Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Podsumowanie

Testy transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym są stosowane do określania częstości występowania komórek propagujących nowotwór. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania syngeneicznych rybek zebrafish, u których rozwija się białaczka z oznakowaniem fluorescencyjnym, oraz szczegółowo wyjaśnia, jak izolować i transplantować te komórki białaczkowe z rozcieńczeniem ograniczającym do jamy otrzewnej dorosłych rybek zebrafish.

Streszczenie

Samoodnawiające się komórki nowotworowe są jedynym typem komórek w obrębie guza, które posiadają nieograniczoną zdolność do promowania wzrostu nowotworu, dlatego są znane jako komórki propagujące nowotwór lub komórki inicjujące nowotwór. Przypuszcza się, że ukierunkowanie destrukcji na te samoodnawiające się komórki zablokuje progresję nowotworu i powstrzyma nawroty, znacząco poprawiając rokowania pacjentów¹. Najczęstszym sposobem określenia częstości występowania komórek samoodnawiających się w obrębie guza jest test transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym, w którym komórki nowotworowe są przeszczepiane zwierzętom biorcom w rosnących dawkach; proporcja zwierząt, u których rozwinął się nowotwór, jest wykorzystywana do obliczenia liczby komórek samoodnawiających się w pierwotnej próbce guza^{2, 3}. Idealnie, w każdym eksperymencie z rozcieńczeniem ograniczającym należałoby wykorzystać dużą liczbę zwierząt, aby dokładnie określić częstość występowania komórek propagujących nowotwór. Jednakże wielkoskalowe eksperymenty z udziałem myszy są kosztowne, a większość testów z rozcieńczeniem ograniczającym wykorzystuje jedynie 10-15 myszy na eksperyment.

Ryby z gatunku zebrafish zyskały znaczenie jako model raka, w dużej mierze dzięki łatwości manipulacji genetycznych oraz ekonomicznym kosztom przeprowadzania eksperymentów na dużą skalę. Dodatkowo stwierdzono, że rodzaje nowotworów modelowane u zebrafish ściśle naśladują odpowiadające im schorzenia u ludzi⁴. Chociaż możliwe jest przeszczepienie komórek nowotworowych z jednej ryby do drugiej poprzez poddawanie zwierząt biorców subletalnemu napromieniowaniu, regeneracja układu odpornościowego po 21 dniach często powoduje regresję guza⁵. Niedawne stworzenie syngenicznych linii zebrafish znacznie ułatwiło badania nad transplantacją nowotworów ^6-8. Ponieważ zwierzęta te są genetycznie identyczne, przeszczepione komórki nowotworowe silnie przyjmują się w organizmach ryb biorców, a wzrost guza może być monitorowany przez długi czas. Syngeniczne zebrafish są idealne do testów transplantacyjnych z rozcieńczeniami ograniczającymi, ponieważ komórki nowotworowe nie muszą adaptować się do wzrostu w obcym mikrośrodowisku, co mogłoby prowadzić do niedoszacowania częstotliwości występowania komórek samoodnawiających się^{9, 10}. Dodatkowo, u syngenicznych zebrafish z sukcesem przeprowadzono przeszczepy pojedynczych komórek⁸, a jednocześnie można w sposób łatwy i ekonomiczny przeszczepić materiał kilkuset zwierzętom, co w obu przypadkach pozwala na uzyskanie dokładniejszej oceny częstotliwości występowania komórek samoodnawiających się.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę tworzenia pierwotnych, znakowanych fluorescencyjnie komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T (T-ALL) u syngeneicznych rybek danio prążkowanych oraz transplantacji tych guzów w rozcieńczeniu ograniczającym do dorosłych ryb w celu określenia częstotliwości komórek samoodnawiających się. Choć jako przykład posłużyła białaczka, protokół ten jest odpowiedni do określania częstotliwości komórek propagujących guz z wykorzystaniem dowolnego modelu nowotworowego u rybek danio prążkowanych.

