Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN

35.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2794

⸱

13 lipca 2011

 ,  , 
1Department of Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Northwestern University Feinberg School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Liczne niedawne badania zidentyfikowały mutacje w białkach synaptycznych powiązanych z patologiami mózgu. Pierwotne hodowle neuronów korowych zapewniają dużą elastyczność w badaniu wpływu tych białek związanych z chorobami na morfologię i ruchliwość kolców dendrytycznych.

Streszczenie

Kolce dendrytyczne są miejscami większości połączeń pobudzających w mózgu i tworzą komponent postsynaptyczny synaps. Struktury te są bogate w aktynę i wykazują wysoką dynamikę. W odpowiedzi na klasyczną plastyczność Hebba, a także sygnały neuromodulacyjne, kolce dendrytyczne mogą zmieniać swój kształt i liczbę, co uznaje się za kluczowe dla doprecyzowania obwodów neuronalnych oraz przetwarzania i przechowywania informacji w mózgu. Wewnątrz kolców dendrytycznych złożona sieć białek łączy sygnały pozakomórkowe z cytoszkieletem aktynowym, umożliwiając kontrolę morfologii i liczby kolców dendrytycznych. Badania neuropatologiczne wykazały, że szereg stanów chorobowych, od schizofrenii po zaburzenia ze spektrum autyzmu, charakteryzuje się nieprawidłowanią morfologią lub liczbą kolców dendrytycznych. Co więcej, niedawne badania genetyczne zidentyfikowały mutacje w licznych genach kodujących białka synaptyczne, co sugeruje, że białka te mogą przyczyniać się do aberrantnej plastyczności kolców, która częściowo leży u podstaw patofizjologii tych zaburzeń. Aby zbadać potencjalną rolę tych białek w kontrolowaniu morfologii/liczby kolców dendrytycznych, zastosowanie hodowlanych neuronów korowych oferuje kilka zalet. Po pierwsze, system ten pozwala na obrazowanie kolców dendrytycznych o wysokiej rozdzielczości w komórkach utrwalonych, a także obrazowanie poklatkowe żywych komórek. Po drugie, ten system in vitro umożliwia łatwą manipulację funkcją białek poprzez ekspresję białek zmutowanych, wyciszanie za pomocą konstruktów shRNA lub traktowanie farmakologiczne. Techniki te pozwalają badaczom na rozpoczęcie analizy roli białek związanych z chorobami oraz przewidywanie, w jaki sposób mutacje tych białek mogą funkcjonować in vivo.

Protokół

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do badania morfologii i dynamiki kolców dendrytycznych w dowolnym pierwotnym systemie hodowli komórkowej.

