Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

26K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2797

⸱

10 października 2011

 ,  , 
1Department of Genetics, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Streszczenie

Hybrydyzacja in situ w całych preparatach jest bardzo informacyjnym podejściem do określania wzorców ekspresji genów w embrionach. Procedury hybrydyzacji in situ są czasochłonne i wymagające technicznie, obejmując wiele istotnych etapów, które wspólnie wpływają na jakość końcowego wyniku. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje kilka kluczowych etapów kontroli jakości w celu optymalizacji znakowania i wydajności sondy. Ogólnie nasz protokół dostarcza szczegółowego opisu krytycznych kroków niezbędnych do powtarzalnego uzyskiwania wyników wysokiej jakości. Najpierw opisujemy generowanie sond RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) poprzez transkrypcję in vitro matryc DNA uzyskanych metodą PCR. Opisujemy trzy krytyczne testy kontroli jakości służące do określenia ilości, integralności i aktywności specyficznej sond znakowanych DIG. Kroki te są istotne dla wytworzenia sondy o czułości wystarczającej do wykrycia endogennych mRNA w całym embrionie myszy. Dodatkowo opisujemy metody fiksacji i przechowywania embrionów myszy w dniach E8.5-E11.5 do hybrydyzacji in situ. Następnie opisujemy szczegółowe metody ograniczonego trawienia rehydratyzowanych embrionów proteinazą K, a następnie szczegóły dotyczące warunków hybrydyzacji, przemyć po hybrydyzacji oraz traktowania RNazą w celu usunięcia niespecyficznej hybrydyzacji sondy. Do wizualizacji znakowanej sondy i ujawnienia wzorca ekspresji endogennego transkryptu stosuje się przeciwciało sprzężone z AP. Przedstawiono reprezentatywne wyniki z udanych eksperymentów oraz typowe eksperymenty suboptymalne.