Protokół

1. Mikroiniekcja DNA do zarodków rybki zebrafish

1. Zlinearyzuj konstrukty DNA rag2::cMyc oraz rag2::GFP¹, trawiąc 10μg każdego plazmidu enzymem NotI w temperaturze 37°C przez noc.
2. Wykonaj ekstrakcję fenolowo-chloroformową i wytrącenie plazmidów, a następnie zawieś każdy z nich w 20μL H₂O.
3. Wyznacz stężenie DNA, przeprowadzając elektroforezę rozcieńczeń 1:1, 1:5 i 1:10 każdego trawionego plazmidu na 1% żelu agarozy wraz z 20μL, 10μL i 5μL markera DNA o szerokim zakresie. Ten rodzaj kwantyfikacji jest zazwyczaj dokładniejszy niż odczyt spektrometryczny.
4. Rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 60ng/μL w 1M KCl+0.5X TE w celu wstrzyknięcia do zarodków ryb zebrafish szczepu CG1 (lub innego szczepu syngenicznego), stosując mieszaninę 30ng/μL rag2::cMyc + 30ng/μL rag2::GFP.
5. Iniekcje należy przeprowadzić zgodnie z wcześniej opisaną metodą^{12, 13}. W skrócie: samice i samce zebrafish umieszcza się w komorach do rozrodu wieczorem w dniu poprzedzającym iniekcję. W dniu iniekcji DNA ładuje się do igły, a następnie reguluje ciśnienie tak, aby wypchnąć pęcherzyk o średnicy 50μm (30pg DNA), co mierzy się za pomocą mikrometru przedmiotowego. Następnie wstrzykuje się DNA do zarodków w stadium jednego komórki, bezpośrednio do komórki, a nie do żółtka. Przeżywalność wstrzykniętych zarodków i larw CG1 jest zazwyczaj niska i tylko 5% ryb pomyślnie włączy transgen; w związku z tym należy wstrzyknąć >60 zarodków, aby zapewnić, że u niektórych ryb rozwinie się białaczka.
6. Przechowuj wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5°C i usuń martwe zarodki po 24h. Następnie, w 5. dniu życia, zwierzęta przenosi się do dużych zbiorników i hoduje zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁴.

2. Przesiewanie w kierunku pierwotnej T-ALL u larw rybek zebrafish

1. Około 28 dni po iniekcji znieczulić larwy zebrafish, dodając 20μL Tricane-S w stężeniu 4ng/m do 25mL wody systemowej dla ryb w szalce Petriego.
2. Zbadać larwy pod kątem rozwoju znakowanej fluorescencyjnie białaczki T-ALL za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 20X, stosując długość fali wzbudzenia 485/20 oraz filtr emisyjny 530/25 w celu wykrycia fluorescencji GFP (Rysunek 1).
3. Oddzielić larwy z dodatnim wynikiem w kierunku obecności guza od tych z wynikiem ujemnym. Larwy ujemne można zbadać w późniejszym terminie, gdy guzy mogłyby urosnąć do większych rozmiarów, aby upewnić się, że nie pominięto żadnych ryb z dodatnim wynikiem T-ALL.
4. Monitorować ryby z dodatnim wynikiem T-ALL co najmniej raz w tygodniu za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego w celu śledzenia wzrostu guza.

3. Izolacja i oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanych pierwotnych komórek białaczki

1. Gdy komórki białaczki wykazujące ekspresję GFP zajmą >50% organizmu zwierzęcia, uśmierć rybę, dodając 1mL 4ng/mL Tricane-S do szalki Petriego zawierającej 9mL wody z systemu hodowli ryb.
2. Przenieś rybę do nowej szalki Petriego zawierającej 1mL 0,9X PBS z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu buforowania komórek. Rozdrobnij rybę za pomocą żyletki, pipetuj mieszaninę, aby rozbić duże skupiska komórek, a następnie przefiltruj komórki przez sito o oczkach 40μm do probówki 50mL. Nie jest konieczne rozbijanie wszystkich grudek tkanki do pojedynczych komórek.
3. Przenieś 50μL zawiesiny komórkowej do polistyrenowej probówki 4mL. Dodaj 1μL 1mg/mL jodku propidyny (PI), który znakuje martwe komórki. Wymieszaj na wortexie, a następnie przechowuj komórki w lodzie.
4. Uśmierć rybę linii CG1 typu dzikiego, rozdrobnij i przefiltruj w ten sam sposób co powyżej, aby zebrać prawidłowe komórki, które posłużą jako nośnik dla komórek nowotworowych podczas transplantacji. Dodaj 4mL 5% FBS w 0,9X PBS do probówki 50mL, aby uzyskać całkowitą objętość 5mL.
5. Policz prawidłowe komórki, rozcieńcz je do stężenia 3x10⁵ komórek/mL w 5% FBS w 0,9X PBS, a następnie nanieś po 10μL na studzienkę płytki 96-dołkowej.
6. Za pomocą sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) odseparuj GFP-dodatnie i PI-ujemne komórki nowotworowe (Rysunek 2A,B) do płytki 96-dołkowej zawierającej komórki krwi w następujących dawkach: 10 komórek/studzienkę do 48 studni, 100 komórek/studzienkę do 24 studni, 10 komórek/studzienkę do 12 studni oraz 10 0 komórek/studzienkę do 6 studni. Dodatkowo, 10 0 komórek należy odseparować do studzienki bez prawidłowych komórek krwi i poddać ponownej analizie za pomocą FACS, aby ocenić czystość i żywotność posortowanych komórek (Rysunek 2C).