1. Przygotowanie pierwotnych kultur neuronów korowych

  1. Przygotować hodowle neuronów korowych o wysokiej gęstości z embrionów szczurów Sprague-Dawley w dniu E18 i hodować w bezsurowiczej pożywce warunkowanej glią1-2.
  2. Uśmiercić jedną ciążną samicę szczura (E18) zgodnie z procedurami ACUC; szybko usunąć macicę (z płodami) i umieścić ją w 10 mm szalce Petri na lodzie.
  3. Rozciąć macicę i błonę owodniową; przytrzymać płód za szyją (z nienaruszoną pępowiną) jedną pęsetą, drugą pęsetą odsunąć skórę głowy od tyłu do przodu, a następnie rozciąć czaszkę ostrym końcem pęsety wzdłuż linii środkowej od tyłu do przodu.
  4. Usunąć cały mózg za pomocą pęsety zakrzywionej (ruchem czerpiącym) i umieścić go w 10 mm szalce Petri zawierającej 10 ml lodowatego HBSS pozbawionego jonów Ca2+ i Mg2.
  5. Przytrzymać pień mózgu jedną pęsetą, rozdzielić półkule drugą pęsetą, usunąć hipokamp i prążkowie, wyizolować korę i ostrożnie oddzielić tkankę korową od opon mózgowych.
  6. Zebrać wypreparowaną tkankę korową, krótko ją posiekać i przenieść do probówki 15 ml zawierającej 4 ml uprzednio ogrzanej trypsyny/EDTA (0,25% trypsyny, 0,53 mM EDTA; HyQ Trypsin od HyClone SH3042.01); inkubować w kąpieli wodnej w 37 °C przez ok. 15 min; usunąć trypsynę/EDTA w maksymalnym możliwym zakresie za pomocą jednorazowej pipety plastikowej, następnie dodać 1,5 ml pożywki neuronalnej.
  7. Rozdzielić trawione tkanki mechanicznie poprzez delikatne pipetowanie pipetą 5 ml (ok. 10 razy, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza), dodać 2 ml pożywki, odstawić na 30 s, a następnie przenieść 2 ml supernatantu do probówki 15 ml.
  8. Powtórzyć krok 6 dwukrotnie (całość powinna zająć ok. 15 min).
  9. Wirować zawiesinę komórkową przy 20g przez 2 min.
  10. Usunąć supernatant (pipetą 5 ml – nie używać aspiratora próżniowego); rozluźnić osad, uderzając palcem w dno probówki; resuspender osad komórkowy w 5 ml pożywki i przefiltrować przez sitko komórkowe 40 μm do probówki 50 ml.
  11. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórkowej i 10 μl błękitu trypanu; policzyć żywe komórki (metoda wykluczania błękitu trypanu) za pomocą hematocytometru.
  12. Typowa wydajność: 5 x 106 komórek/mózg; rozcieńczyć do żądanej gęstości (np. 1,5 x 106 komórek/ml) przed wysiewaniem.
  13. Napełnić płytki hodowlane pożywką do wysiewania (pożywka Neurobasal uzupełniona o 2% B27, 0,5 mM glutaminy i 1% penicyliny i streptomycyny) (objętość całkowita pomniejszona o objętość wysiewaną) zawierającą okrągłe szkiełka nakrywkowe 18 mm lub kwadratowe 2x22 mm, powlekone poli-D-lizyną (0,2 mg/ml, Sigma) rozpuszczoną w 0,1 M buforze boranowym (3,1 g/L kwasu borowego, 4,8 g/L boraksu, pH 8,5, sterylizowane przez filtr); objętość całkowita dla płytki 12-dołkowej = 0,8 ml/dołek.
  14. Wysiać neurony z gęstością podaną w następnym kroku; równomiernie rozprowadzić komórki poprzez delikatne kołysanie lub opukiwanie płytki.
  15. Dla płytek 12-dołkowych (3,5 cm2/dołek): (wysoka gęstość 3 x 105/dołek = 857/mm2) (średnia gęstość 1,5 x 105/dołek = 430/mm2); płytki 6-dołkowe (9,6 cm2/dołek): (wysoka gęstość 9 x 105/dołek = 624/mm2) (średnia gęstość 4,5 x 105/dołek = 312/mm2).
  16. Godzinę po wysianiu wymienić całą pożywkę na świeżą (pożywka Neurobasal uzupełniona o 2% B27, 0,5 mM glutaminy i 1% penicyliny i streptomycyny). Ponieważ debris komórkowy ma tendencję do osiadania na środku dołka, najpierw delikatnie zamieszać płytki okrężnymi ruchami, aby ułatwić usunięcie zanieczyszczeń; należy uważać, aby komórki w żadnym momencie nie wyschły.
  17. Następnie dwa razy w tygodniu wymieniać ½ pożywki (usunąć ok. 30-350 μl z każdego dołka i dodać 40 μl ogrzanej świeżej pożywki odżywczej do każdego dołka).
    Opcjonalnie: w dniu DIV 4 dodać do pożywki odżywczej 20 μM kwasu D,L-amino-fosfonowalerianowego (D,L-APV, Ascent Scientific); hodować neurony w pożywce Neurobasal uzupełnionej o 2% B27, 0,5 mM glutaminy i 1% penicyliny i streptomycyny + 20 μM APV.
  18. Hodować pierwotne kultury neuronów korowych przez 24-28 dni in vitro (DIV), ponieważ w tym punkcie czasowym kolce dendrytyczne wykazują dojrzałą morfologię (tj. tworzą połączenia z partnerami presynaptycznymi i mają wyraźną strukturę przypominającą główkę) i odpowiada to wczesnemu okresowi dojrzewania u gryzoni3-4. Neurony hodowane na okrągłych nakrywkach 18 mm można poddać transfekcji i traktować farmakologicznie, a następnie utrwalić, poddać immunobarwieniu i obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego w celu szczegółowej analizy morfometrycznej kolców dendrytycznych. Komórki hodowane na kwadratowych nakrywkach 2x2 mm można wykorzystać w eksperymentach obrazowania time-lapse do badania dynamiki kolców dendrytycznych.

2. Transfekcja pierwotnych hodowli neuronów korowych

  1. Neurony korowe poddaje się transfekcji 2–3 dni przed eksperymentami przy użyciu Lipofectamine 20 (Invitrogen)5.
  2. Przygotuj „h-DMEM”, regulując pH pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; bez glutaminy, Invitrogen 1965-092) za pomocą 10 mM sterylnego HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy; MediaTech Cellgro 25-060-C I, 1M, pH 7). Podgrzać do 37°C.
  3. Przenieś szkiełka nakrywki do 60/1000 μl (szkiełka nakrywkowe 18/2x22 mm) uprzednio ogrzane (37°C) nowe medium bez antybiotyków (medium Neurobasal, B27, 0,5 mM glutaminy) i inkubować komórki w nawilżonym 37°C inkubator z dodatkiem 5% CO22 przez 30 minut.
  4. Na każde szkiełko nakrywkowe nanosi się wyznaczoną ilość DNA (jeden lub kilka plazmidów DNA, np. pEGFP do obrazowania morfologii komórki oraz białka synaptycznego z tagiem i mutacją; 1-2 μg w zależności od konstruktu) do 50 μl z h-DMEM; odstawić na 5 minut.
  5. Do każdego szkiełka nakrywkowe dodać 4/6 μl (szkiełka nakrywkowe 18/2x2 mm) Lipofectamine 20 do 50 μl h-DMEM; pozostawić na 5 minut.
  6. Dokładnie wymieszać probówki z kroku 1.3&1,4, pozostawić przez co najmniej 20 minut w środowisku uwilgotnionym 37°C inkubator z dodatkiem 5% CO22Kompleks jest stabilny do 6 godzin zgodnie z informacjami producenta.
  7. Dodawać kroplami mieszaninę Lipofectamine 20/DNA z kroku 1.5 do komórek. Inkubować komórki w humidyfikowanym 37°C inkubator, z dodatkiem 5% CO2, przez 4 godziny.
  8. Używając pożywki doprawiającej z kroku 1.1 (30/600 μl), uzupełnić podgrzanym wcześniej (37°C) 400/800 μl świeża pożywka karmiąca (szkiełka nakrywkowe 18/2x2 mm). Po wykonaniu kroku 1.6 przenieść szkiełka nakrywkowe do pożywki zawierającej mieszaninę starej i świeżej pożywki karmiącej.
  9. Pozostawić plazmidy do dalszej ekspresji przez 2-3 dni.