Protokół

1. Generowanie ryboprobek poprzez transkrypcję in vitro

  1. Przygotowanie produktów PCR jako matryc do transkrypcji in vitro.
    1. Projektowanie starterów PCR z sekwencjami promotorów fagego w ich końcach 5'.
      Uwaga: Sekwencja promotora dodana do końca 5' startera PCR nici sensownej będzie służyć do transkrypcji sondy sensownej, a sekwencja promotora dodana do końca 5' startera PCR nici antysensownej będzie służyć do syntezy sondy antysensownej1-3. Nie stwierdziliśmy żadnej różnicy w wydajności transkrypcji między matrycami zawierającymi jedynie rdzenne sekwencje promotora a matrycami zawierającymi rdzenny promotor wraz z dodatkowymi sekwencjami 5'. Metoda ta była stosowana z promotorami fagowymi T3, T7 i SP6.
      Należy unikać sekwencji silnie konserwowanych wśród członków rodziny genów lub sekwencji silnie repetytywnych, ponieważ mogą one prowadzić do niespecyficznej hybrydyzacji i tym samym zwiększyć tło barwienia. Sondy o wysokiej zawartości GC będą wykazywać ograniczoną inkorporację digoksygeniny-rUTP, a sekwencje matrycy DNA z ciągami reszt T ograniczą inkorporację dig-UTP ze względu na zawadę steryczną między cząsteczkami digoksygeniny. Długość sondy może wynosić od 300bp do 1kb. Jednak o ile powyższe kryteria są spełnione, zazwyczaj dłuższe sondy wykazują wyższą aktywność swoistą.
    2. Matrycą dla PCR może być klon plazmidowy, klon genomiczny lub DNA genomiczne. Zazwyczaj kupujemy pełnowymiarowe klony EST (np. z ATCC lub Open Biosystems) do wykorzystania jako matryce PCR. Amplifikuje się DNA matrycowe przy użyciu standardowych procedur PCR, aby otrzymać produkt PCR zawierający sekwencje promotorowe. Aby przygotować wystarczającą ilość matryc sond do kilku reakcji syntezy sond, zazwyczaj przeprowadzamy 8 x 50μl reakcji PCR. Produkty reakcji są łączone w kolejnym kroku. W ogóle kilka reakcji PCR o dużej objętości lub więcej mniejszych reakcji (takich jak stosowane przez nas reakcje 50μl) jest wystarczających do wygenerowania odpowiedniej ilości matrycy dla kilku reakcji syntezy sondy.
    3. Aby usunąć zanieczyszczające białka, zwłaszcza ślady RNazy w preparatach plazmidowych, każdą 100μl reakcji PCR trawi się 1μl Proteinazy K w stężeniu 20mg/ml w temperaturze 55° C przez co najmniej 30 minut. Wszystkie odczynniki i inne przedmioty używane po tym trawieniu Proteinazą K powinny być wolne od RNaz i przeznaczone specjalnie do pracy z RNA.
    4. Podczas trawienia Proteinazą K należy przeprowadzić elektroforezę próbki reakcji PCR na żelu, aby sprawdzić integralność produktu PCR. Do rozdzielania mniejszych produktów PCR (poniżej 600-700 bp) stosujemy mini żele akrylamidowe, a do rozdzielania większych produktów PCR (>600-700 bp) żele agarozowe w ramach analizy kontroli jakości. Jeśli na żelu widoczne są wiele prążków, zalecamy optymalizację reakcji PCR w celu uzyskania pojedynczego produktu PCR o prawidłowym rozmiarze.
    5. Reakcję PCR trawioną Proteinazą K należy dokładnie ekstrahować jedną równą objętością mieszaniny fenol/chloroform (1:1), a następnie ekstrahować jedną równą objętością chloroformu. Na każdym etapie należy mieszać, wstrząsając probówką w wortexie przez co najmniej 30 sekund. Kroki te muszą być wykonywane w dygestorium chemicznym.
    6. Oczyszczony produkt PCR wytrąca się poprzez dodanie 0,1 objętości 3M octanu sodu i 2 objętości 100% etanolu. Próbkę pozostawia się w -20° C przez co najmniej 30 minut.
    7. Wiruje się przez 5 minut przy 13 000 rpm w mikrowirowarce, usuwa nadsącz i przemywa 70% etanolem. Pozostawia się osad DNA do całkowitego wyschnięcia.
    8. DNA resuspendsuje się w odpowiedniej objętości (np. 50μl) 1xTE. Stężenie DNA mierzy się za pomocą fluorometru.
    9. Sekwencję nukleotydową każdego przygotowania matrycy PCR określa się za pomocą starterów odpowiadających sekwencjom promotora fagego lub sekwencji wewnętrznej w sondzie. Jest to krytyczny krok kontroli jakości, który zapewnia, że matryca sondy ma prawidłową sekwencję.
    10. DNA jest gotowe do służyć jako matryca do transkrypcji in vitro. Matrycę DNA przechowuje się w 4° C.
