Ilościowe określanie częstości komórek rozmnażających się w nowotworach przy użyciu przeszczepu komórek z ograniczonym rozcieńczeniem u syngenicznych danio pręgowanych

Summary

Testy do przeszczepiania komórek o ograniczonym rozcieńczeniu są używane do określenia częstotliwości komórek rozprzestrzeniających się nowotwory. Protokół ten opisuje metodę generowania syngenicznych danio pręgowanego, u których rozwija się znakowana fluorescencyjnie białaczka i szczegółowo opisuje, jak izolować i przeszczepiać te komórki białaczki przy ograniczaniu rozcieńczenia do jamy otrzewnowej dorosłego danio pręgowanego.

Abstract

Samoodnawiające się komórki nowotworowe to jedyne typy komórek w guzie, które mają nieograniczoną zdolność do promowania wzrostu nowotworu, dlatego są znane jako komórki propagujące nowotwór lub komórki inicjujące nowotwór. Uważa się, że ukierunkowanie tych samoodnawiających się komórek w celu zniszczenia zablokuje postęp guza i zatrzyma nawroty, znacznie poprawiając rokowanie pacjentów¹. Najczęstszym sposobem określenia częstości samoodnawiających się komórek w guzie jest test przeszczepu komórek z ograniczeniem rozcieńczenia, w którym komórki nowotworowe są przeszczepiane zwierzętom biorcom w rosnących dawkach; Proporcja zwierząt, u których rozwijają się nowotwory, służy do obliczenia liczby samoodnawiających się komórek w oryginalnej próbce guza^{2, 3}. Idealnie byłoby, gdyby w każdym eksperymencie z ograniczeniem rozcieńczenia wykorzystano dużą liczbę zwierząt, aby dokładnie określić częstotliwość rozprzestrzeniania się nowotworu. Jednak eksperymenty na dużą skalę z udziałem myszy są kosztowne, a większość testów ograniczających rozcieńczenia wykorzystuje tylko 10-15 myszy na eksperyment.

Danio pręgowany zyskał na znaczeniu jako model raka, w dużej mierze dzięki łatwości manipulacji genetycznej i ekonomii, dzięki której można przeprowadzać eksperymenty na dużą skalę. Ponadto stwierdzono, że typy nowotworów modelowane u danio pręgowanego ściśle naśladują ich odpowiedniki w chorobach ludzkich⁴. Chociaż możliwe jest przeszczepienie komórek nowotworowych od jednej ryby do drugiej poprzez subletalne napromienianie zwierząt biorców, regeneracja układu odpornościowego po 21 dniach często powoduje regresję nowotworu⁵. Niedawne stworzenie syngenicznego danio pręgowanego znacznie ułatwiło badania nad przeszczepami nowotworów ^6-8. Ponieważ zwierzęta te są genetycznie identyczne, przeszczepione komórki nowotworowe wszczepiają się solidnie do ryb biorców, a wzrost guza można monitorować przez długi czas. Syngeniczny danio pręgowany jest idealny do ograniczania testów przeszczepu w rozcieńczeniu, ponieważ komórki nowotworowe nie muszą przystosowywać się do wzrostu w obcym mikrośrodowisku, które może zaniżać częstotliwość samoodnawiania się komórek^{9, 10}. Ponadto z powodzeniem przeprowadzono przeszczepy jednokomórkowe przy użyciu syngenicznego danio pręgowanego⁸, a kilkaset zwierząt może być łatwo i ekonomicznie przeszczepionych za jednym razem, co zapewnia dokładniejsze oszacowanie częstotliwości samoodnawiania się komórek.

Tutaj prezentowana jest metoda tworzenia pierwotnej, znakowanej fluorescencyjnie ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej komórek T (T-ALL) u syngenicznego danio pręgowanego i przeszczepiania tych guzów przy ograniczeniu rozcieńczenia dorosłym rybom w celu określenia częstotliwości samoodnawiania się komórek. Chociaż białaczka jest podawana jako przykład, protokół ten jest odpowiedni do określenia częstotliwości komórek rozmnażających się w guzie przy użyciu dowolnego modelu raka u danio pręgowanego.