3. Obróbka pierwotnych hodowli neuronów korowych hodowanych na okładkach szkiełkowatych o średnicy 18 mm

Neurony hodowane na pokrywkach szkieł o średnicy 18 mm, uprzednio poddane transfekcji, mogą być również łatwo poddane działaniu leków.

  1. Przygotować ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy; w mM: 125 NaCl, 2.5 KCl, 26.2 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1 glukozy, 5 HEPES, 2.5 CaCl2 oraz 1.25 MgCl2 z dodatkiem 20 μM D,L-APV). Podgrzać do 37°C. Przykrywia wstępnie inkubować w 90 μl ciepłego ACSF przez 30-60 minut. W tym czasie można przeprowadzić wstępne traktowanie inhibitorami.
  2. Przygotować odczynniki farmakologiczne/nośnik z roztworów stokowych do 10-krotnego stężenia roboczego; rozcieńczenia roztworów przeprowadzić w ACSF. Ostrożnie dodać odczynnik/nośnik do komórek (do końcowej objętości 10 μl, aby uzyskać końcowe stężenie 1X odczynnika/nośnika) i inkubować przez wymagany czas5.
  3. Po traktowaniu utrwalić komórki i przygotować je do immunocytohistochemii.

4. Fixacja i immunocytohistochemia (ICC)

  1. Utrwal neurony w 4% formaldehydzie/4% sacharozy w PBS (80 μl) przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub w 4% formaldehydzie/4% sacharozy w PBS (800 μl) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj 2x w PBS i utrwal przez 10 minut w schłodzonym wcześniej (-20°C) metanolu (80 μl) w temperaturze 4°C. Fixacja metanolem polega na denaturacji i precypitacji białek. Procedura ta prowadzi do odsłonięcia białek w gęstości postsynaptycznej (PSD) oraz w obszarach bogatych w lipidy.
  2. Przemyj szkiełka podstawowe w PBS (80 μl), 2x, przez 10 minut każdego razem.
  3. Przeprowadź jednoczesną permeabilizację i blokowanie komórek w PBS zawierającym 2% normalnego surowicy koziej oraz 0,1% Triton-X-10 (800 μl) przez 1 h w temperaturze pokojowej.
  4. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko GFP, znacznikowi epitopowemu (np. His, myc, V5) lub białkom endogennym do PBS zawierającego 2% normalnej surowicy koziej w odpowiednim stężeniu. Weź szalkę o średnicy 15 cm, podziel ją na kwadraty, ponumeruj je i przykryj parafilmem. Nanieś około 80 μl mieszaniny przeciwciał i blokującej na parafilm (jedna kropla na kwadrat), a następnie połóż szkiełko podstawowe na mieszaninie przeciwciał/blokującej stroną z komórkami dołu. Inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
  5. Przemyj szkiełka podstawowe w PBS, 3x po 15 minut każdego razem.
  6. Rozcieńcz wtórne przeciwciała koniugowane z Alexa (Invitrogen) w PBS zawierającym 2% normalnej surowicy koziej w odpowiednim stężeniu. Inkubuj przeciwciała wtórne w ten sam sposób co w kroku 3.4, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.
  7. Przemyj szkiełka podstawowe dodatkowo 3x przez 15 minut w PBS.
  8. Zamocuj szkiełka podstawowe na standardowych preparatach mikroskopowych, używając odczynnika antyblaknącego ProLong Gold (Invitrogen).

5. Analiza ilościowa morfologii kolców

Obrazy konfokalne pojedynczo i podwójnie znakowanych neuronów (komórek ekspresujących GFP oraz konstrukt lub endogenne białko docelowe) uzyskujemy przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM5 Pascal. Do wszystkich eksperymentów obrazowania wybieramy zdrowe neurony piramidalne do wykonania zdjęć i wykorzystania w późniejszej analizie. Zdrowe neurony to komórki, które nie wykazują żadnych oznak pęcherzykowania ani stresu wynikającego z traktowania lub fiksacji i które posiadają pełne, nieprzerwane drzewo dendrytyczne.

