Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Podsumowanie

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Streszczenie

Ssaczy organ Cortiego stanowi ściśle uporządkowaną komórkową mozaikę mechanosensorycznych komórek rzęskowych oraz niesensorycznych komórek podporowych
(przegląd w ^1,2). Wizualizacja tej komórkowej mozaiki często wymaga wykonania przekroju poprzecznego organu Cortiego. W szczególności niesensoryczne komórki filarowe i komórki Deitera, których jądra znajdują się bazalnie względem komórek rzęskowych, nie mogą być zwizualizowane bez przeprowadzenia przekroju poprzecznego organu Cortiego. Jednakże delikatna cytoarchitektura ssaczego organu Cortiego, w tym cienkie wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych i komórek Deitera, jest trudna do zachowania przy użyciu rutynowych procedur histologicznych, takich jak sekcjonowanie w parafinie i kriotomia, które są kompatybilne ze standardowymi technikami barwienia immunohistochemicznego.

W niniejszym opracowaniu opisuję prostą i niezawodną procedurę składającą się z cięcia ślimaka w wibratomie, barwienia immunohistochemicznego tych przekrojów w preparatach całych (whole mount), a następnie zastosowania mikroskopii konfokalnej. Procedura ta była szeroko stosowana do analiz immunohistochemicznych wielu organów, w tym pąków kończyn myszy, jelit danio pręgowanego, wątroby, trzustki i serca (wybrane przykłady w ^3-6). Ponadto procedura ta okazała się skuteczna zarówno w obrazowaniu, jak i w kwantyfikacji liczby komórek filarowych w mutacyjnych i kontrolnych narządach Cortiego u zarodków oraz dorosłych myszy ⁷. Metoda ta nie jest jednak obecnie powszechnie stosowana do badania ssaczego narządu Cortiego. Opisano potencjał tej procedury w zakresie lepszego zachowania subtelnej cytoarchitektury dorosłego narządu Cortiego oraz możliwości kwantyfikacji różnych typów komórek.

Protokół

1. Izolacja i fiksacja ucha wewnętrznego

1. W celu analizy wzorców komórkowych w organie Cortiego, przeprowadzić eutanazję zarodków w odpowiednim stadium rozwoju lub osobników dorosłych.
2. Wypreparować torebkę słuchową zawierającą błonowy ucho wewnętrzne. U myszy można to łatwo wykonać u zarodków od 14,5 dnia embrionalnego (E) i starszych, gdzie E0,5 oznacza dzień stwierdzenia obecności czopu pochwowego. Wypreparowanie torebki słuchowej rozpoczyna się od odcięcia głowy i otwarcia czaszki w linii środkowej. Usunąć mózg, aby odsłonić każde ucho (Rys. 1A). Ucha wewnętrzne można wyjąć w całości za pomocą pęsety (np. Dumont nr 5, Rys. 1B). W przypadku obrazowania organu Cortiego nie jest konieczne staranne usuwanie wszystkich tkanek neuronalnych i łącznych związanych z torebką słuchową.
3. Utrwalić całe ucha wewnętrzne poprzez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie (PFA), delikatnie kołysząc próbkami w temperaturze 4°C przez noc w probówkach NUNC Cryo-tube o pojemności 1,8 ml z nakrętką lub w innym odpowiednio dobranym pojemniku. Roztwór PFA należy przygotować na świeżo w ddH₂O, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.
4. Następnego dnia wypłukać utrwalacz, zmieniając trzykrotnie 1X roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS). Tkankę można przechowywać w sterylnym 1X PBS od kilku dni do kilku miesięcy aż do momentu rozpoczęcia dalszego przetwarzania. W przypadku tkanek od osobników dorosłych, przeprowadzić dekalcyfikację w 10% EDTA (0,27 M) w temperaturze 4°C przez 5 dni, a następnie przepłukać i przechowywać w 1X PBS.