Protocol

1. Mikroiniekcja DNA zarodków danio pręgowanego

1. Linearyzuj konstrukty DNA rag2::cMyc i rag2::GFP¹¹, trawiąc 10 μg każdego plazmidu za pomocą NotI w temperaturze 37°C przez noc.
2. Fenol: chloroform ekstrahuje i wytrąca plazmidy, a następnie ponownie zawiesza każdy z nich w 20 μl H₂O.
3. Określić stężenie DNA, przeprowadzając rozcieńczenie 1:1, 1:5 i 1:10 każdego strawionego plazmidu na 1% żelu agarozowym z 20 μl, 10 μl i 5 μl drabiny DNA wysokiego zakresu. Ten rodzaj kwantyfikacji jest na ogół dokładniejszy niż odczyt spektrometru.
4. Rozcieńczyć DNA do końcowego stężenia 60 ng / μL w 1M KCl + 0,5X TE do wstrzyknięcia do zarodków zebry zebry szczepu CG1 (lub innego szczepu syngenicznego) za pomocą 30 ng / μL rag2 :: cMyc + 30 ng / μL rag2 :: GFP.
5. Iniekcje należy wykonywać zgodnie z wcześniejszymi wskazaniami^{12, 13}. Krótko mówiąc, samce i samice danio pręgowanego są umieszczane w komorach godowych w noc przed wstrzyknięciem. W dniu wstrzyknięcia DNA jest ładowane do igły iniekcyjnej, ciśnienie jest regulowane tak, aby wydalany był pęcherzyk o średnicy 50 μm (DNA 30 pg), który jest mierzony za pomocą mikrometru stopniowego. Następnie zarodki są wstrzykiwane w stadium jednokomórkowym, przy czym DNA jest wstrzykiwane bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przeżywalność wstrzykniętych zarodków i larw CG1 jest na ogół niska i tylko 5% ryb z powodzeniem włączy transgen; W związku z tym należy wstrzyknąć >600 zarodków, aby upewnić się, że niektóre ryby zachorują na białaczkę.
6. Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5°C, a martwe zarodki usuwaj po 24 godzinach. Zwierzęta są następnie przenoszone do dużych zbiorników po 5 dniach życia i hodowane zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁴.

2. Badania przesiewowe w kierunku pierwotnego T-ALL u larw danio pręgowanego

1. Około 28 dni po wstrzyknięciu znieczulij larwy danio pręgowanego, dodając 200 μl 4 ng / m Tricane-S do 25 ml wody z systemu rybnego na szalce Petriego.
2. Zbadaj larwy pod kątem rozwoju znakowanego fluorescencyjnie T-ALL za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy 20-krotnym powiększeniu, używając długości fali wzbudzenia 485/20 i filtra emisyjnego 530/25 do wykrywania fluorescencji GFP (ryc. 1).
3. Oddziel larwy dodatnie od tych, które są ujemne. Larwy z ujemnym wynikiem można zbadać w późniejszym czasie, gdy guzy mogą się powiększyć, aby upewnić się, że żadna ryba z dodatnim wynikiem T-ALL nie została pominięta.
4. Monitoruj ryby T-ALL dodatnie co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, aby śledzić wzrost guza.

3. Izolacja i oczyszczanie komórek białaczki pierwotnej znakowanych fluorescencyjnie

1. Gdy komórki białaczkowe GFP-dodatnie przejęły >50% zwierzęcia, należy złożyć rybę w ofierze, dodając 1 ml 4 ng / ml Tricane-S na szalkę Petriego zawierającą 9 ml wody z systemu rybnego.
2. Umieść rybę na nowej szalce Petriego zawierającej 1 ml 0,9 X PBS z 5% płodową surowicą bydlęcą w celu buforowania komórek. Maceruj rybę żyletką, pipetuj mieszaninę, aby zdysocjować duże grudki komórek, a następnie przepuść komórki przez sitko o siatce 40 μm do probówki o pojemności 50 ml. Nie jest konieczne dysocjowanie wszystkich grudek tkanek na pojedyncze komórki.
3. Odpipetuj 500 μl komórek do probówki polistyrenowej o pojemności 4 ml. Dodaj 1 μl 1 mg / ml jodku propydyny (PI), który oznaczy martwe komórki. Wiruj, a następnie utrzymuj komórki na lodzie.
4. Poświęć rybę CG1 typu dzikiego, maceruj i odcedź w taki sam sposób, jak powyżej, aby zebrać normalne komórki, które służą jako nośnik komórek nowotworowych podczas przeszczepu. Dodaj 4 ml 5% FBS w 0,9 X PBS do probówki 50 ml, aby uzyskać całkowitą objętość 5 ml.
5. Policz normalne komórki, rozcieńczyć do 3x10⁵ komórek/ml w 5% FBS w 0,9X PBS, a następnie odpipetować 100 μl / dołek z 96-dołkowej płytki.
6. Za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) posortuj komórki nowotworowe GFP dodatnie, PI ujemne (ryc. 2A, B) do 96-dołkowej płytki zawierającej komórki krwi w następujących dawkach: 10 komórek / studnia do 48 dołków, 100 komórek / studnia do 24 dołków, 1000 komórek / studnia do 12 dołków i 10 000 komórek / studnia do 6 dołków. Dodatkowo, 10 000 komórek powinno zostać posortowanych do studzienki bez normalnych komórek krwi i ponownie przeanalizowanych za pomocą FACS w celu oceny czystości i żywotności posortowanych komórek (Figura 2C).

