Artykuł metodologiczny

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

29.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2792

⸱

1 kwietnia 2011

 , 
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Streszczenie

Przerzuty złośliwych komórek wymagają degradacji błony podstawnej, przytwierdzenia komórek nowotworowych do śródbłonka naczyniowego, cofnięcia połączeń śródbłonkowe oraz wreszcie inwazji i migracji komórek nowotworowych przez warstwę śródbłonka, aby przedostać się do krwiobiegu, który służy jako środek transportu do odległych miejsc w organizmie gospodarza1-3. Po dostaniu się do układu krwionośnego komórki nowotworowe przylegają do ścian naczyń kapilarnych i przenikają do otaczających tkanek, tworząc guzy przerzutowe4,5. Różne komponenty interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami śródbłonka można odtworzyć in vitro, poddając monowarstwę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępnej (HUVEC) działaniu komórek nowotworowych. Badania przeprowadzone za pomocą mikroskopii elektronowej i fazokontrastowej sugerują, że in vitro sekwencja zdarzeń dość wiernie oddaje proces przerzutowania in vivo6. W niniejszej pracy opisujemy technikę opartą na impedancji elektrycznej, która monitoruje i kwantyfikuje w czasie rzeczywistym inwazję komórek śródbłonka przez złośliwe komórki nowotworowe.

Giaever i Keese jako pierwsi opisali technikę pomiaru fluktuacji impedancji podczas wzrostu populacji komórek na powierzchni elektrod7,8. Instrument xCELLigence, produkowany przez firmę Roche, wykorzystuje podobną technikę do pomiaru zmian impedancji elektrycznej w miarze, gdy komórki przywierają i rozprzestrzeniają się w naczyniu hodowlanym pokrytym złotą matrycą mikroelektrod, która zajmuje około 80% powierzchni dna dołka. Przywieranie i rozprzestrzenianie się komórek na powierzchni elektrod prowadzi do wzrostu impedancji elektrycznej9-12. Impedancję przedstawia się jako bezwymiarowy parametr zwany indeksem komórkowym (cell-index), który jest wprost proporcjonalny do całkowitej powierzchni dołka hodowlanego pokrytej komórkami. W związku z tym indeks komórkowy może być wykorzystany do monitorowania adhezji, rozprzestrzeniania się, morfologii oraz gęstości komórek.

Test inwazyjności opisany w niniejszym artykule opiera się na zmianach impedancji elektrycznej na interfazie elektroda/komórka, gdy populacja komórek złośliwych nacieka monowarstwę HUVEC (Rysunek 1). Rozpad połączeń śródbłonkowych, retrakcja monowarstwy śródbłonka i zastąpienie jej komórkami nowotworowymi prowadzą do znacznych zmian impedancji. Zmiany te korelują bezpośrednio z potencjałem inwazyjnym komórek nowotworowych, tzn. inwazja komórek o wysokiej agresywności prowadzi do dużych zmian impedancji komórkowej i odwrotnie. Technika ta zapewnia dwukrotną przewagę nad istniejącymi metodami pomiaru inwazyjności, takimi jak testy w komorze Boydena czy testy z Matrigel: 1) oddziaływanie między komórkami śródbłonka a komórkami nowotworowymi dokładniej odwzorowuje proces in vivo, a 2) dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym i są łatwiejsze do kwantyfikacji, w przeciwieństwie do analizy punktu końcowego stosowanej w innych metodach.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach sterylnych w komorze do hodowli tkanek.
  2. Stację xCELLigence umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.
  3. Należy użyć komórek HUVEC o niskim numerze pasażu, najlepiej nieprzekraczającym pasażu 6. Należy również upewnić się, że w momencie zbioru konfluencja komórek nie przekracza 75%.
  4. Komórki HUVEC hodowane są w pożywce EGM-2 przygotowanej z zestawu EGM-2 bullet kit (Lonza Biosciences) zawierającego czynniki wzrostu, suplementy oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej.
  5. Wszelkie ślady trypsyny należy usunąć z zawiesin komórkowych poprzez wirowanie komórek z prędkością 200xg, jednorazowe przemycie PBS i ponowne zawieszenie ich do wskazanych gęstości komórkowych.
  6. Płytkę xCELLigence E-plate 16 pokrywa się 0,1% żelatyną przez 1 godzinę w 37°C lub przez noc w 4°C. Płytkę przemywa się PBS i dodaje 100μL przygotowanej pożywki EGM-2. W systemie xCELLigence wykonuje się pomiar tła w celu zmierzenia impedancji bazowej w nieobecności komórek.