  1. Obrazy neuronów należy uzyskać przy użyciu obiektywu imersyjnego z olejkiem 63x (Zeiss) o aperturze numerycznej (NA) 1,4, w formie serii Z składającej się z 3-8 obrazów, uśrednionych 4-krotnie, z interwałami 0,37 μm, rozdzielczością 1024x1024 pikseli i prędkością skanowania 2,5 sekundy na przekrój. Hodowle przeznaczone do bezpośredniego porównania muszą być obrazowane przy tych samych parametrach akwizycji. Należy przeanalizować 10-20 neuronów na warunek, z 3-5 oddzielnych eksperymentów, oraz 2 dendryty o długości 100 μm na neuron. Eksperymenty powinny być przeprowadzone w sposób ślepy i na hodowlach siostrzanych. Dostrój wzmocnienie (gain) i offset detektora tak, aby objęły one nawet słabo fluorescencyjne cienkie kolce bez tworzenia halo wokół dendrytu, tak aby przejście między sygnałem fluorescencyjnym w kolcu a tłem było ostre, co umożliwi precyzyjną kwantyfikację. Parametry akwizycji muszą pozostać niezmienne dla wszystkich skanów w ramach jednego eksperymentu.
  2. Obrazy GFP można uzyskać przy użyciu linii lasera argonowego, wzbudzając przy 488 nm i zbierając sygnał za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 505-530 nm. Obrazy białek nadekspresyjnych lub białek endogennych znakowanych przeciwciałem wtórnym Alexa 568 (Invitrogen) można pozyskać przy użyciu lasera HeNe wzbudzającego przy 543 nm i zbierania sygnału za pomocą filtra długoprzepustowego 560 nm. Moc lasera należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć fotowybielania próbek.
  3. W programie MetaMorph (Molecular Devices, Inc.) do analizy morfometrycznej i kwantyfikacji wykorzystuje się dwuwymiarowe rekonstrukcje maksymalnej projekcji obrazów z serii Z po odjęciu tła. Aby zbadać morfologię kolców dendrytycznych, należy spłaszczyć obrazy z serii Z, skalibrować wymaganą odległość, a następnie zastosować progowanie tak, aby objęło ono wszystkie kolce w sposób, w którym próg dokładnie odpowiada obrysowi kolców (Rys. 2E,F). W celu zmniejszenia zmienności należy mierzyć kolce wyłącznie na dendrytach wtórnych i trzeciorzędnych (łączna długość 10 μm na neuron), a pomiary segmentów powinny być wykonywane między punktami rozgałęzień. Ręcznie obrysuj każdy kolec tak, aby utworzył on zamknięty obwód (Rys. 2G).
  4. Zmierz automatycznie w programie MetaMorph następujące parametry kolców: długość kolca, szerokość kolca, powierzchnię przekroju poprzecznego oraz liniową gęstość kolców dendrytycznych. Eksportuj morfometryczne parametry kolców dendrytycznych do programu Excel w celu kwantyfikacji. Użyj nieparzystego testu t Studenta, aby określić istotność statystyczną różnic między dwiema grupami; do porównania trzech lub więcej grup można zastosować jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, a następnie test post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. Analizę statystyczną można przeprowadzić w programach Excel, GraphPad lub SPSS. Wykresy skumulowane analizuj za pomocą testuz Kołmogorowa-Smirnowa (test K-S)2,5-6.

6. Ilościowa immunofluorescencja (IF)

Ilościowe określenie immunofluorescencji z użyciem przeciwciał przeciwko specyficznym białkom synaptycznym, wizualizowanej za pomocą wtórnego przeciwciała Alexa 568 (Invitrogen), może być wykorzystane do badania zmian w grupowaniu i lokalizacji synaptycznej endogennych białek synaptycznych.

  1. Należy wykonać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego zgodnie z powyższym opisem. Do obrazowania neuronów poddanych podwójnemu barwieniu należy użyć lasera argonowego oraz HeNe (patrz wyżej). Obrazować należy wyłącznie zdrowe neurony piramidalne, które nie wykazują żadnych oznak stresu.
  2. W celu pomiaru intensywności fluorescencji należy odjąć tło odpowiadające szyjce dendrytu (Rys. 2I, żółty kwadrat), aby wygenerować obraz z „odjętym tłem” (Rys. 2J) przy użyciu programu MetaMorph. Należy zastosować jednolity próg intensywności obrazów, aby uwzględnić klastry o natężeniu co najmniej dwukrotnie wyższym niż w przyległym dendrycie (Rys. 2K). Obszary wzdłuż dendrytów (10 μm na neuron) należy wyznaczyć za pomocą narzędzia „Perimeters” (Rys. 2D), a następnie automatycznie zmierzyć gęstość liniową (liczba/100 μm długości dendrytu) oraz całkowitą intensywność (całkowita intensywność IF) każdego klastra synaptycznego w programie MetaMorph7-9.
  3. Aby zmierzyć względną zawartość białka synaptycznego w kolcach, należy najpierw określić klasteryzację białka poprzez ustawienie progu obrazu GFP w celu wyznaczenia morfologii kolców (Rys. 2E,F) przy użyciu programu MetaMorph. Obszary zainteresowania obejmujące wyłącznie kolce należy przenieść na obrazy badanego białka zarejestrowane w drugim kanale (Rys. 2G,H). Należy policzyć liczbę klastrów białkowych i zmierzyć całkowitą intensywność immunofluorescencji wewnątrz kolców, aby ocenić zawartość białka w kolcach.
  4. Parametry IF białek synaptycznych należy wyeksportować do programu Excel w celu ilościowej analizy. Do określenia istotności statystycznej różnic między dwiema grupami należy zastosować nieparzysty test t Studenta; w przypadku porównania trzech lub więcej grup można zastosować jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA, a następnie test Tukey-b post hoc dla porównań wielokrotnych. Analizę statystyczną można przeprowadzić w programach Excel, GraphPad lub SPSS.

7. Obrazowanie poklatkowe

Aby zbadać dynamikę kolców dendrytycznych, taką jak zmiany w ruchliwości lub morfologii poszczególnych kolców, w obecności lub przy braku białek synaptycznych związanych z chorobą, należy hodować pierwotne neurony korowe na kwadratowych szkiełkach nakrywkowych o wymiarach 2x2 mm przez 24-28 DIV. Neurony można poddać podwójnej transfekcji GFP/mCherry w celu określenia morfologii komórek oraz fluorescencyjnie znakowanymi mutantami białek synaptycznych, zgodnie z powyższym opisem. Do wszystkich eksperymentów obrazowania należy wybrać zdrowe neurony piramidalne wykazujące ekspresję obu konstruktów; komórki te mogą zostać poddane leczeniu farmakologicznemu, obrazowaniu i wykorzystane w późniejszych analizach.