2. Wycinanie przekrojów w wibrotomie

1. Przygotować 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia w 1X PBS. Dodać agarozę o niskiej temperaturze topnienia do 1X PBS i podgrzewać w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Należy uważać, aby roztwór nie wykipiał – okresowo wyjmować go z mikrofalówki i delikatnie mieszać ruchem okrężnym. Przechowywać roztwór w kąpieli wodnej o temperaturze 55°C do momentu użycia.
2. Za pomocą pęsety wyjąć ucho wewnętrzne z roztworu 1X PBS i umieścić je na dnie formy do zatapiania typu Peel-A-Way. Odpipetować nadmiar 1X PBS z formy. Wypełnić formę obfitą ilością płynnej 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby całkowicie przykryć tkankę (Rys. 2A).
3. Ustawić ucho wewnętrzne do sekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie. Dobre przekroje poprzeczne narządu Cortiego uzyskiwałem poprzez przybliżenie pozycji torebki słuchowej tak, jak gdyby pozostała ona in situ w głowie, a następnie sekcjonując w płaszczyźnie poprzecznej. W przypadku embrionów E14.5 oraz osobników dorosłych, ustawić ucho wewnętrzne tak, aby było widoczne z boku, z widocznym bocznym kanałem półkolistym (Rys. 2B). Ustawić ucho wewnętrzne pod kątem, tak aby linia tworzona przez tylną stronę torebki słuchowej znajdowała się pod kątem około 45 stopni względem zamierzonej płaszczyzny sekcjonowania (Rys. 2A, B). Gdy torebka słuchowa jest ustawiona tak, że jej część grzbietowa znajduje się na górze, podstawowy zwój ślimaka powinien znajdować się na dole (grot strzałki, Rys. 2B), a przedni kanał półkolisty (asc) na górze (Rys. 2B).
4. Agaroza stężeje w RT w ciągu 30 min. Przenieść formy Peel-Away z zatopioną tkanką do temperatury 4°C do czasu sekcjonowania. Jeśli sekcjonowanie zostanie odłożone na następny dzień, dodać 1X PBS, aby przykryć agarozę w formie, i przechowywać w pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi nasączonymi 1X PBS.
5. Zdjąć plastikową formę. Za pomocą żyletki wyciąć blok agarowy zawierający tkankę ucha wewnętrznego. Należy zadbać o to, aby płaszczyzna sekcji była prosta i równoległa do przeciwległej strony bloku, która będzie powierzchnią, na której blok agarowy zostanie przyklejony. Ponieważ agaroza nie infiltruje tkanki, nie należy usuwać zbyt dużo agarozy z okolic tkanki, aby zapewnić jej odpowiednie podparcie.
6. Użyć superglue, aby przymocować blok do powierzchni tnącej.
7. Wykonać sekcje o grubości od 40 do 100 μm za pomocą wibratomu. Przechowywać sekcje w naczyniu hodowlanym wypełnionym 1X PBS z 0.1% TritonX-100. Reprezentacyjny przekrój przez spiralę ślimaka przedstawiono na Rys. 2C.
8. Za pomocą pęsety oddzielić agarozę od tkanki. Agaroza nie wnika w tkankę, lecz jedynie przylega do zewnętrznej powierzchni ucha wewnętrznego.
9. W razie potrzeby połączyć sekcje tkanek wolne od agarozy, używając pipety z szerokim otworem, aby zapobiec nadmiernemu ścinaniu tkanki. Przy wykonywaniu wielokrotnych barwień przeciwciałami na wielu różnych tkankach, sekcje można zorganizować w 16- lub 24-dołkowej płytce hodowlanej.

