Krojenie w wibratomie w celu lepszego zachowania cytoarchitektury organu Cortiego ssaków

Podsumowanie

Opisano prostą procedurę krojenia narządu Cortiego za pomocą wibratomu, a następnie przeprowadzenia immunohistochemii i mikroskopii konfokalnej. Procedura ta pozwala na lepsze zachowanie drobnej cytoarchitektury narządu Cortiego u ssaków, a w konsekwencji umożliwia dokładną kwantyfikację typów komórek.

Streszczenie

Ssaczy organ Cortiego stanowi ściśle uporządkowaną komórkową mozaikę mechanosensorycznych komórek rzęskowych oraz niesensorycznych komórek podporowych
(przegląd w ^1,2). Wizualizacja tej komórkowej mozaiki często wymaga wykonania przekroju poprzecznego organu Cortiego. W szczególności niesensoryczne komórki filarowe i komórki Deitera, których jądra znajdują się bazalnie względem komórek rzęskowych, nie mogą być zwizualizowane bez przeprowadzenia przekroju poprzecznego organu Cortiego. Jednakże delikatna cytoarchitektura ssaczego organu Cortiego, w tym cienkie wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych i komórek Deitera, jest trudna do zachowania przy użyciu rutynowych procedur histologicznych, takich jak sekcjonowanie w parafinie i kriotomia, które są kompatybilne ze standardowymi technikami barwienia immunohistochemicznego.

W niniejszym opracowaniu opisuję prostą i niezawodną procedurę składającą się z cięcia ślimaka w wibratomie, barwienia immunohistochemicznego tych przekrojów w preparatach całych (whole mount), a następnie zastosowania mikroskopii konfokalnej. Procedura ta była szeroko stosowana do analiz immunohistochemicznych wielu organów, w tym pąków kończyn myszy, jelit danio pręgowanego, wątroby, trzustki i serca (wybrane przykłady w ^3-6). Ponadto procedura ta okazała się skuteczna zarówno w obrazowaniu, jak i w kwantyfikacji liczby komórek filarowych w mutacyjnych i kontrolnych narządach Cortiego u zarodków oraz dorosłych myszy ⁷. Metoda ta nie jest jednak obecnie powszechnie stosowana do badania ssaczego narządu Cortiego. Opisano potencjał tej procedury w zakresie lepszego zachowania subtelnej cytoarchitektury dorosłego narządu Cortiego oraz możliwości kwantyfikacji różnych typów komórek.

Protokół

1. Izolacja i utrwalenie ucha wewnętrznego

1. Aby przeanalizować wzorce komórkowe w narządzie Cortiego, przeprowadź eutanazję embrionów w odpowiednim stadium rozwoju lub osobników dorosłych.
2. Wypreparuj torebkę słuchową zawierającą błoniastą część ucha wewnętrznego. U myszy można to łatwo przeprowadzić u embrionów od 14,5 dnia embrionalnego (E) i starszych, przyjmując, że E0,5 to dzień stwierdzenia obecności czopa pochwowego. Preparację torebki słuchowej rozpoczyna się od odcięcia głowy i otwarcia czaszki w linii środkowej. Usuń mózg, aby odsłonić oba uszy (Rys. 1A). Ucha wewnętrzne można ostrożnie wyjąć w całości za pomocą pęsety (np. Dumont #5, Rys. 1B). W przypadku obrazowania narządu Cortiego nie jest konieczne dokładne usuwanie wszystkich tkanek neuronalnych i łącznych związanych z torebką słuchową.
3. Utrwal całe ucha wewnętrzne poprzez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie (PFA) przy łagodnym kołysaniu w temperaturze 4°C przez noc, w probówkach NUNC Cryo-tube z nakrętką o pojemności 1,8 ml lub innym odpowiednio dobranym pojemniku. Roztwór PFA należy przygotować na świeżo w ddH₂0, a następnie przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.
4. Następnego dnia wypłucz utrwalacz, trzykrotnie wymieniając 1X fosforan buforowany roztwór soli (PBS). Tkankę można przechowywać w sterylnym 1X PBS od kilku dni do kilku miesięcy aż do rozpoczęcia dalszej obróbki. W przypadku tkanki dorosłych osobników przeprowadź dekalcyfikację w 10% EDTA (0,27 M) w temperaturze 4°C przez 5 dni, a następnie przepłucz i przechowuj w 1X PBS.