2. Tworzenie monowarstwy HUVEC

  1. Zbiór subkonfluentnych komórek HUVEC z kolby za pomocą trypsynizacji. Komórki zawiesić ponownie w zrekonstytuowanym medium EGM-2 do końcowego zagęszczenia 2.5 x 105 komórek/ml.
  2. Do każdego dołka skalibrowanej płyty E-plate zawierającej 100μL medium EGM-2 dodać 100μL zawiesiny komórek HUVEC (2.5 x 104 komórek HUVEC).
  3. Bezzwłocznie umieścić płytę E-Plate w urządzeniu xCELLigence.
  4. Zaprogramować oprogramowanie xCELLigence tak, aby pomiary impedancji były wykonywane w odstępach 10-minutowych.
  5. Inkubować komórki śródbłonka przez 18-21 godzin, aż utworzą monowarstwę, co objawi się spłaszczeniem indeksu komórkowego (Rysunek 2).

3. Dodanie komórek naciekających i normalizacja danych.

  1. Po uformowaniu stabilnej monowarstwy HUVEC, zebrać komórki nowotworowe poprzez trypsynizację i resuspender do końcowego zagęszczenia 1 x 105 cells/ml w pożywce stosowanej do hodowli komórek nowotworowych (takiej jak RPMI lub DMEM zawierającej 10% FBS)
  2. Wstrzymać odczyty impedancji w oprogramowaniu xCELLigence i wyjąć E-Plate ze stacji.
  3. Usunąć pożywkę EGM-2 poprzez aspirację. Dodać 100μL zawiesiny komórek nowotworowych zawierającej 1 x 104 cells. Zazwyczaj dla tego testu najlepiej sprawdza się stosunek wysianych komórek nowotworowych do komórek śródbłonka wynoszący 1:2.5. Stosunek ten można jednak zoptymalizować dla poszczególnych linii komórkowych.
  4. Umieścić E-plate w systemie xCELLigence w inkubatorze i kontynuować odczyty impedancji w odstępach 10-minutowych.
  5. Inwazję można monitorować w czasie rzeczywistym przez kolejne 6-12 godzin jako spadek indeksu komórkowego wynikający z retrakcji połączeń śródbłonkowych i penetracji przez naciekające komórki nowotworowe.
  6. Znormalizować wyniki do momentu dodania naciekających komórek nowotworowych. Oprogramowanie xCELLigence umożliwia normalizację do dowolnego punktu czasowego, a wyniki można bezpośrednio wyświetlić w oknie programu.

4. Reprezentatywne wyniki:

Przykład inwazji monowarstwy HUVEC przez komórki przerzutowe i nieprzerzutowe przedstawiono na rysunku 3. K7M2 to przerzutowa linia komórkowa osteosarcoma. Komórki te wykazują wysoką ekspresję białka łączącego cytoszkielet – ezryny, co odpowiada za właściwości inwazyjne tej linii komórkowej13,14. Po wprowadzeniu komórek K7M2 do hodowli HUVEC, w ciągu 6 godzin następuje spadek oporu elektrycznego. Spadek ten reprezentuje inwazję monowarstwy HUVEC przez naciekające komórki nowotworowe. Z kolei linia komórkowa K12 wykazuje znacznie niższą ekspresję ezryny i w konsekwencji jest mniej przerzutowa13. Wprowadzenie komórek K12 do monowarstwy HUVEC skutkuje mniej gwałtownym spadkiem oporu, ponieważ komórki te nie są w stanie przylegać do monowarstwy HUVEC ani przez nią przenikać (rysunek 3).

