Przygotowanie żywych, wyizolowanych fotoreceptorów kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego

Podsumowanie

Opisano metodę przygotowania pojedynczych żywych fotoreceptorów z różnych gatunków kręgowców do obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta może być wykorzystana do obrazowania fluorescencji endogennych fluoroforów, takich jak NADH lub witamina A, bądź egzogennych barwników fluorescencyjnych wrażliwych na Ca²⁺ lub inne czynniki.

Streszczenie

W siatkówce kręgowców fototransdukcja, czyli konwersja światła na sygnał elektryczny, jest realizowana przez fotoreceptory pręcikowe i czopkowe^1-4. Fotoreceptory pręcikowe odpowiadają za widzenie w słabym świetle, a czopki w świetle jasnym. Fototransdukcja zachodzi w segmencie zewnętrznym komórki fotoreceptora, który jest wyspecjalizowaną strukturą zawierającą wysokie stężenie barwnika wzrokowego, będącego głównym detektorem światła. Barwnik wzrokowy składa się z chromoforu, 11-cis-retinalu, przyłączonego do białka – opsyny. Foton pochłonięty przez barwnik wzrokowy izomeryzuje chromofor z formy 11-cis do all-trans. Ta fotoizomeryzacja powoduje zmianę konformacyjną barwnika wzrokowego, która inicjuje kaskadę reakcji kończących się zmianą potencjału błonowego, co prowadzi do transdukcji bodźca świetlnego na sygnał elektryczny. Powrót komórki do stanu spoczynku po stymulacji światłem obejmuje dezaktywację produktów pośrednich aktywowanych przez światło oraz przywrócenie potencjału błonowego. Ca²⁺ moduluje aktywność kilku enzymów zaangażowanych w fototransdukcję, a jego stężenie ulega zmniejszeniu podczas stymulacji światłem. W ten sposób Ca²⁺ odgrywa istotną rolę w regeneracji komórki po stymulacji świetlnej oraz w jej adaptacji do światła tła.

Kolejnym niezbędnym elementem procesu regeneracji jest odnowienie barwnika wzrokowego, który uległ rozkładowi podczas detekcji światła w wyniku fotoizomeryzacji jego chromoforu 11-cis do formy all-trans^5-7. Regeneracja ta rozpoczyna się od uwolnienia retinalu all-trans przez fotoaktywowany barwnik, w wyniku czego pozostaje apoproteinowa opsyna. Uwolniony retinal all-trans jest szybko redukowany w reakcji z wykorzystaniem NADPH do retinolu all-trans, natomiast opsyna łączy się ze świeżym retinalem 11-cis dostarczonym do segmentu zewnętrznego, aby ponownie utworzyć barwnik wzrokowy. Retinol all-trans jest następnie transportowany z segmentu zewnętrznego do sąsiednich komórek przez wyspecjalizowany transporter – białko wiążące retinoidy międzyfotoreceptorowe (IRBP).

Obrazowanie fluorescencyjne pojedynczych komórek fotoreceptorowych może być wykorzystywane do badania ich fizjologii i biologii komórki. Barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca²⁺ mogą służyć do szczegółowego badania zależności między zmianami stężenia Ca²⁺ w segmencie zewnętrznym a odpowiedzią na światło^8-12, a także do analizy roli zapasów Ca²⁺ w segmencie wewnętrznym w homeostazie Ca^2+13,14. Barwniki fluorescencyjne mogą być również stosowane do pomiaru stężenia Mg²⁺¹⁵, pH oraz jako znaczniki przedziałów wodnych i błonowych¹⁶. Wreszcie, wewnętrzna fluorescencja all-trans-retinolu (witaminy A) może być wykorzystana do monitorowania kinetyki jego powstawania i usuwania w pojedynczych komórkach fotoreceptorowych^17-19.

Protokół

1. Przygotowanie szalek pokrytych Sylgardem, komór eksperymentalnych i żyletek

1. Do prawidłowego siekania wyizolowanej siatkówki w celu uzyskania pojedynczych komórek fotoreceptorów potrzebne są 35 mm szalki Petriego firmy Falcon pokryte elastomerem Sylgard. Elastomer przygotowuje się zgodnie z instrukcją dostawcy, a niewielką jego ilość wlewa się do każdej szalki, aby pokryć jej dno warstwą materiału. Po pokryciu należy założyć pokrywki na szalki i je przechować. Po kilku dniach elastomer twardnieje i szalki są gotowe do użycia.
2. Wyizolowane fotoreceptory muszą przylegać do dna komory eksperymentalnej, aby pozostały unieruchomione podczas eksperymentu obrazowania. Osiąga się to poprzez pokrycie dna komór poli-L-lizyną lub poli-L-ornityną. Do każdej komory dodaje się 200 μL 0,01% roztworu jednej z tych substancji, a następnie przykrywa komory ręcznikiem papierowym, aby chronić je przed kurzem. Po wyschnięciu roztworu komory płucze się wodą destylowaną i przechowuje w zamkniętym pudełku. Należy ich użyć w ciągu 2 tygodni.
3. Aby oczyścić komory po zakończeniu eksperymentu, należy przemyć je 100% etanolem w celu usunięcia oleju z obiektywu imersyjnego oraz szczątków komórkowych. W celu usunięcia szczątków komórkowych należy użyć aplikatorów z bawełnianą końcówką i ostrożnie wyszorować dno komory. Następnie komory płucze się wodą destylowaną i pozostawia do wyschnięcia przed ponownym pokryciem.
4. Dwustronne żyletki należy pociąć na małe kawałki (8 z jednej żyletki) za pomocą metalowego przecinaka.