3. Barwienie przeciwciałami skrawków z wibrotomu

Przejdź do barwienia przeciwciałami. Przetwarzaj przekroje w całości, swobodnie zawieszone w roztworze. Poniżej znajduje się przykładowy protokół barwienia przeciwciałami dla markera S100 komórek filarowych narządu Cortiego, jednak protokół ten można zastosować dla dowolnego przeciwciała. Wszystkie etapy płukania przeprowadza się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. W wielodołkowej płytce do hodowli tkankowej inkubować swobodnie pływające skrawki w PBT (1X PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Triton X-100) przez 30 min, delikatnie kołysząc naczyniem.
2. Odessać zużyty roztwór i zablokować swobodnie pływające skrawki w PBT + normalnym surowicą kozą (50 μl NGS/ 1 ml PBT) przez 30 min, delikatnie kołysząc naczyniem.
3. Odessać zużyty roztwór i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBT + NGS (rozcieńczenie S100 w PBT+NGS 1:200). Inkubować przez noc w temperaturze 4°C, delikatnie kołysząc naczyniem.
4. Odessać roztwór przeciwciał pierwszorzędowych. Przemyć 3X przez 5 min za pomocą PBT, a następnie 4X przez 30 min za pomocą PBT.
5. Blokować w PBT + NGS przez 30 min.
6. Inkubować z fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem wtórnym (produkowanym u kozy) rozcieńczonym w PBT + NGS. Inkubować przez noc w 4°C lub przez kilka godzin w temperaturze pokojowej (RT), delikatnie kołysząc naczyniem.
7. Odessać roztwór przeciwciał wtórnych. Przemyć 3X przez 5 min, a następnie 4X przez 30 min za pomocą PBT.
8. Odessać ostatnią porcję PBT i zastąpić ją odpowiednim wodnym medium montażowym zawierającym barwnik kontrastowy do jąder komórkowych.

4. Montowanie skrawków na szkiełkach i mikroskopia konfokalna

Aby zapobiec zmiażdżeniu grubych przekrojów przez szkiełko cover-slip, podczas montowania poszczególnych sekcji między szkiełkiem przedmiotowym a cover-slipem należy umieścić dystans. Poniżej przedstawiono dwie alternatywne metody montowania grubych przekrojów wykonanych za pomocą wibratomu:

1. 1. Dystans można stworzyć, nakładając pierścień smaru próżniowego w kwadrat wokół skrawka tkanki. Dzięki temu podczas nakładania szkiełka cover-slip jego krawędzie zostaną uszczelnione smarem próżniowym. Docisnąć krawędzie szkiełka kciukiem, aby mocno przylegały do preparatu. Jeśli smar próżniowy został nałożony starannie i jednorodnie wokół wszystkich krawędzi szkiełka, preparat będzie wystarczająco szczelny do użycia w konfokalnym mikroskopie odwróconym.
   2. Alternatywnie dystans można stworzyć, używając żywicy do chromatografii agarozowej o znanej wielkości oczek (np. Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad). Nanieść pipetą 1 μl żywicy na preparat mikroskopowy w każdym z czterech narożników, w których zostanie umieszczone szkiełko cover-slip. Nanieść pipetą jeden skrawek tkanki oraz medium montażowe na środek czterech kropli żywicy. Przykryć szkiełkiem cover-slip. W przypadku użycia konfokalnego mikroskopu odwróconego należy uszczelnić szkiełko cover-slip na preparacie mikroskopowym za pomocą laku do paznokci.
2. Wykonać przekroje optyczne barwionych skrawków z wibrotomu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby ilościowo określić różne typy komórek w obrębie narządu Cortiego, należy zebrać stos z-stack z określonym rozmiarem kroku (między 1.5 a 3 μm). Przekroje powinny zostać przeciwbarwione barwnikiem jądrowym (krok 3.8). Obrazy można analizować na dowolnym ekranie komputera po zebraniu obrazów konfokalnych. Komórki można liczyć ręcznie, obserwując pojawianie się i znikanie jąder podczas sekwencyjnego przeglądania obrazów w stosie z-stack.

5. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny stos obrazów konfokalnych (z-stack) wykonany na przekroju z wibrotomu, barwionym na białko S100, które występuje w komórkach filarowych i komórkach Deitera, z kontrastowaniem barwnikiem jądrowym (Rys. 3A-F). Każdy panel przedstawia obraz konfokalny wykonany w odstępach 3 μm, przy czym panel A to obraz uzyskany najbliżej powierzchni przekroju z wibrotomu, a panel F to obraz uzyskany najgłębiej wewnątrz przekroju. Morfologia narządu Cortiego wydaje się być w minimalnym stopniu zaburzona. W szczególności wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych nie są przerwane. Poprzez obserwację pojawiania się i znikania jąder komórek filarowych w stosie obrazów (Rys. 3A do 3F), można policzyć liczbę zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórek filarowych (patrz numeracja, Rys. 3A - F). Ze względu na niewielką liczbę komórek każdego typu na pojedynczym obrazie konfokalnym, podejście to może być wykorzystane do policzenia większości typów komórek w obrębie narządu Cortiego.