Test inwazji monowarstwy HUVEC: schemat przedstawiający analizę komórek nowotworowych z wykorzystaniem systemu xCELLigence RTCA.
Rycina 1. Schemat przebiegu procesu inwazji komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe. Komórki HUVEC są wysiewane na płytki E pokryte żelatyną i pozostawione do utworzenia konfluentnej monowarstwy. Po uformowaniu się monowarstwy dodawane są komórki złośliwe, a inwazja jest monitorowana w czasie rzeczywistym poprzez zmiany indeksu komórkowego wynikające z inwazji w monowarstwę śródbłonka.

Wykres tworzenia monowarstwy HUVEC; indeks komórkowy w funkcji czasu, analiza wzorca wzrostu komórek.
Rysunek 2. Tworzenie monowarstwy HUVEC. Zmiany indeksu komórkowego podczas przylegania i rozprzestrzeniania się komórek HUVEC na pokrytych żelatyną złotych elektrodach. Utworzenie zlewnej monowarstwy jest reprezentowane przez stabilizację indeksu komórkowego po 18 godzinach.

Wykres dynamiki inwazji; K7M2, K12 w komórkach HUVEC; indeks komórkowy w funkcji czasu, analiza danych porównawczych.
Rycina 3. Inwazja komórek HUVEC przez komórki osteosarcoma K7M2 i K12. Gwałtowny spadek indeksu komórkowego następuje w ciągu kilku godzin od wprowadzenia wysoko metastatycznych komórek K7M2. Z kolei komórki K12 wykazują mniejszy potencjał metastatyczny i nie są w stanie przenikać przez monowarstwę śródbłonka tak efektywnie jak komórki K7M2. Przejawia się to mniej gwałtownym spadkiem indeksu komórkowego w przypadku wystawienia monowarstwy HUVEC na działanie komórek K12. Kontrola reprezentuje impedancję monowarstwy HUVEC w obecności komórek nowotworowych. Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach.

Dyskusja

Test inwazji komórek HUVEC w czasie rzeczywistym to prosta, a zarazem potężna metoda monitorowania inwazji. Dostarcza ona wyników w czasie rzeczywistym, co stanowi istotną przewagę nad innymi tradycyjnymi technikami opierającymi się na analizie punktu końcowego. Test ten można modyfikować w celu badania leków, przeciwciał, ligandów i białek jako inhibitorów lub stymulatorów przerzutowania. Można również ocenić wpływ różnych czynników na interakcje typu cross-talk między komórkami śródbłonka a komórkami nowotworowymi. Podczas wprowadzania egzogennych czynników, takich jak czynniki wzrostu i leki, do pożywki hodowlanej, należy upewnić się, że nie wpływają one na integralność monowarstwy HUVEC. Przerwanie ciągłości monowarstwy HUVEC można sprawdzić, wprowadzając czynnik egzogenny w obecności samych komórek HUVEC (bez komórek inwazyjnych) i upewniając się, że indeks komórkowy nie uległ zmianie. W związku z tym w projekcie doświadczalnym należy uwzględnić odpowiednie kontrole.

Różne linie komórkowe wykazują odmienne krzywe indeksu komórkowego podczas tworzenia zgodnej warstwy jednowarstwowej. Kształt krzywej, jak również osiągnięty maksymalny indeks komórkowy, są specyficzne dla danego typu komórek. Komórki HUVEC wykazują charakterystyczne przejściowe spłaszczenie indeksu komórkowego 4–6 godzin po wysianiu, po czym następuje ponowna stabilizacja przy wyższym indeksie komórkowym po 16–18 godzinach. Dlatego istotne jest, aby pozwolić komórkom na utworzenie zgodnej warstwy jednowarstwowej przez co najmniej 18 godzin przed dodaniem komórek nowotworowych.

Ponieważ indeks komórkowy zależy od środowiska jonowego na styku elektroda/komórka, na jego wartość – oprócz powierzchni dna studzienki zajętej przez komórki – wpływają różne czynniki, takie jak morfologia komórek oraz jakość adhezji międzykomórkowych. Zatem spadek indeksu komórkowego, który następuje podczas inwazji komórek nowotworowych, jest funkcją kilku czynników, w tym retrakcji połączeń śródbłonkowych i następującej po niej inwazji komórek nowotworowych.