4. Przeszczepianie metodą rozcieńczeń ograniczających do dorosłych danio pręgowanych

1. Odwirować komórki, centrifugując płytkę 96-dołkową przy 200xg przez 10 minut.
2. Usunąć 95μL supernatantu i resuspenderć komórki w pozostałych 5μL.
3. Utrzymać dorosłego (>60 dni) syngenicznego danio pręgowanego brzuchem do góry i wstrzyknąć zawiesinę komórkową do jamy otrzewnej, używając mikrostrzykawki 26G/2”. Ryby danio nie muszą być znieczulone przed transplantacją. Zazwyczaj 45 ryb otrzymuje transplantację 10 komórek białaczki, 20 ryb otrzymuje 10 komórek, 7 ryb otrzymuje 10 komórek, a 5 ryb otrzymuje 10 0 komórek T-ALL.

5. Analiza w celu wyznaczenia częstotliwości występowania komórek inicjujących białaczkę

1. Około 28 dni po transplantacji obejrzyj przetransplantowane ryby pod mikroskopem epifluorescencyjnym, stosując długość fali wzbudzenia 485/20 i filtr emisji 530/25 w celu wykrycia fluorescencji GFP. Zapisz liczbę ryb pozytywnych w stosunku do całkowitej liczby ryb poddanych wstrzyknięciu.
2. Ponownie badaj ryby co 14 dni przez maksymalnie 90 dni i zapisuj liczbę ryb pozytywnych. Gdy ryba z potwierdzonym nowotworem stanie się półmartwa, uśmierć zwierzę poprzez przedawkowanie Tricane-S.
3. Wprowadź wyniki do tabeli, zgodnie z Rysunkiem 3D. Prześlij dane do internetowego oprogramowania statystycznego ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) pod adresem http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html¹⁵, które wykorzystuje częstotliwość występowania zwierząt pozytywnych i negatywnych pod kątem nowotworu przy każdej dawce transplantacji, aby określić częstotliwość samoodnawiających się komórek białaczki w pierwotnej T-ALL.

6. Reprezentatywne wyniki:

Mikroiniekcja DNA do zarodków ryb syngenicznych często skutkuje niskim wskaźnikiem przeżywalności iniekcyjnych zarodków, przy czym <60% zarodków przeżyło przez 24 godziny. Dodatkowo, przeżywalność wstrzykniętych syngeneicznych ryb w okresie rozwoju larwalnego jest zazwyczaj niska, przy czym często <20% przeżywalności przez 28 dni. Dlatego ważne jest wstrzyknięcie dużej liczby embrionów, aby stworzyć ryby transgeniczne, u których rozwinie się T-ALL.

W ramach przykładu embriony szczepu CG1 zostały wstrzyknięte z rag2::cMyc+rag2::GFP. Transgeny współsegregują w rozwijającym się embrionie, w taki sposób, że każda komórka wykazująca ekspresję GFP będzie również wykaziwać ekspresję cMyc. Larwy przesiewano w celu wykrycia pierwotnej T-ALL po 28 dniach (Rysunek 1). Wcześniejsze prace wykazały, że około 5% wstrzykniętych ryb będzie posiadać limfocyty T dodatnie pod kątem GFP w grasicy (Rysunek 1), a 10% tych ryb rozwinie białaczkę w miarę transformacji limfocytów T¹¹. Chociaż niewielka część danio pręgowanych może wykazywać bardziej zaawansowaną białaczkę, którą bardzo łatwo wykryć w 28. dniu, większość będzie posiadać jedynie GFP-dodatnią grasicę (Rysunek 1), dlatego larwy należy badać indywidualnie przy dużym powiększeniu, aby upewnić się, że wyselekcjonowano wszystkie dodatnie ryby. GFP-dodatnie komórki T-ALL zajmą >50% organizmu między 45. a 70. dniem.