2. Przygotowanie roztworów

1. Skład roztworów zależy od gatunku. Dla płazów roztwór Ringera zawiera (w mmol/L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl₂, 1 CaCl₂, 5 HEPES, pH = 7,55. Wartość pH należy dostosować do wartości końcowej za pomocą NaOH. Dla ssaków roztwór Ringera zawiera (w mmol/L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl₂, 2 CaCl₂, 25 hemisodowego HEPES, pH = 7,40. Roztwór Ringera można przechowywać w szczelnie zamkniętym naczyniu w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.
2. Zatężony roztwór glukozy, 1 mol/L, przechowywany w temperaturze -20 °C w celu uniknięcia wzrostu bakterii.
3. W dniu eksperymentu dodać glukozę do roztworu Ringera do końcowego stężenia 5 mmol/L. Na koniec dnia należy zutylizować roztwór Ringera zawierający glukozę, ponieważ mogą w nim rozwijać się bakterie.

3. Izolacja siatkówek

1. Aby prawidłowo wyciąć siatkówkę, ważne jest, aby zwierzę było adaptowane do ciemności przez co najmniej 2-3 godziny przed uśmierceniem. Zwierzęta powinny być adaptowane do ciemności w odpowiednim wentylowanym pojemniku w ciemni.
2. Napełnij dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm do połowy roztworem Ringera.
3. Uśmierć zwierzę przy słabym czerwonym świetle i usuń gałki oczne. Następnie wszystkie procedury wykonuje się w świetle podczerwonym przy użyciu mikroskopu sekcyjnego lub kamery z monitorem wideo.
4. Usuń wszelkie pozostałości tkanek z zewnętrznej powierzchni oka. Odetnij i usuń część przednią, a następnie przenieś oczodoł do jednej z szalek Petriego wypełnionych roztworem Ringera.
5. Usuń ciało szkliste i ostrożnie oddziel siatkówkę od reszty oczodołu, odrywając lub odcinając wszelkie przyczepy. Delikatnie unieś siatkówkę i całkowicie oddziel ją od oczodołu.
6. Przenieś siatkówkę do drugiej szalki Petriego za pomocą plastikowej pipety transferowej. Przechowuj szalkę z siatkówką w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku.

4. Izolacja pojedynczych komórek fotoreceptorów

1. Wszystkie procedury przeprowadza się w świetle podczerwonym. Odcina się niewielki fragment siatkówki i przenosi go za pomocą plastikowej pipety do szalki pokrytej Sylgardem. Objętość roztworu zawierającego fragment siatkówki powinna wynosić około 250 μL.
2. Za pomocą uchwytu chwyta się mały fragment żyletki tak, aby krawędź ostrza była ustawiona pod kątem około 45° względem uchwytu. Fragment siatkówki rozplaszcza się na warstwie Sylgardu, a następnie za pomocą ostrza drobno sieka, dbając o to, aby tkanka pozostawała przyklejona do warstwy Sylgardu.
3. Przenosi się 200 μL roztworu zawierającego komórki do komory eksperymentalnej – wszelkie pozostałe fragmenty siatkówki pozostawia się w szalce pokrytej Sylgardem. Komorę z izolowanymi komórkami przechowuje się w szczelnym, nieprzepuszczającym światła pudełku.
4. Należy odczekać 10 min, aż komórki osiądą, a następnie dodać 2-3 mL roztworu Ringera. Na tym etapie izolowane komórki można obciążyć odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym (np. Fura-2) zgodnie z protokołem wprowadzania barwnika.
5. Komórki można teraz przenieść na stolik mikroskopu w celu przeprowadzenia eksperymentów.

5. Obrazowanie fluorescencyjne

1. Przenieś komorę na stolik mikroskopu epifluorescencyjnego. Dostosuj perfuzję roztworu, sondy temperatury, oświetlenie podczerwone itp.
2. Zaciągnij zasłony i rozpocznij eksperyment. Włącz światło podczerwone wewnątrz obudowy mikroskopu, ustaw ostrość na dnie komory eksperymentalnej i przesuwaj stolikiem w poszukiwaniu komórek.

6. Reprezentatywne wyniki:

Ryc. 1 przedstawia morfologię zdrowych, wyizolowanych fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych uzyskanych za pomocą tego protokołu z siatkówki salamandry (Ambystoma tigrinum). Komórki salamandry są szeroko stosowane w badaniach obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek ze względu na ich duży rozmiar oraz zdolność do przeżycia przez kilka godzin po izolacji z siatkówki. Ponadto z siatkówki salamandry można regularnie pozyskiwać zarówno fotoreceptory pręcikowe, jak i czopkowe.