Rycina 1. Nienaruszone, 15-tygodniowe dorosłe ucha wewnętrzne zamknięte w torebce błędnika. (A) Prawa torebka błędnika (zaznaczona nawiasem) w obrębie czaszki, widziana z perspektywy wnętrza głowy, po usunięciu mózgu. Strona przednia znajduje się po prawej. (B) Nienaruszone, 15-tygodniowe ucha wewnętrzne po wypreparowaniu z czaszki. Widoczna jest powierzchnia boczna lewego ucha wewnętrznego oraz powierzchnia przyśrodkowa prawego ucha wewnętrznego. Etykiety wskazują położenie przedniego kanału półkolistego (asc), ślimaka (co) i okna owalnego (ow).

Rysunek 2. (A) Całe ucho wewnętrzne dorosłego osobnika w wieku 15 tygodni, zatopione w agarozie w centrum formy Peel-Away. Wskazano zamierzoną płaszczyznę przekroju. (B) Powiększony obraz całego ucha wewnętrznego 15-tygodniowego osobnika przed zatopieniem. Część otaczającej kości została usunięta, aby labirynt błoniasty był lepiej widoczny. Wyznaczono przebieg bocznego kanału półkolistego (lsc), przedniego kanału półkolistego (asc) oraz ślimaka (co) (białe linie). Wskazano podstawowy obrót ślimaka (grot strzałki) oraz zamierzoną płaszczyznę przekroju (linia przerywana). (C) Reprezentatywny przekrój poprzeczny przez ślimaka. Na jednym z przekrojów poprzecznych przez przewód ślimaka zaznaczono ramką narząd Cortiego (oC), nawiasem stria vascularis (sv), a strzałką błonę Reissnera (Rm).

Rysunek 3. Organ Cortiego u myszy typu dzikiego w 21. dniu postnatalnym (P21). (A-F) Sekwencyjne serie konfokalne, z krokiem 3 μm, przez organ Cortiego barwiony przeciwciałem S100 w celu wizualizacji komórek filarowych i komórek Deitera. Liczba wewnętrznych i zewnętrznych komórek filarowych od początku do końca serii jest ponumerowana. Skróty: IHC (wewnętrzna komórka rzęskowa), aIHC (sąsiednia wewnętrzna komórka rzęskowa), OHC (zewnętrzna komórka rzęskowa), PC (komórka filarowa), DC (komórka Deitera).

Dyskusja

Procedura krojenia w wibrotomie, a następnie immunohistochemia i obrazowanie konfokalne pozwalają na wizualizację narządu Cortiego przy minimalnym uszkodzeniu tkanki. Wyraźnie widać, że obrazy konfokalne pobrane z wewnętrznych obszarów przekroju wykonanego wibrotomem wykazują doskonałe zachowanie morfologii komórkowej, ograniczone jedynie przez artefakty utrwalania. Obrazy konfokalne wykonane blisko dwóch powierzchni cięcia przekroju wibrotomowego są często nieodróżnialne od obrazów z obszarów wewnętrznych, choć zaobserw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrotom z wibrującym nożem Leica VT1000S	Leica Microsystems
Konfokalny mikroskop skaningowy laserowy Zeiss LSM510	Carl Zeiss, Inc.
Pinceta Student Dumont #5	Fine Science Tools	91150-20
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia UltraPure	Invitrogen	16520-050
Forma do zatapiania Peel-A-Way	Polysciences, Inc.	18986 or 18646A
albumina surowicy bydlęcej	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
Surowica kozia	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 przeciwkrólicze IgG kozie	Invitrogen	A-11036	rozcieńczenie 1:1000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
smar próżniowy	Fisher Scientific	S41718
Żel Affi-Gel Blue	Bio-Rad	153-7301