W przedstawionym przykładzie rybki daniozgoń zostały uśmiercone w 65. dniu życia, a komórki białaczki wyizolowano i poddano sortowaniu FACS w celu przeprowadzenia transplantacji z ograniczonym rozcieńczeniem. Pojedyncze komórki wykazujące negatywny wynik dla jodku propidyny i pozytywny dla GFP (Ryc. 2) zostały posortowane do płytki 96-dołkowej. Przeprowadzono ponowną analizę 10 0 posortowanych komórek w celu oceny żywotności (optymalnie >95%) i czystości (optymalnie >92%, Ryc. 2). Przeszczepione T-ALL zazwyczaj pojawiają się przed 28. dniem, jednak niektóre guzy mogą rozwijać się ponad 60 dni. W tym przykładzie w 28. dniu zaobserwowano guzy we wczesnym stadium jako obszary komórek GFP-dodatnich w pobliżu miejsca iniekcji (Ryc. 3B), podczas gdy niektóre T-ALL były w bardziej zaawansowanym stadium, rozprzestrzeniając się na całą jamę otrzewną (Ryc. 3C). Dane z testów transplantacji komórek z ograniczonym rozcieńczeniem dla trzech różnych pierwotnych T-ALL przedstawiono na Ryc. 3D. W tych eksperymentach dokonano transplantacji ponad 20 zwierząt, co może być łatwo wykonane przez jedną osobę w ciągu kilku godzin. Analiza danych z użyciem oprogramowania ELDA wykazała, że średnio 1 na 135 komórek T-ALL była samoodnawiającą się komórką propagującą białaczkę (Ryc. 3E).

Rysunek 1. Larwy danio przebrzuchałego wstrzyknięte na etapie jednego komórki za pomocą rag::-cMyc+rag::-eGFP poddano badaniu przesiewowemu pod kątem pierwotnego wzrostu białaczki 28 dni po wstrzyknięciu. Ryba (*) wykazywała obecność limfocytów T GFP-dodatnich w grasicy; u tej ryby rozwinie się T-ALL w miarę sukcesywnej transformacji limfocytów T. Etap ten jest bardzo powszechny w 28. dniu. U jednej ryby (**) stwierdzono zaawansowaną T-ALL, która rozprzestrzeniła się do tkanek miękkich. Pozostałe dwie ryby były negatywne pod kątem wzrostu guza. Zdjęcie wykonano przy 16-krotnym powiększeniu.

Rycina 2. Komórki T-ALL znakowane fluorescencyjnie zostały wyizolowane metodą sortowania z chorych zwierząt i wykorzystane w teście transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym. W pierwszej kolejności wyznaczono bramkę w celu wyselekcjonowania pojedynczych komórek (lewy górny panel), następnie wyselekcjonowano komórki negatywne pod względem barwienia jodkiem propidyny (lewy środkowy panel). Na koniec wyznaczono bramkę, aby do sortowania wyselekcjonować wyłącznie leukemiczne komórki GFP-dodatnie (lewy dolny panel). Posortowane komórki należy poddać ponownej analizie w celu oceny żywotności i czystości przed transplantacją (panele po prawej).

Rysunek 3. Rybek danio sprawdzono pod kątem wzrostu białaczki 28 dni po transplantacji. Ryby są albo wolne od nowotworu (A), albo mają niewielki guz rosnący w miejscu wstrzyknięcia (B), albo wykazują postępującą białaczkę (C). Obrazy wykonano przy powiększeniu 7X. Odnotowano całkowitą liczbę ryb z dodatnim wynikiem w kierunku białaczki w stosunku do całkowitej liczby ryb poddanych transplantacji dla każdego rozcieńczenia, jak przedstawiono w (D). Dane wprowadzono do internetowego programu ELDA w celu obliczenia liczby samoodnawiających się komórek białaczkowych oraz górnej i dolnej 95% granicy przedziału ufności (E).