4. Ograniczanie przeszczepiania rozcieńczeń do dorosłego danio pręgowanego

1. Osadzaj komórki, odwirowując 96-dołkową płytkę o 2000 x g przez 10 minut.
2. Usuń 95 μl supernatantu i ponownie zawieś komórki w pozostałych 5 μl.
3. Trzymaj dorosłego (>60 dni) syngenicznego danio pręgowanego brzuszną stroną do góry i wstrzyknij zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej za pomocą mikrostrzykawki 26G/2". Danio pręgowany nie musi być znieczulony przed przeszczepem. Zazwyczaj 45 ryb przeszczepia się z 10 komórkami białaczkowymi, 20 przesadza się ze 100 komórkami, 7 z 1000 komórek, a 5 ryb przesadza się z 10 000 komórek T-ALL.

5. Analiza w celu określenia częstości komórek inicjujących białaczkę

1. Około 28 dni po przeszczepie zbadaj przeszczepioną rybę za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu długości fali wzbudzenia 485/20 i filtra emisyjnego 530/25 w celu wykrycia fluorescencji GFP. Zapisać liczbę ryb z wynikiem dodatnim na łączną liczbę wstrzykniętych ryb.
2. Ponownie badaj ryby co 14 dni przez okres do 90 dni i zapisuj liczbę ryb z wynikiem dodatnim. Kiedy ryba z dodatnim guzem stanie się w stanie agonalnym, należy ją poświęcić przez przedawkowanie Tricane-S.
3. Wprowadź wyniki do tabeli, jak pokazano na rysunku 3D. Prześlij dane do internetowego oprogramowania statystycznego ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) pod adresem http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html¹⁵, które wykorzystuje częstość występowania zwierząt z dodatnim i ujemnym wynikiem nowotworu przy każdej dawce przeszczepu w celu określenia częstości samoodnawiających się komórek białaczkowych w pierwotnym T-ALL.

6. Reprezentatywne wyniki:

Mikroiniekcja DNA do embrionów z ryb syngenicznych często skutkuje niską przeżywalnością wstrzykniętych zarodków, przy czym <60% zarodków przeżywa przez 24 godziny. Ponadto przeżywalność wstrzykniętych ryb syngenicznych jest na ogół słaba w okresie rozwoju larw, przy czym często <20% przeżywa 28 dni. Dlatego ważne jest, aby wstrzyknąć dużą liczbę zarodków w celu stworzenia transgenicznych ryb, u których rozwinie się T-ALL.

Na przykład, zarodkom szczepu CG1 wstrzyknięto rag2::cMyc+rag2::GFP. Transgeny ulegają kosegregacji w rozwijającym się zarodku, tak że każda komórka, która wyraża GFP, będzie również wyrażać cMyc. Larwy poddano badaniom przesiewowym pod kątem pierwotnego T-ALL po 28 dniach (ryc. 1). Poprzednie prace wykazały, że około 5% wstrzykniętych ryb będzie miało limfocyty T GFP-dodatnie w grasicy (ryc. 1), a 100% tych ryb rozwinie białaczkę, gdy limfocyty T ulegną transformacji¹¹. Podczas gdy niewielka część danio pręgowanego może mieć bardziej zaawansowaną białaczkę, która jest bardzo łatwa do wykrycia w 28 dniu, większość z nich będzie miała tylko grasicę GFP-dodatnią (ryc. 1), więc larwy powinny być badane indywidualnie w dużym powiększeniu, aby upewnić się, że wszystkie dodatnie ryby zostały wybrane. Komórki T-ALL GFP-dodatnie wyprzedzą >50% zwierzęcia między 45 a 70 dniem.