Instrument xCELLigence jest produkowany w trzech różnych konfiguracjach: real time cell analyzer (RTCA) SP, RTCA MP oraz RTCA DP. Instrument RTCA SP mieści jedną płytkę E-plate z 96 dołkami, natomiast instrument RTCA MP może pomieścić do sześciu płytek E-plate z 96 dołkami jednocześnie. Umożliwia to wysokoprzepustowy screening leków i związków chemicznych. Eksperymenty w niniejszym artykule zostały wykonane przy użyciu instrumentu RTCA DP, który może pomieścić trzy płytki E-plate z 16 dołkami. Każda stacja trzymająca płytkę E-plate może być obsługiwana niezależnie, co pozwala wielu użytkownikom na jednoczesne przeprowadzanie eksperymentów. Instrument RTCA DP może być również wykorzystywany do badania migracji z użyciem płytek CIM. Są to płytki z 16 dołkami z komorami górną i dolną, oddzielonymi membraną z politereftalanu etylenu (PET) o średnicy porów 8um. Czujniki elektroniczne znajdują się pod porowatą membraną komory górnej. Komora dolna służy jako rezerwuar chemoatraktanta dla komórek znajdujących się w komorze górnej. Jednak istotną zaletą testu inwazji HUVEC w porównaniu z płytkami CIM jest to, że inwazja komórek nowotworowych w pierwszym przypadku nie jest ograniczona rozmiarem porów, ponieważ inwazja komórek śródbłonka zależy od interakcji (cross-talk) między komórkami nowotworowymi a śródbłonka.

Test inwazji HUVEC można przeprowadzić również na urządzeniu ECIS Z, produkowanym przez Applied Biophysics (Troy, NY). Urządzenie ECIS Z wykorzystuje technologię podobną do urządzenia xCELLigence, z różnicami w konfiguracji macierzy i elektrod. Z sukcesem przeprowadziliśmy testy inwazji HUVEC przy użyciu 8-dołkowych macierzy ECIS. Należy zauważyć, że powierzchnia dna dołka w macierzach ECIS jest większa, co wymaga wysiania większej liczby komórek śródbłonka i komórek nowotworowych: odpowiednio 2.5 x 105 oraz 1 x 105 komórek.

Oświadczenia

Koszty publikacji niniejszego manuskryptu zostały uprzejmie sfinansowane przez Roche Applied Science.

Podziękowania

Praca ta została hojnie wsparta funduszami z Children's Cancer Foundation (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) oraz NIH (R01CA108641).

Pragniemy podziękować dr. Antona Wellsteina oraz członkom jego laboratorium za podzielenie się doświadczeniem i pomoc w optymalizacji przedstawionych metod.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
stacja xCELLigence RTCA DPfigure-materials-1 Roche Group05469759001
jednostka sterująca RTCAfigure-materials-2 Roche Group05454417001Laptop z preinstalowanym oprogramowaniem RTCA
E-Plate 16figure-materials-3 Roche Group05469830001
komórki HUVECLonza Inc.CC-2517
pożywka EGM-2Lonza Inc.CC-3156
zestaw EGM-2 bullet kitLonza Inc.CC-4176
0.1% żelatyna w sterylnym H2OEMD MilliporeMCPROTO045

Bibliografia

  1. Klein, C. A. Cancer. The metastasis cascade. Science. 321, 1785-1787 (2008).
  2. Chiang, A. C., Massague, J. Molecular basis of metastasis. N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).
  3. Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis. J Pathol. 190, 310-329 (2000).
  4. Bacac, M., Stamenkovic, I. Metastatic cancer cell. Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).
  5. Christofori, G. New signals from the invasive front. Nature. 441, 444-450 (2006).
  6. Kramer, R. H., Nicolson, G. L. Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).
  7. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).
  9. Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).
  10. Whipple, R. A. Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement. Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).
  11. Boyd, J. M. A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals. Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).
  12. Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).
  13. Ren, L. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene. 28, 792-802 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika impedancji elektrycznejinwazja kom rek nowotworowychmonitorowanie w czasie rzeczywistymhodowla HUVECinwazja kom rek nowotworowychpomiar indeksu kom rkowegorozpad po cze r db onkowychin vitro model przerzutowaniatest oparty na impedancji

Powiązane artykuły