Dyskusja

Kluczową zaletą wykorzystania danio przebrzosionego w badaniach nad rakiem jest możliwość użycia dużej liczby zwierząt przy stosunkowo niskich kosztach. Jest to szczególnie istotne w testach transplantacji komórek z ograniczającym rozcieńczeniem, w których stosunek liczby zwierząt z przeszczepionymi komórkami, u których rozwinęły się guzy, do całkowitej liczby zwierząt z przeszczepem służy do wyznaczenia częstotliwości występowania komórek inicjujących nowotwór. W przedstawionej tutaj metodzie w każdym teście wykorzystuje się ponad 70 zwierząt biorców, co pozwala na dokładną ocenę liczby komórek propagujących nowotwór. Zarówno liczba wykorzystanych zwierząt, jak i dawki przeszczepianych komórek nowotworowych powinny zostać zoptymalizowane dla danego modelu raka; na przykład, jeśli wstępne eksperymenty wykażą, że komórki inicjujące nowotwór są rzadkie, przydatne dawki transplantacyjne mogą wynosić 100 000, 50 000, 10 000 i 1 000 komórek na jeden przeszczep.

Syngeniczne szczepy rybek danioy są użyteczne w analizie rozcieńczeń ograniczających. Jednak szczepy te nie są jeszcze powszechnie stosowane we wszystkich laboratoriach, a niektóre modele nowotworowe u danioy istnieją wyłącznie u ryb allogenicznych. Transplantacje komórek w analizie rozcieńczeń ograniczających można przeprowadzać u szczepów typu dzikiego po ablacji układu odpornościowego, choć częstotliwość komórek zdolnych do samoodnowy może zostać obliczona jako 10–100 razy wyższa niż w przypadku użycia syngenicznych rybek danioy⁸. Należy zauważyć, że w przypadku transplantacji do naświetlanych biorców niedopasowanych immunologicznie należy zastosować większe dawki komórek, ponieważ część komórek nowotworowych nie przeżyje transplantacji do obcego mikrośrodowiska. Ponadto wiele nowotworów zacznie regresować po 21 dniach, gdy układ odpornościowy zwierzęcia biorcy powróci do normy, dlatego zwierzęta należy badać pod kątem wzrostu guza co 7 dni po transplantacji.

Metody przedstawione w niniejszym opracowaniu nadają się do zastosowania w dowolnym modelu raka u rybek zebrafish i do tej pory były wykorzystywane do określania częstotliwości występowania komórek inicjujących guz zarówno w ostrej białaczkowatości limfoblastycznej komórek T⁸, jak i w modelu guza litego – rabdomyosarcoma¹⁶. Guzy te zostały oznakowane fluorescencyjnie poprzez kooperacyjne wstrzyknięcie do embrionów zarówno onkogenu, jak i markera fluorescencyjnego; ponieważ DNA segreguje się wspólnie, każda komórka wykazująca ekspresję onkogenu będzie również wykazywać ekspresję białka fluorescencyjnego¹⁷. Choć zaleca się stosowanie fluorescencji, ponieważ ułatwia ona śledzenie wzrostu guza bez konieczności uśmiercania zwierzęcia i zapewnia prosty sposób izolacji komórek nowotworowych za pomocą FACS, możliwe jest również znakowanie komórek guza przeciwciałami przeciwko markerom specyficznym dla nowotworu w celu ułatwienia ich oczyszczania, przy czym barwienie przeciwciałami u rybek zebrafish może wymagać optymalizacji.

Wreszcie, po określeniu częstości występowania komórek propagujących guz dla danego typu nowotworu, możliwe jest wykorzystanie tych testów do zidentyfikowania mechanizmów regulujących ich częstotliwość komórkową. Na przykład pierwotne komórki nowotworowe można traktować inhibitorami specyficznymi dla danej ścieżki przed transplantacją z rozcieńczeniem ograniczającym, lub można podawać leki samym transplantowanym rybom. Dodatkowo można manipulować genetyką samych guzów, wstrzykując rybie w stadium jednej komórki interesujący gen, tak aby powstałe guzy pierwotne nadmiernie go ekspresowały. W takich eksperymentach każdy wpływ na częstotliwość komórek samoodnawiających się zostanie zaobserwowany w testach z rozcieńczeniem ograniczającym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
enzym restrykcyjny NotI	New England Biolabs	R0189
Fenol:Chloroform	EMD Millipore	6805-OP
5M KCl	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
marker DNA o szerokim zakresie (High Range DNA ladder)	Fermentas	R0621
Syngeneiczne danio pręgowane		Bibliografia6-8
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	16000-036
Jodek propidyny	Sigma-Aldrich	P4864
Mikrostrzykawka 26G/2"	Hamilton Co	80366
Sito do komórek z siatką 40μm	BD Biosciences	352340