W podanym przykładzie, danio pręgowany został złożony w ofierze po 65 dniach życia, a komórki białaczki zostały wyizolowane, a FACS posortowany w celu ograniczenia przeszczepu w rozcieńczeniu. Pojedyncze komórki, które były ujemne pod względem jodku propidyny i GFP (ryc. 2), posortowano na 96-dołkową płytkę. Ponowną analizę przeprowadzono na 10 000 posortowanych komórek w celu oceny żywotności (najlepiej >95%) i czystości (najlepiej >92%, Ryc. 2). Przeszczepione T-ALL zwykle pojawiają się przed 28 dniami, ale niektóre nowotwory mogą rozwijać się dłużej niż 60 dni. W tym przykładzie, w dniu 28, guzy we wczesnym stadium były postrzegane jako obszar komórek GFP-dodatnich w pobliżu miejsca wstrzyknięcia (Figura 3B), podczas gdy niektóre T-ALL były bardziej zaawansowane, rozszerzając się, wypełniając jamę otrzewnej (Figura 3C). Dane z testów przeszczepu komórek ograniczających rozcieńczenie z trzech różnych pierwotnych T-ALL przedstawiono na rycinie 3D. Na potrzeby tych eksperymentów przeszczepiono ponad 220 zwierząt, co może być łatwo wykonane przez jedną osobę w ciągu kilku godzin. Analiza danych za pomocą oprogramowania ELDA wykazała, że średnio 1 na 135 komórek T-ALL były samoodnawiającymi się komórkami propagującymi białaczkę (Figura 3E).

Rysunek 1. Larwy danio pręgowanego, którym wstrzyknięto w stadium jednokomórkowym rag::-cMyc+rag::-eGFP, poddano badaniom przesiewowym pod kątem wzrostu pierwotnej białaczki 28 dni po wstrzyknięciu. Ryby (*) miały limfocyty T GFP-dodatnie w grasicy; ta ryba rozwinie T-ALL, ponieważ limfocyty T z czasem ulegną transformacji. Ten etap jest bardzo powszechny w 28 dniu. Jedna ryba (**) miała zaawansowany T-ALL, który rozprzestrzenił się na tkanki miękkie. Pozostałe dwie ryby są ujemne dla wzrostu guza. Zdjęcie zostało wykonane w 16-krotnym powiększeniu.

Rysunek 2. Znakowane fluorescencyjnie komórki T-ALL posortowano od chorych zwierząt i wykorzystano w teście przeszczepu komórek o ograniczonym rozcieńczeniu. Najpierw narysowano bramkę, aby wybrać pojedyncze komórki (lewy górny panel), a następnie wybierane są komórki ujemne jodku propidyny (lewy środkowy panel). Na koniec narysowano bramkę, aby wybrać do sortowania tylko komórki białaczki GFP-dodatnie (lewy dolny panel). Posortowane komórki należy ponownie przeanalizować, aby ocenić żywotność i czystość przed przeszczepem (prawe panele).

Rysunek 3. Danio pręgowany badano pod kątem wzrostu białaczki 28 dni po przeszczepie. Ryby są albo guzoujemne (A), mają mały guz rosnący w miejscu wstrzyknięcia (B), albo mają zaawansowaną białaczkę (C). Zdjęcia zostały wykonane w 7-krotnym powiększeniu. Rejestruje się całkowitą liczbę ryb zakażonych białaczką na całkowitą liczbę ryb przeszczepionych przy każdym rozcieńczeniu, jak w (D). Dane są wprowadzane do internetowego programu ELDA w celu obliczenia liczby samoodnawiających się komórek białaczkowych oraz górnego i dolnego 95% przedziału ufności (E).