  1. Wstępnie inkubować neurony hodowane na szkiełkach przedmiotowych 2x2 mm w 1,5 ml ACSF przez 30-60 minut w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C, z dodatkiem 5% CO2. Na tym etapie komórki można również poddać wstępnej obróbce lekami. Po wstępnej inkubacji/obróbce przenieść komórki do zamkniętej komory obrazowania na stole mikroskopu (Warner, RC-30HV). Temperaturę 37°C utrzymywać za pomocą jednostki sterującej (Warner, TC-34B)2,5-6,10.
  2. Aby zbadać ruchliwość kolców, poddać komórki wstępnej obróbce lekiem lub nośnikiem przez maksymalnie 30-60 minut przed przeniesieniem komórek do komory obrazowania. Pozwala to na zapewnienie odpowiedniego czasu na uruchomienie szlaków drugich przekaźników w neuronie przez lek/nośnik. Obrazy należy pozyskiwać za pomocą obiektywu 63X (Ziess, N.A. 1.4) z dwukrotnym uśrednianiem (2X averaging) w odstępach 10-minutowych. Należy wybrać zdrowe neurony o ogólnej morfologii piramidalnej wykazujące ekspresję GFP/mCherry lub białka znakowanego fluorescencyjnie. Aby zminimalizować uszkodzenia fotochemiczne, należy zmniejszyć moc lasera do 0,5-1%. Porównanie komórek traktowanych nośnikiem i lekiem pozwoli wykazać zmiany w ruchliwości kolców. Alternatywnie ruchliwość kolców można oceniać przed i po zabiegu poprzez perfuzję leku/nośnika (patrz poniżej). W każdym punkcie czasowym należy zebrać stosy Z (Z-stacks).
  3. Aby śledzić zmiany w morfologii kolców dendrytycznych w czasie, obrazować szkiełka przez 1 godzinę w celu ustalenia zmian bazowych w morfologii. W tym czasie przeprowadzić perfuzję leku/nośnika do komory obrazowania przy użyciu pompy perystaltycznej (Gilson, Minipuls 3) i obrazować neuron przez kolejną godzinę. Konfokalne stosy Z należy pozyskiwać za pomocą olejowego obiektywu 63X (Ziess, N.A. 1.4), z dwukrotnym uśrednianiem (2X averaging) co 10 minut. Moc lasera należy zmniejszyć do 0,5-1%, aby zminimalizować uszkodzenia fotochemiczne.
  4. Na koniec każdej sesji obrazowania należy wykonać obraz całego neuronu przy powiększeniu 20X, aby ocenić stopień uszkodzeń fotochemicznych. Wszelkie neurony wykazujące oznaki stresu powinny zostać pominięte w analizie ilościowej. Stosy Z z każdego punktu czasowego należy spłaszczyć do projekcji 2D w programie MetaMorph. W zależności od jakości obrazu i stopnia transfekcji, w programie MetaMorph można zastosować filtr medianowy lub odjęcie tła w celu uzyskania przejrzystych obrazów do analizy.
  5. Aby ocenić przekształcenia i ruchliwość kolców, obrazy wykonane na początku, w środku i na końcu 10-minutowej sesji obrazowania należy zakodować kolorami i nałożyć na siebie w programie MetaMorph. Analizie należy poddać co najmniej 10 μm dendrytu na komórkę. Całkowitą frakcję ruchliwości kolców definiuje się jako całkowitą liczbę zdarzeń ruchliwości, tzn. wydłużenia, retrakcji, przekształcenia główki lub ruchliwości protruzyjnej, znormalizowaną do liczby kolców6,1. Metoda ta mierzy częstotliwość zdarzeń, nie uwzględniając ich wielkości; łączy ona wszystkie rodzaje zdarzeń i stanowi ogólną ocenę całkowitej ruchliwości. Zdarzenie protruzyjne definiuje się jako pojawienie się nowej, przejściowej wypustki z główki kolca lub trzonu dendrytu. Zdarzenie retrakcji definiuje się jako zanik istniejącej lub przejściowej wypustki znajdującej się na główce kolca lub trzonie dendrytu. Sumę zdarzeń protruzji i wydłużenia dzieli się przez całkowitą liczbę kolców w analizowanym regionie dendrytu.
  6. Aby ocenić zmiany w morfologii poszczególnych kolców w odpowiedzi na leczenie lekiem, należy zmierzyć pole przekroju kolców dendrytycznych lub liniową gęstość kolców dendrytycznych w punkcie czasowym -1 godzina (1 godzina przed perfuzją), bezpośrednio przed leczeniem oraz w każdym punkcie czasowym po leczeniu. Każdy punkt czasowy należy znormalizować do punktu czasowego 1 h przed leczeniem. Aby upewnić się, że zmiany w morfologii lub gęstości liniowej kolców dendrytycznych nie wynikały z uszkodzeń fotochemicznych, należy przeanalizować neurony poddane perfuzji nośnikiem. Różnice w średnich można wyznaczyć za pomocą nieparzystych testów t Studenta lub jednopróbkowego testu t.