Jednym z ważnych kryteriów oceny stanu zdrowia komórek jest obecność nienaruszonego elipsoidu (Rys. 1), czyli części komórki, w której skoncentrowane są mitochondria. Podczas obserwacji komórek w optyce DAPI, ta koncentracja mitochondriów daje silny sygnał fluorescencyjny (Rys. 2) ze względu na obecność NADH. Brak nienaruszonego elipsoidu jest oznaką uszkodzenia komórki, która zazwyczaj nie nadaje się do eksperymentu. Rys. 3 przedstawia uszkodzony fotoreceptor pręcikowy salamandry z obrzękniętym ciałem komórki i skondensowanym jądrem. Takie komórki wykazują znacznie słabszą fluorescencję w optyce DAPI, ale w optyce FITC widoczny jest silny sygnał FAD w obszarze elipsoidu (pochodzący od utlenionych nukleotydów flawinowych i flawoprotein). Kolejnym kryterium oceny stanu zdrowia wyizolowanych fotoreceptorów jest ich zdolność do generowania witaminy A (retinolu całkowicie-trans) w segmentach zewnętrznych po stymulacji światłem. Generowanie witaminy A wymaga znacznych ilości NADPH, co zależy od sprawności mechanizmów metabolicznych. Rysunki 4 i 5 przedstawiają tworzenie się witaminy A w segmentach zewnętrznych odpowiednio nienaruszonych fotoreceptorów pręcikowych żaby i myszy.

Rycina 1. Zdrowe pojedyncze fotoreceptory typu pręcika i czopka. Komórki zostały wyizolowane z siatkówki salamandry tygrysiej. Fototransdukcja zachodzi w segmencie zewnętrznym, a elipsoid jest gęsto wypełniony mitochondriami. Pręciki odpowiadają za widzenie w słabym świetle, a czopki za widzenie w jasnym świetle.

Rysunek 2. Fluorescencja żywych pręcików i czopków salamandry. Są to komórki zaadaptowane do ciemności, wykazujące silną fluorescencję NADH w odpowiednich ellipsoidach oraz brak istotnej fluorescencji witaminy A w ich segmentach zewnętrznych. Rejestracja obrazu fluorescencyjnego reprezentuje ich pierwszą ekspozycję na światło widzialne po okresie adaptacji do ciemności.

Rysunek 3. Uszkodzony fotoreceptor pręcikowy salamandry. Obrzęknięte ciało komórki oraz skondensowane jądro świadczą o uszkodzeniu. Komórka jest utleniona i wykazuje minimalny sygnał NADH (optyka DAPI), lecz znacznie silniejszy sygnał FAD (optyka FITC).

Rycina 4. Pręcik żaby z NADH i retinolem. Jest to zdrowy fotoreceptor pręcikowy żaby wykazujący silną fluorescencję NADH w obszarze elipsoidalnym. Przed ekspozycją na światło w segmencie zewnętrznym występuje minimalna fluorescencja. Po ekspozycji na światło obserwuje się znaczny wzrost fluorescencji w segmencie zewnętrznym wynikający z tworzenia się witaminy A.

Rycina 5. Pręcik myszy z retinolem. Przedstawiony jest zdrowy fotoreceptor typu pręcika myszy wykazujący znaczącą fluorescencję segmentu zewnętrznego po ekspozycji na światło, co wynika z tworzenia się witaminy A. Regiony elipsoidalne fotoreceptorów typu pręcika myszy nie wykazują silnego sygnału fluorescencyjnego.

Dyskusja

Jeśli nie uda się uzyskać zdrowych, wyizolowanych komórek, problem leży albo w procesie izolacji lub stanie zdrowotnym siatkówki, albo w sposobie jej rozdrabniania. Zazwyczaj po usunięciu przedniej części oka oraz ciała szklistego siatkówka łatwo oddziela się od nabłonka barwnego. Jeśli tak się nie dzieje, należy spróbować ją odwarstwić, zaczynając od obwodu gałki ocznej. Jeżeli oddzielenie nadal sprawia trudności, prawdopodobną przyczyną może być niewystarczający czas adaptacji zwierzęcia do ciemności lub zbyt intensywn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ciemnia (100-150 ft2)
Światła czerwone19			Sklepy internetowe
Źródła światła podczerwonego i podglądacze obrazu w podczerwieni	FJW Optical Systems, Inc.
Mikroskop stereoskopowy19			Wyposażony w podglądacze w podczerwieni
Mikroskop epifluorescencyjny zamknięty w szczelnej klatce świetlnej19
Narzędzia do sekcji (nożyczki, pęsety, uchwyt do ostrza)	Roboz Surgical Instruments Co.
Elastomer Sylgard	Essex (Charlotte, NC)	Zestaw elastomeru Sylgard 184
Poly-L-ornithine (0,01%)	Sigma-Aldrich	P4957
Poly-L-lysine (0,1%)	Sigma-Aldrich	P8920	Rozcieńczyć do 0,01%
Komory eksperymentalne	Warner Instruments	D3512P
Szalki Petriego, plastikowe pipety	Fisher Scientific