2. Wycinanie sekcji w wibratomie

1. Przygotować 4% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (Low Melting Point agarose) w 1X PBS. Dodać agarozę o niskiej temperaturze topnienia do 1X PBS i podgrzewać w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia. Należy uważać, aby roztwór nie wykipiał – okresowo wyjmować go z kuchenki i delikatnie mieszać ruchem wirowym. Roztwór przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 55°C do momentu użycia.
2. Za pomocą pęsety wyjąć ucho wewnętrzne z roztworu 1X PBS i umieścić na dnie formy do zatapiania typu Peel-A-Way. Pipetą usunąć nadmiar 1X PBS z formy. Wypełnić formę obfitą ilością płynnej 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia, tak aby całkowicie przykryła tkankę (Ryc. 2A).
3. Ustawić ucho wewnętrzne do sekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie. Dobre przekroje poprzeczne narządu Cortiego uzyskano poprzez przybliżenie pozycji torebki słuchowej tak, jak gdyby pozostawała ona in situ w głowie, i sekcjonowanie w płaszczyźnie poprzecznej. W przypadku embrionów E14.5 oraz osobników dorosłych ustawić ucho wewnętrzne tak, aby było widoczne od strony bocznej, z widocznym bocznym kanałem półkolistym (Ryc. 2B). Ustawić ucho wewnętrzne pod kątem, tak aby linia tworzona przez tylną stronę torebki słuchowej znajdowała się pod kątem około 45 stopni względem zamierzonej płaszczyzny sekcjonowania (Ryc. 2A, B). Gdy torebka słuchowa jest ustawiona tak, że jej część grzbietowa znajduje się u góry, zwój podstawowy ślimaka powinien znajdować się na dole (grot strzałki, Ryc. 2B), a przedni kanał półkolisty (asc) u góry (Ryc. 2B).
4. Agaroza stężeje w temperaturze pokojowej w ciągu 30 min. Przenieść formy Peel-Away z zatopioną tkanką do temperatury 4°C do momentu sekcjonowania. Jeśli sekcjonowanie zostanie odroczone do następnego dnia, dodać 1X PBS, aby przykryć agarozę w formie, i przechowywać w pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi nasączonymi 1X PBS.
5. Zdjąć plastikową formę. Za pomocą żyletki wyciąć blok agarozy zawierający tkankę ucha wewnętrznego. Należy zadbać o to, aby płaszczyzna sekcji była prosta i równoległa do przeciwległej strony bloku, która będzie powierzchnią, na której blok agarozy zostanie przyklejony. Ponieważ agaroza nie infiltruje tkanki, nie należy usuwać zbyt dużej ilości agarozy z okolic tkanki, aby zapewnić jej odpowiednie podparcie.
6. Użyć superglue, aby przymocować blok do powierzchni tnącej.
7. Wykonować sekcje o grubości od 40 do 100 μm za pomocą wibratomu. Przechowywać skrawki w naczyniu hodowlanym wypełnionym 1X PBS z 0.1% TritonX-100. Reprezentatywny przekrój przez spiralę ślimaka przedstawiono na Ryc. 2C.
8. Za pomocą pęsety oddzielić agarozę od tkanki. Agaroza nie przenika do wnętrza tkanki, a jedynie przylega do zewnętrznej powierzchni ucha wewnętrznego.
9. W razie potrzeby połączyć sekcje tkanki pozbawione agarozy, używając pipety z szerokim otworem, aby zapobiec nadmiernemu ścinaniu tkanki. W przypadku przeprowadzania wielu barwień przeciwciałami na różnych tkankach, skrawki można zorganizować w 16- lub 24-dołkowej płytce hodowlanej.