  2. Transkrypcja in vitro z użyciem produktu PCR jako matrycy.
    1. Należy przygotować reakcję transkrypcji RNA w końcowej objętości 50μl. Reakcja transkrypcji obejmuje 500 - 1000 ng DNA matrycowego, 5μl 10X Buforu do Transkrypcji (z 100mM DTT), 10μl 2,5mM mieszanki dig-NTP, 3μl (50~90 jednostek) polimerazy RNA, 1μl Alpha-32P CTP (nie starszego niż 6 miesięcy), a pozostałą objętość uzupełnia się wodą traktowaną diethylopirokarbonianem. Mieszanka 2,5mM dig-NTP jest zazwyczaj przygotowywana jako 40μl zapas roboczy zawierający 10μl 10mM CTP, 10μl 10mM GTP, 10μl 10mM ATP, 6,5μl 10mM UTP, 3,5μl 10mM digoksygeniny-11 UTP. Podczas przygotowywania reakcji transkrypcji należy upewnić się, że wszystkie składniki reakcji (z wyjątkiem enzymu) są ogrzane do temperatury pokojowej. Najpierw miesza się DNA i wodę, następnie dodaje bufor reakcyjny, miesza i dodaje pozostałe składniki, w przeciwnym razie spermidyna w buforze do transkrypcji spowoduje wytrącenie DNA. Inkubuje się przez 2 h w temperaturze zalecanej dla stosowanej polimerazy RNA.
      Uwaga: α-32P jest dodawany do reakcji, aby umożliwić określenie proporcji początkowej puli nukleotydów wbudowanych w sondę RNA. Jest to ważny pomiar wydajności reakcji. Wszystkie kolejne kroki są zgodne z procedurami obchodzenia się z 32P.
      Alternatywną metodą pomiaru ilości zsyntetyzowanej sondy RNA jest użycie spektrofotometru do małych objętości. Pozwala to uniknąć stosowania znakowania 32P (patrz uwagi w kroku 1.3.1)
    2. W ciągu ostatnich kilku minut inkubacji należy przygotować kolumnę Quick Spin Column (Roche) zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Po inkubacji dodaje się 1μl DNazy I wolnej od RNaz i inkubuje w 37° C przez 10 min.
    4. Rozcieńcza się do 100μl za pomocą 50μl buforu rozcieńczającego reakcję (20mM Tris pH7,5, 1% SDS, 20mM EDTA, 100mM NaCl (wolny od RNaz, przygotować 50ml zapasu i przechowywać w temperaturze pokojowej)). Pobiera się 1μl (zazwyczaj do 4μl 1x TE) do zliczania scyntylacyjnego całkowitej liczby zliczeń początkowych oraz do analizy żelowej.
    5. Resztę reakcji nanosi się na środek złoża kolumny i wiruje przy 1100 X g przez 4 min w wirówce klinicznej nakładkowej. Po wirowaniu sonda RNA znajduje się w probówce zbierającej.
    6. Do elowanej reakcji dodaje się 2 objętości 100% etanolu. Dobrze wymieszać i trzymać na lodzie przez 5 min (lub w -20° C przez 30 min).
    7. Probówkę wiruje się w mikrowirowarce przy maksymalnej prędkości obrotowej przez 5 minut, aby osadzić sondę RNA.
    8. Nadsącz należy całkowicie usunąć pipetą i pozwolić osadowi wyschnąć na powietrzu. Nie należy doprowadzić do nadmiernego wysuszenia osadu, ponieważ będzie on bardzo trudny do rozpuszczenia.
    9. Sondę RNA rozpuszcza się w 50 μl - 100 μl 1xTE lub DEPC-H2O. Pobiera się próbkę 1 μl do określenia procenta inkorporacji oraz do analizy na denaturującym żelu akrylamidowym. Stężenie sondy dostosowuje się do 100 ng/μl zgodnie z szacowaną wydajnością.
    10. Sondy, które przeszły wszystkie trzy kontrole jakości, mogą być następnie przechowywane w -20° C od 6 do 12 miesięcy. Zazwyczaj zużywamy zapas sond w ciągu 12 miesięcy. Bardzo prawdopodobne jest, że sondy mogą być przechowywane przez bardzo długie okresy w -20° C.
  3. Ocena jakości rybosondy - pomiar wydajności sondy.
    1. Aby oszacować wydajność sondy, należy podzielić liczbę zliczeń odzyskanych po kolumnie wirowej przez liczbę zliczeń w reakcji przed kolumną wirową (zmierzonych z próbek pobranych w protokole syntezy sondy). Dla tej reakcji 100% inkorporacji = 33 μg. Udana reakcja zazwyczaj daje wydajność 15-50%. Sondy z inkorporacją poniżej 15% (<5 μg wydajności) nie powinny być używane.
      Uwaga: Alternatywną metodą pomiaru wydajności sondy jest użycie spektrofotometru do małych objętości lub fluorometru w celu bezpośredniego zmierzenia ilości RNA obecnego po chromatografii kolumnowej. To alternatywne podejście pozwala uniknąć stosowania znakowania śladowego 32P. Mierzyliśmy stężenie rybosondy za pomocą spektrofotometru mikropłytek BioTek Epoch. Porównanie wartości uzyskanych ze spektrofotometru z szacunkami masy rybosondy z inkorporacji 32P wykazało, że obie metody dają porównywalne wyniki przy użyciu podobnej próbki o małej objętości (2 μl) z końcowego preparatu sondy.