8. Alternatywne podejścia i klucze do sukcesu

  1. Opisaliśmy hodowlę neuronów kory mózgu w obecności D,L-APV, inhibitora receptora NMDA, od 4. dnia in vitro (DIV 4) aż dojrzałości (DIV24-28). Należy zauważyć, że choć hodowla neuronów kory w obecności D,L-APV ma tę zaletę, że pozwala na długoterminowe utrzymanie dobrej kondycji kultur neuronalnych, obecność D,L-APV może wpływać na rozwój synaps. W związku z tym alternatywą jest hodowla neuronów bez dodatku D,L-APV2,5. Podczas hodowli neuronów bez D,L-APV należy zwrócić szczególną uwagę na ogólną kondycję kultur, ponieważ istnieje zwiększone ryzyko śmierci komórek z powodu nadmiernej cytotoksyczności Ca2+ wynikającej z nadaktywnej aktywacji receptora NMDA.
  2. Kultury neuronalne opisane w niniejszym protokole mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów istotnych dla regulacji morfologii kolców dendrytycznych oraz ruchliwości kolców o dojrzałej morfologii (tzn. takich, które tworzą połączenia z partnerami presynaptycznymi i mają wyraźną strukturę główki)2,4,5. Alternatywnie, wykorzystanie kultur w wcześniejszym punkcie czasowym, np. DIV1-16, może być bardziej odpowiednie do odpowiedzi na pytania dotyczące formowania się kolców dendrytycznych lub ich regulacji podczas wczesnego rozwoju.
  3. Alternatywą dla mikroskopii konfokalnej jest zastosowanie szerokopolowej epi-fluorescencji do obrazowania traktowanych hodowli neuronów kory. W połączeniu z odpowiednimi algorytmami dekonwolucji można przeprowadzić szczegółową analizę morfometryczną kolców w komórkach utrwalonych lub żywych. Ponadto do analizy morfologii kolców dendrytycznych można wykorzystać alternatywne, bezpłatne oprogramowanie, takie jak ImageJ (http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html) lub Neuronstudio (http://research.mssm.edu/cnic/tools-ns.html).
  4. Przy badaniu ruchliwości/zmian morfologicznych kolców dendrytycznych za pomocą obrazowania time-lapse należy pamiętać, że zastosowanie krótszych odstępów czasowych, np. 5-10 minut, może pozwolić na znacznie bardziej szczegółową analizę wymiany (turnover) kolców dendrytycznych2,5. Stosowanie krótszych interwałów czasowych może również pozwolić na zidentyfikowanie szybszych form zmian morfologicznych kolców, których nie wykryto by przy dłuższych odstępach.
  5. Stosowanie hodowli neuronów kory mózgu wiąże się z szeregiem wad i problemów, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, obawą przy stosowaniu hodowli neuronów kory jest możliwa zmienność między kulturami, która może wpływać na parametry takie jak gęstość kolców dendrytycznych. Dlatego niezbędne jest ścisłe przestrzeganie następujących punktów w celu zminimalizowania tej zmienności. Po pierwsze, parametry hodowli i odczynniki powinny być tak spójne, jak to możliwe, przy jednoczesnym stosowaniu dobrych praktyk hodowlanych; znacznie ograniczy to poziom zmienności między kulturami. Po drugie, niezbędne jest, aby wszystkie eksperymenty były przeprowadzane w tym samym punkcie czasowym i na kulturach siostrzanych. Ponadto punkt czasowy, w którym przeprowadzane są eksperymenty, powinien zostać starannie wybrany, aby umożliwić badaczowi postawienie odpowiednich pytań (patrz punkt 2 powyżej). Wreszcie, kluczowe jest stosowanie odpowiednich kontroli we wszystkich eksperymentach, tak aby warunki traktowania były zawsze badane w odniesieniu do tych wewnętrznych kontroli. Pozwoli to wyeliminować problem zmienności między kulturami.
  6. Wykorzystanie hodowli neuronów kory mózgu jest potężnym narzędziem, umożliwiającym badaczom krytyczną analizę mechanizmów niezbędnych do regulacji morfologii i ruchliwości kolców dendrytycznych. Należy jednak zauważyć, że kultury te nie oddają w pełni sytuacji in vivo, a kwestii takich jak organizacja warstw kory oraz wpływ innych typów komórek, np. komórek glejowych, na formowanie się synaps, nie można rozpoznać w opisanym powyżej systemie. Niemniej jednak, taki układ może być wykorzystany do zidentyfikowania potencjalnie kluczowych mechanizmów leżących u podstaw regulacji morfologii i ruchliwości kolców dendrytycznych.

9. Reprezentatywne wyniki

Opisane powyżej analizy zostały zaprojektowane w celu zbadania zmian w morfologii, liczbie i ruchomości kolców dendrytycznych w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne i/lub manipulacje genetyczne funkcją białek in vitro. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy te techniki do charakterystyki roli białek synaptycznych regulujących cytoszkielet aktynowy w kolcach dendrytycznych, co prowadzi do zmian w ich strukturze2,9. Ponadto zastosowaliśmy tę analizę, aby określić, w jaki sposób związki neuroaktywne, takie jak neuromodulatory, mogą wpływać na zmiany w morfologii, liczbie lub kształcie kolców dendrytycznych, zarówno samodzielnie4,6,10, jak i w obecności bodźców zależnych od aktywności5.

Aby ocenić dokładność pomiarów parametrów 1D lub 2D, zmierzono średnice i pola powierzchni fluorescencyjnych lateksowych mikrosfer (Duke Scientific) o znanych wymiarach (0.2, 0.52, 1.0 μm), zamontowanych w tych samych warunkach, co neurony w całym badaniu. Wykorzystując te same warunki obrazowania, co przy pomiarach kolców dendrytycznych (obiektyw imersyjny olejowy 63X NA=1.4, LSM 5 Pascal), wykonano obrazowanie mikrosfer, a następnie określono ich średnice i pola powierzchni w programie Metamorph, w sposób analogiczny do pomiarów kolców. Następnie porównano rzeczywiste pomiary ze znanymi wymiarami mikrosfer.