3. Barwienie przeciwciałami skrawków z wibratomu

Przejdź do barwienia przeciwciałami. Przetwórz przekroje w całości, w formie wolno pływającej w roztworze. Poniżej znajduje się przykładowy protokół barwienia przeciwciałami dla markera S100 komórek filarowych narządu Cortiego, jednak protokół ten można zastosować dla dowolnego przeciwciała. Wszystkie etapy płukania przeprowadza się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. W wielodołkowej płytce do hodowli tkanek inkubować swobodnie pływające przekroje w PBT (1X PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Triton X-100) przez 30 min, delikatnie kołysząc płytką.
2. Odpipetować stary roztwór i blokować swobodnie pływające przekroje w PBT + normalnej surowicy koziej (50 μl NGS/ 1 ml PBT) przez 30 min, delikatnie kołysząc płytką.
3. Odpipetować stary roztwór i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBT + NGS (rozcieńczenie S100 w PBT+NGS 1:200). Inkubować przez noc w temperaturze 4°C, delikatnie kołysząc płytką.
4. Odpipetować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego. Przemyć 3X przez 5 min w PBT, a następnie 4X przez 30 min w PBT.
5. Blokować w PBT + NGS przez 30 min.
6. Inkubować z koniugowanym fluorescencyjnie przeciwciałem wtórnym (pozyskanym z kozy) rozcieńczonym w PBT + NGS. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C lub przez kilka godzin w RT, delikatnie kołysząc płytką.
7. Odpipetować roztwór przeciwciała wtórnego. Przemyć 3X przez 5 min, a następnie 4X przez 30 min w PBT.
8. Odpipetować ostatni roztwór płuczący PBT i zastąpić go odpowiednim wodnym medium montażowym zawierającym barwnik przeciwjądrowy.

4. Montowanie skrawków na szkiełkach i mikroskopia konfokalna

Aby zapobiec zmiażdżeniu grubych skrawków przez szkiełko nakrywkowe, podczas montowania pojedynczych sekcji należy umieścić dystans między szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym. Poniżej przedstawiono dwie alternatywne metody montowania grubych skrawków przygotowanych za pomocą wibratomu:

1. 1. Dystans można utworzyć, nakładając pierścień smaru próżniowego w kwadracie wokół przekroju tkanki. Dzięki temu podczas nakładania szkiełka nakrywki jego krawędzie zostaną uszczelnione smarem próżniowym. Przycisnąć krawędzie szkiełka nakrywki kciukiem, aby mocno przytwierdzić je do preparasu. Jeśli smar próżniowy jest nałożony starannie i równomiernie wokół wszystkich krawędzi szkiełka nakrywki, preparas będzie wystarczająco uszczelniony do użytku w odwróconym mikroskopie konfokalnym.
   2. Alternatywnie dystans można utworzyć, używając żywicy do chromatografii agarozowej o znanej wielkości oczek (np. Affi-Gel Blue Gel, Bio-Rad). Nanieść pipetą 1 μl żywicy na preparas w każdym z czterech rogów, w których zostanie umieszczone szkiełko nakrywkowe. Nanieść pipetą jeden przekrój tkanki oraz medium montażowe na środek między cztery kropki żywicy. Przykryć szkiełkiem nakrywką. W przypadku użycia odwróconego mikroskopu konfokalnego, uszczelnić szkiełko nakrywkowe na preparasie za pomocą lakieru do paznokci.
2. Uzyskać przekroje optyczne z barwionych skrawków z wibrotomu przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Aby przeprowadzić kwantyfikację różnych typów komórek w ślimaku (organum Corti), należy wykonać stos obrazów z (z-stack) z określonym krokiem (między 1.5 a 3 μm). Przekroje powinny zostać przeciwbarwione barwnikiem jądrowym (krok 3.8). Obrazy można analizować na dowolnym ekranie komputera po zebraniu danych konfokalnych. Komórki można zliczać ręcznie, obserwując pojawianie się i znikanie jąder podczas sekwencyjnego przeglądania obrazów w stosie z.

5. Reprezentatywne wyniki:

Reprezentatywny stos obrazów konfokalnych (z-stack) wykonany na przekroju z wibrotomu, wybarwiony pod kątem białka S100, które występuje w komórkach filarowych i komórkach Deitera, oraz przeciwbarwiony barwnikiem jądrowym (Ryc. 3A-F). Każdy panel przedstawia obraz konfokalny wykonany w krokach co 3 μm, przy czym panel A to obraz uzyskany najbliżej powierzchni przekroju z wibrotomu, a panel F to obraz uzyskany najgłębiej wewnątrz przekroju. Morfologia narządu Cortiego wydaje się być w niewielkim stopniu zaburzona. W szczególności wypustki cytoplazmatyczne komórek filarowych nie są przerwane. Poprzez obserwację pojawiania się i znikania jąder komórek filarowych w stosie z (Ryc. 3A do 3F), można policzyć liczbę zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych komórek filarowych (patrz numeracja, Ryc. 3A - F). Ze względu na niewielką liczbę komórek każdego typu na pojedynczym obrazie konfokalnym, podejście to może być wykorzystane do zliczania większości typów komórek w obrębie narządu Cortiego.

