza wysokiej jakości obrazy przy dawce promieniowania rentgenowskiego na tyle niskiej, aby umożliwić rzeczywiste podłużne badanie mikro-CT w badaniach przedklinicznych.
3. Degradację kości w obu kończynach można monitorować podłużnie za pomocą tego systemu w czasie krótszym niż minuta.
4. Myszy są znieczulane 3% izofluranem i mogą być przenoszone bezpośrednio z systemu IVIS Spectrum.
5. Dwa obrazy o szerokości 60 mm są łączone (zszywane), aby uzyskać widok całego zwierzęcia.
6. Pole widzenia (FOV) o rozmiarze 30 mm jest idealne do obrazowania stawu kolanowego w wysokiej rozdzielczości.
7. Pojedynczy skan z rozdzielczością wystarczającą do pomiaru i ilościowego określenia przerzutów do kości trwa zaledwie 18 sekund i dostarcza dawkę zaledwie 13mGy.
8. Myszy były obrazowane do 8 razy w ciągu 36 dni za pomocą systemu mikro-CT bez wpływu na wzrost guza lub stan zdrowia zwierzęcia.
9. Obrazowanie mikro-CT wykazało, że zmiany kostne były widoczne w 10. dniu i postępowały bardzo szybko, co odpowiadało zwiększeniu sygnału BLI.

5. Trójwymiarowa korejestracja i analiza BLI oraz uCT

1. Po zarejestrowaniu obrazów w systemach IVIS spectrum oraz Quantum FX micro CT, dane można zarejestrować wspólnie w celu stworzenia rekonstrukcji 3D.
2. Obrazy microCT są eksportowane jako pliki DICOM i wczytywane do narzędzia Living Image 4.1 3D Multi modality.
3. W oprogramowaniu Living Image należy uruchomić program DLIT, aby przeprowadzić trójwymiarową rekonstrukcję sygnału optycznego.
4. Do wspólnej rejestracji optycznego sygnału BLI z obrazem micro CT służy narzędzie fiducial w oprogramowaniu.
5. Zarejestrowane wspólnie zestawy danych można analizować ilościowo w celu monitorowania wielu parametrów podczas progresji choroby; w tym przypadku śledzimy wzrost guza przerzutowego wraz z rozwojem zmiany osteolitycznej w kości.

Dyskusja

Obrazowanie małych zwierząt za pomocą mikro-TK znajduje zastosowanie w monitorowaniu zmian osteolitycznych w warunkach patologicznych, takich jak rozwój nowotworów (Cowey et al. 2007; Labrinidis et al., 2009). Ponieważ obrazowanie bioluminescencyjne guzów znakowanych lucyferazą zostało szeroko wprowadzone w badaniach przedklinicznych, korejestracja obrazów bioluminescencyjnych i mikro-TK pozwoliła na lepsze określenie anatomicznej lokalizacji sygnałów bioluminescencyjnych (Kaijzel et al. 2007). Wcześniejsze badanie z wykorzystaniem linii komórkowej raka piersi MDA-MB-231-luc-D3H2LN znakowanej lucyferazą wykazało obecność przerzutów do kości oraz rozwój zmian osteolitycznych po wstrzyknięciu wewnątrzsercowym (Jenkins et al 2005; Minn et al., 2005). W niniejszej pracy przeprowadziliśmy podłużne badanie przerzutów nowotworowych i aktywności osteolitycznej z wykorzystaniem kombinacyjnego obrazowania optycznego oraz mikro-TK o niskiej dawce promieniowania w systemowym modelu przerzutów MDA-MB-231-luc-D3H2LN. Wykonaliśmy sekwencyjne obrazowanie z użyciem systemów IVIS Spectrum i Quantum FX microCT, a korejestrację bioluminescencji i TK przeprowadziliśmy za pomocą opracowanego przez nas oprogramowania Living Image 4.1 (Heng et al., 2010). Obrazowanie bioluminescencyjne systemem IVIS zapewnia nieinwazyjną detekcję komórek nowotworowych z wysoką czułością, co pozwala na wykrycie guzów we wczesnym stadium. Obrazowanie systemem Quantum FX umożliwia dokładną rekonstrukcję 3D zmian kostnych oraz dostarcza szczegółowych informacji anatomicznych. System Quantum FX oferuje obrazowanie z niską dawką promieniowania, co pozwala na podłużne monitorowanie postępu choroby. Korelacja zmian kostnych i przerzutów nowotworowych została przedstawiona na obrazie korejestrowanym, co wyraźnie zademonstrowało zalety multimodalnego śledzenia rozwoju zmian w czasie.