Wykres na rysunku 1 (Fig.1) pokazuje, że mogliśmy precyzyjnie zmierzyć powierzchnie mikrosfer o średnicach 0,52 i 1,0 μm (powierzchnie odpowiednio 0,21 μm2 i 0,78 μm2) (zmierzony odchylenie standardowe ~15%; odchylenie standardowe określone przez producenta ~9%). Nawet w przypadku mikrosfer o średnicy 0,2 μm nasze pomiary były dość bliskie rzeczywistym wymiarom (choć z dużym SD). Jest to zgodne z obliczoną rozdzielczością lateralną naszego mikroskopu konfokalnego przy użyciu tego konkretnego obiektywu, wynoszącą 0,3 μm (stosując równanie Δxcf = (0.61/v2)√/NA)12. Jest to wynik znacznie lepszy niż w przypadku rozdzielczości osiowej, która w mikroskopach konfokalnych i dwufotonowych jest znana z niskiej wartości. Dodatkowo, eksperymentalnie określiliśmy lateralną (oś x/y) funkcję rozmycia punktu (PSF), mierząc zielone fluorescencyjne mikrosfery o średnicy 20 nm (Duke Scientific), co dało wynik ~ 0,5 μm. Oszacowanie to przeprowadzono przy otwartym otworze pinhole, zatem można przyjąć, że przy zamkniętym pinhole PSF byłaby w rzeczywistości mniejsza. Niemniej jednak ponownie wskazuje to, że jesteśmy w stanie precyzyjnie mierzyć powierzchnie większe niż 0,196 μm2 (średnica = 0,5 μm). Wskazówka dotycząca rzeczywistej lateralnej PSF podana jest w pracy (Svoboda et al.)13 jako „nie znacznie mniej niż 0,4 μm, co skutkowałoby powierzchnią 0,16 μm2”. Powyższe porównania i rozważania teoretyczne wskazują, że możemy precyzyjnie mierzyć powierzchnie obiektów o rozmiarach zbliżonych do kolców dendrytycznych, ponieważ wymiary mierzonych przez nas kolców były większe niż ta granica rozdzielczości (> 0,25 μm2). W takich warunkach „klasyczne techniki morfometryczne są ilościowe”13, co oznacza, że możemy wiarygodnie mierzyć powierzchnie kolców i precyzyjnie porównywać morfologię kolców w różnych warunkach traktowania.

W celu dokładnego pomiaru morfologii kolców dendrytycznych, przeprowadsiliśmy transfekcję neuronów korowych w 23. dniu in vitro (DIV 23) konstruktem EGFP przez 2 dni. Po transfekcji komórki można poddać działaniu czynników traktujących, a następnie utrwalić i przetworzyć do immunocytochemii (ICC), gdzie sygnał GFP jest wzmocniony, aby zapewnić równomierny rozkład w obrębie dendrytu (lub neuronu). Rysunek 2 przedstawia reprezentatywny obraz neuronu korowego przetransfekowanego GFP, wykonany za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 63X (N.A. 1.4) (Rys. 2A). Pozwala to na uzyskanie szczegółowych obrazów kolców dendrytycznych o wysokiej rozdzielczości (Rys. 2B). Szczegółowe analizy morfometryczne kolców dendrytycznych są wykonywane w naszym laboratorium przy użyciu programu Metamorph. Program ten pozwala nam nie tylko na pomiar morfologii kolców dendrytycznych, ale także na badanie lokalizacji białek endogennych. Przegląd sposobu przeprowadzania tej analizy przedstawiono na Rysunku 2 (Rys. 2C-G).

Dobrze scharakteryzowanym efektem bodźców zależnych od aktywności jest zwiększenie rozmiaru kolców dendrytycznych2. Rysunek 3 przedstawia reprezentacyjny obraz time-lapse kolca dendrytycznego neuronu korowego DIV 24 wykazującego ekspresję EGFP, obrazowanego przez 30 minut przed i po podaniu bodźca zależnego od aktywności. Ten eksperyment time-lapse potwierdza, że bodźce zależne od aktywności zwiększają rozmiar kolców dendrytycznych (Rys. 3A,B). Aby zbadać podstawową ruchliwość kolców, obrazy pobierano w punktach czasowych 0, 50 i 10 minut, a wydłużenia kolców, retrakcje, ruchliwość protruzywną oraz zmiany kształtu główki mierzono osobno i łączono jako całkowitą ruchliwość. Rysunek 3C-D potwierdza, że nawet w warunkach podstawowych kolce dendrytyczne neuronów korowych wykazują pewien poziom ruchliwości.

Tabela porównawcza wielkości kulek z obrazami mikroskopowymi; analiza w skali nanometrów; pomiar powierzchni kulek.
Ryc. 1. Porównanie zmierzonych i rzeczywistych pól powierzchni mikrosfer fluorescencyjnych. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe zmierzonych obszarów. Obrazy mikrosfer 0.2 μm, 0.52 μm i 1 μmPasek skali = 5 μm.

Schemat budowy neuronu z dendrytami, kolcami dendrytycznymi, somą i aksonem; proces analizy obrazu.
Ryc. 2. Ilościowe określanie morfologii kolców oraz IF. A. Obraz hodowanych neuronów korowych w 25. dniu in vitro (DIV 25) wykazujących ekspresję EGFP. B. Duże powiększenia typowej morfologii kolców dendrytycznych występujących w neuronach korowych. C. Nałożenie obrazu EGFP i białka endogennego (GluR1). D. Zredukowane serie Z dendrytu komórki piramidalnej przetransfekowanej EGFP; podział między trzasteczkę a kolce został wyrysowany ręcznie. E. Następnie za pomocą programu Metamorph wyznacza się i kwantyfikuje wyraźne obszary przekraczające próg intensywności. F. Ręcznie obrysowane neurony wykorzystane do wyznaczenia długości, szerokości i pola przekroju kolców. G. Obszary wyznaczone przez program Metamorph odpowiadające kolcom. H. Obrysy kolców zostaną przeniesione na obraz w kanale czerwonym (białko endogenne) w celu ilościowego oznaczenia sygnału specyficznego dla kolców. I-K. W celu ilościowego oznaczenia immunofluorescencji klastrów białek receptorowych lub synaptycznych stosuje się obrazy projekcyjne serii Z. I. Tło trzonu dendrytu w obrazowaniu IF (żółty kwadrat) zostaje odjęte w celu wygenerowania obrazu „po odjęciu tła”. J. Następnie obraz poddawany jest progowaniu, a program automatycznie mierzy powierzchnię skupisk, gęstość liniową oraz całkowitą wartość szarości (intensywność IF). K. Obraz z progowaniem z H. Paski skali, A = 15 μm, B = 1 μm.