Rysunek 1. Nienaruszone ucha wewnętrzne dorosłych osobników w wieku 15 tygodni, zamknięte w torebce słuchowej. (A) Prawa torebka słuchowa (oznaczona nawiasem) osadzona w czaszce, widziana z perspektywy wnętrza głowy po usunięciu mózgu. Strona przednia znajduje się po prawej stronie. (B) Nienaruszone ucha wewnętrzne 15-tygodniowych osobników po wypreparowaniu z czaszki. Widoczna jest powierzchnia boczna lewego ucha wewnętrznego oraz powierzchnia przyśrodkowa prawego ucha wewnętrznego. Etykiety wskazują położenie przedniego kanału półkolistego (asc), ślimaka (co) oraz okna owalnego (ow).

Rycina 2. (A) Całe ucho wewnętrzne od 15-tygodniowego osobnika dorosłego, zatopione w agarozie w centrum formy Peel-Away. Wskazano zamierzoną płaszczyznę cięcia. (B) Zbliżenie całego ucha wewnętrznego 15-tygodniowego osobnika przed zatopieniem. Część otaczającej kości została usunięta, aby labirynt błoniasty był lepiej widoczny. Wyznaczono przebieg bocznego kanału półkolistego (lsc), przedniego kanału półkolistego (asc) oraz ślimaka (co) (białe linie). Wskazano podstawowy zwój ślimaka (grot strzałki) oraz zamierzoną płaszczyznę cięcia (linia przerywana). (C) Reprezentatywny przekrój poprzeczny przez ślimaka. Na jednym z przekrojów przez przewód ślimaka zaznaczono ramką narząd Cortiego (oC), nawiasem stria vascularis (sv) oraz wskazano błonę Reissnera (Rm).

Rysunek 3. Organ Corti u myszy typu dzikiego w dniu P21. (A-F) Sekwencyjne serie konfokalne, z krokiem 3 μm, przez organ Corti barwiony przeciwciałem przeciwko S100 w celu wizualizacji komórek filarowych i komórek Deitera. Liczba wewnętrznych i zewnętrznych komórek filarowych od początku do końca serii jest ponumerowana. Skróty: IHC (wewnętrzna komórka rzęsata), aIHC (sąsiednia wewnętrzna komórka rzęsata), OHC (zewnętrzna komórka rzęsata), PC (komórka filarowa), DC (komórka Deitera).

Dyskusja

Procedura krojenia w wibrotomie, a następnie immunohistochemia i obrazowanie konfokalne pozwalają na wizualizację narządu Cortiego przy minimalnym uszkodzeniu tkanki. Wyraźnie widać, że obrazy konfokalne pobrane z wewnętrznych obszarów przekroju wykonanego wibrotomem wykazują doskonałe zachowanie morfologii komórkowej, ograniczone jedynie przez artefakty utrwalania. Obrazy konfokalne wykonane blisko dwóch powierzchni cięcia przekroju wibrotomowego są często nieodróżnialne od obrazów z obszarów wewnętrznych, choć zaobserw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikrotom z wibrującym nożem Leica VT1000S	Leica Microsystems
Konfokalny mikroskop skaningowy laserowy Zeiss LSM510	Carl Zeiss, Inc.
Pinceta Student Dumont #5	Fine Science Tools	91150-20
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia UltraPure	Invitrogen	16520-050
Forma do zatapiania Peel-A-Way	Polysciences, Inc.	18986 or 18646A
albumina surowicy bydlęcej	Jackson ImmunoResearch	001-000-162
Surowica kozia	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 przeciwkrólicze IgG kozie	Invitrogen	A-11036	rozcieńczenie 1:1000
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
smar próżniowy	Fisher Scientific	S41718
Żel Affi-Gel Blue	Bio-Rad	153-7301