Discussion

Główną zaletą wykorzystania danio pręgowanego w badaniach nad rakiem jest to, że duża liczba zwierząt może być wykorzystana przy stosunkowo niskich kosztach. Jest to szczególnie ważne w ograniczaniu testów przeszczepiania komórek rozcieńczających, w których proporcje przeszczepionych zwierząt, u których rozwijają się nowotwory, do całkowitej liczby przeszczepionych komórek są wykorzystywane do określenia częstości komórek inicjujących nowotwór. W przedstawionej tutaj metodzie wykorzystuje się ponad 70 biorców przeszczepów w jednym teście, zapewniając dokładne oszacowanie liczby komórek rozmnażających nowotwór. Zarówno liczba wykorzystywanych zwierząt, jak i dawki przeszczepianych komórek nowotworowych powinny być zoptymalizowane pod kątem danego modelu nowotworu; Na przykład, jeśli wstępne eksperymenty pokazują, że komórki inicjujące nowotwór są rzadkie, użyteczne dawki do przeszczepu mogą wynosić 100 000, 50 000, 10 000 i 1000 komórek na przeszczep.

Syngeniczne szczepy danio pręgowanego są przydatne w analizie rozcieńczeń ograniczających. Jednak szczepy te nie są jeszcze powszechnie stosowane we wszystkich laboratoriach, a niektóre modele raka danio pręgowanego istnieją tylko u ryb allogenicznych. Przeszczepy komórek ograniczających rozcieńczenie można przeprowadzić w szczepach typu dzikiego, które przeszły ablację immunologiczną, chociaż częstość samoodnawiających się komórek może być obliczona jako 10-100 razy wyższa niż w przypadku użycia syngenicznego danio pręgowanego⁸. Ważne jest, aby pamiętać, że większe dawki komórek powinny być stosowane do przeszczepów do napromieniowanych biorców, którzy nie są uodporni, ponieważ niektóre komórki nowotworowe nie przetrwają przeszczepu do obcego mikrośrodowiska. Ponadto wiele guzów zacznie się cofać po 21 dniach, gdy układ odpornościowy zwierzęcia biorcy odzyska sprawność, dlatego zwierzęta powinny być oceniane pod kątem wzrostu guza co 7 dni po przeszczepie.

Przedstawione tutaj metody są odpowiednie do zastosowania z każdym modelem raka danio pręgowanego i do tej pory były stosowane do określania częstości komórek inicjujących nowotwór zarówno w ostrej białaczce limfoblastycznej^z komórek T 8, jak i w modelu guza litego, mięsaku prążkowanokomórkowego¹⁶. Guzy te znakowano fluorescencyjnie przez jednoczesne wstrzyknięcie zarodków zarówno z onkogenem, jak i markerem fluorescencyjnym; ponieważ DNA ulega kosegregacji, każda komórka wykazująca ekspresję onkogenu będzie również wyrażać białko fluorescencyjne¹⁷. Chociaż fluorescencja jest zalecana, ponieważ ułatwia śledzenie wzrostu guza bez konieczności poświęcania zwierzęcia i zapewnia prosty sposób izolowania komórek nowotworowych za pomocą FACS, możliwe jest znakowanie komórek nowotworowych przeciwciałami do twórców specyficznych dla nowotworu, aby ułatwić ich oczyszczanie, chociaż barwienie przeciwciał u danio pręgowanego może wymagać optymalizacji.

Wreszcie, po określeniu częstości występowania komórek rozmnażających się w nowotworze dla danego typu nowotworu, możliwe jest wykorzystanie tych testów do identyfikacji mechanizmów rządzących częstotliwością ich komórek. Na przykład pierwotne komórki nowotworowe mogą być leczone inhibitorami specyficznymi dla szlaku przed ograniczeniem przeszczepu rozcieńczenia, a same przeszczepione ryby mogą otrzymać leki. Dodatkowo, genetyka samych nowotworów może być manipulowana poprzez wstrzyknięcie jednokomórkowej ryby z interesującym genem, tak aby powstałe pierwotne guzy powodowały nadmierną ekspresję genu. W tych eksperymentach jakikolwiek wpływ na częstość samoodnawiania się komórek będzie obserwowany w testach rozcieńczenia granicznego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Enzym restrykcyjny NotI	New England Biolabs	R0189
Fenol: Chloroform	EMD Millipore	6805-OP
5M KCl	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
Drabinka DNA wysokiego zasięgu	Fermentas	R0621
Syngeniczny danio		pręgowanyReferencje6-8
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, firmy Life Technologies	16000-036
Jodek propidium	Sigma-Aldrich	P4864
26G/2" Mikrostrzykawka	Hamilton Co	80366
40μ m siatkowy sitko do komórek	BD Biosciences	352340