Plastyczność neuronalna; obrazowanie poklatkowe ruchomości kolców, wykres, analiza morfologiczna, wykres ilościowy ruchomości.
Rys. 3. Zależne od aktywności zmiany w morfologii kolców oraz podstawowa ruchliwość kolców dendrytycznych. A. Obrazowanie poklatkowe reprezentatywnego kolca dendrytycznego przed i po dodaniu bodźca zależnego od aktywności. Bodźce zależne od aktywności indukowano poprzez zmianę pożywki eksperymentalnej z ASCF zawierającej Mg2++ or APV do ACSF bez Mg2+ i APV, ale zawierającego 10 μm glicyna B. Kwantyfikacja powierzchni (rozmiaru) kolców dendrytycznych, znormalizowana do punktu czasowego -30 minut (30 minut przed perfuzją). C. Reprezentatywne obrazy punktów czasowych 0, 50 i 100 minut mobilności kolców dendrytycznych. Górne obrazy przedstawiają nałożenie punktów czasowych 0 (czerwony), 50 (zielony) i 10 (niebieski) minut, natomiast obrazy poniżej przedstawiają każdy punkt czasowy osobno. Gwiazdka oznacza wydłużanie kolca; biała strzałka oznacza retrakcję kolca; zielona grot strzałki oznacza mobilność protrustywną; otwarta żółta grot strzałki oznacza zmianę morfologii główki kolca. D. Ilościowe określenie parametrów ruchliwości kolców dendrytycznych oraz całkowitej ruchliwości. E. Obraz powiększenia 20X neuronów korowych wykazujących ekspresję EGFP po sesji obrazowania w celu oceny stanu zdrowia komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane powyżej techniki szczegółowej analizy ilościowej morfologii kolców dendrytycznych, gęstości liniowej i ruchomości w utrwalonych lub żywych pierwotnych neuronach korowych koncentrują się na zrozumieniu wpływu mechanizmów postsynaptycznych, które mogą przyczyniać się do neuropatologii. Podobne podejście można zastosować do ilościowego określenia morfologii lub ruchomości kolców w każdym neuronie kolczastym, w tym w neuronach piramidalnych hipokampa, komórkach Purkinjego lub średnich neuronach kolczastych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Produkcja niniejszej pracy była wspierana przez MetaMorph (Molecular Devices, Inc.).

Podziękowania

Dziękujemy Kelly Jones za staranną redakcję. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01MH 071316, Alzheimer's Association, National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) oraz National Alliance for Autism Research (NAAR) (P.P.); stypendium podoktorskie American Heart Association (D.P.S.); stypendium przeddoktorskie American Heart Association (K.M.W.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okładka szkiełka nr 1.5, okrągła 18 mmWarner Instruments64-0714 (CS-18R15)
Okładka szkiełka nr 1.5, kwadratowa 22 mmWarner Instruments64-0721 (CS-22S15)
Poly-D-LysineSigma-AldrichP-0899MW 70~150 Kda
Pożywka NeurobasalInvitrogen21103049
B27Invitrogen17504044
GlutaminaInvitrogen21051024
Penicylina-StreptomycynaInvitrogen15140148
D,L-APV (AP-5)Ascent ScientificAsc-004
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
DMEMInvitrogen11965092
HEPESMediatech, Inc.25-060-C 11M, pH 7
Roztwór formaldehyduEMD MilliporeFX0415-536%, stopień histologiczny
Normalne surowica koziaVWR international100188-514Jackson Immunoresearch Labs
Triton X-100Fisher ScientificAC21568-2500Acros Organics
Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG (H+L) silnie adsorbowane krzyżowoInvitrogenA-11029
Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-krolicze IgG (H+L) silnie adsorbowane krzyżowoInvitrogenA-11034
Odczynnik antyblaknący ProLong GoldInvitrogenP36934Opakowanie specjalne
Zamknięta komora stolika obrazującegoWarner InstrumentsRC-30HV
Jednostka sterowania temperaturąWarner InstrumentsTC-344B
MetaMorphUniversal Imaging

Bibliografia

  1. Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
  2. Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
  3. Spear, L. Modeling adolescent development and alcohol use in animals. Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).
  4. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure. J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).
  5. Srivastava, D. P. Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).
  6. Woolfrey, K. M. Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines. Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).
  7. Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors. J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).
  8. Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity. J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).
  9. Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6. Neuron. 48, 605-618 (2005).
  10. Jones, K. A. Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).
  11. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).
  12. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat Methods. 2, 910-919 (2005).
  13. Svoboda, K. Do spines and dendrites distribute dye evenly. Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Neurony korowemikroskopia konfokalnaobrazowanie time-lapseanaliza ruchliwości kolcówleczenie farmakologiczneekspresja GFPobrazowanie serii Zpomiary morfometryczneplastyczność synaptyczna
Analiza morfologii kolców dendrytycznych w hodowlanych neuronach OUN
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.