      Prawie zawsze bardzo niska lub brak wydajności wynika z zanieczyszczenia RNazą pochodzącą z preparatu plazmidowego użytego jako matryca do PCR. Należy pamiętać o traktowaniu DNA plazmidowego i produktu PCR Proteinazą K, jak opisano w kroku 1.1.3.
  4. Ocena jakości rybosondy - pomiar aktywności swoistej.
    1. Aby zmierzyć stopień inkorporacji digoksygeniny-UTP, należy przeprowadzić test plamkowy (spot test). Jest to kluczowy test kontroli jakości.
      Stężenie sondy dostosowuje się do 100 ng/μl. Nanosimy 1 μl rozcieńczeń szeregowych (10-2 do 10-5) sondy na filtr nylonowy Hybond-N+ (GE Healthcare) lub inny równoważny filtr o średnicy 82 mm. Do kontroli negatywnej dołączamy próbkę nieznakowanego DNA. Wilgotny filtr należy natychmiast poddać sieciowaniu w sieciowniku UV przy 125 mJ lub zgodnie z instrukcjami producenta dla stosowanego filtra nylonowego.
      Wszystkie kolejne kroki (1.4.2 - 1.4.6) wykonuje się w szalce Petriego na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Po naniesieniu rozcieńczeń sondy na filtr nie trzeba obawiać się RNaz.
    2. Filtr blokuje się przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 10 ml 1% odczynnika blokującego (Roche) w 1X TN (bufor 10X TN = 1M Tris pH7,5, 1,5M NaCl)
    3. Przemywa 1 X 15 min w 10 ml buforu 1X TN.
    4. Inkubuje z fragmentem Fab przeciwko digoksygeninie w rozcieńczeniu 1/5000 w buforze 1X TN przez 30 minut.
    5. Przemywa 2 X 15 min w 10 ml buforu 1X TN.
    6. Reakcję barwną przeprowadza się z substratem BM purple (potrzeba około 5 ml w szalce). Kolor powinien być widoczny w plamce z rozcieńczenia 10-4 w ciągu 30 minut. W tym momencie reakcję barwną zatrzymuje się, przemywając 2 razy po 5 minut za pomocą 5X TE. Jeśli sygnał nie jest widoczny w plamce odpowiadającej rozcieńczeniu 10-4, sondę należy odrzucić.
      Uwaga: W naszym doświadczeniu nieadekwatna aktywność swoista występuje tylko w przypadku krótkich sond. Zwiększenie rozmiaru matrycy sondy (do 1kb) przy zachowaniu pozostałych kryteriów projektowych określonych w tym protokole powinno zwiększyć aktywność swoistą sondy. Niska aktywność swoista prowadzi do niskiego lub niewykrywalnego poziomu sygnału.
  5. Test integralności sondy poprzez elektroforezę w 5% denaturującym żelu akrylamidowym.
    Jest to kolejny ważny test kontroli jakości. Protokół ten zakłada, że sonda została znakowana 32P podczas reakcji syntezy (patrz krok 1.2.1). Stosujemy denaturujące żele akrylamidowe, aby zapewnić bardzo wysoką rozdzielczość, co pozwala nam łatwo wykryć zdegradowane lub niepełne sondy. Zazwyczaj 5% denaturujący minigel akrylamidowy (7,5g mocznika, 1,9ml 40% akrylamidu, 1,9ml 2% bis-akrylamidu (lub zastosowanie roztworów akrylamid:bis-akrylamid 20:1), 1,5ml 10X buforu żelowego MOPS (0,2 M kwas morfolinopropanosulfonowy, pH7,0, 50mM octanu sodu 5mM EDTA) i H2O do końcowej objętości 15 ml) sprawdza się bardzo dobrze w rozdzielaniu sond w zakresach rozmiarów stosowanych w tym protokole.
    Uwaga: Alternatywnie można zakupić gotowe żele TBE-mocznik od różnych dostawców. Należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi prowadzenia gotowych żeli.
    1. Próbkę miesza się z równą objętością buforu do nakładania na żel (Ambion) i dokładnie miesza.
    2. Ogrzewa do 95° C przez 5 minut, aby zdenaturować wszelkie struktury drugorzędowe.
    3. Natychmiast chłodzi na lodzie przed nałożeniem na żel, aby zapobiec ponownemu hybrydyzowaniu.
    4. Próbki przed i po kolumnie prowadzi się razem przy 200V, aż niebieski barwnik dotrze do końca żelu. Żel jest prowadzony w buforze żelowym 1X MOPS.
    5. Żel owija się folią spożywczą i naświetla na filmie rentgenowskim lub ekranie obrazowacza fosforowego, aby wykryć znakowane radioaktywnie RNA. Jeśli znakowanie 32P nie jest stosowane, żel można barwić konwencjonalnym barwnikiem fluorescencyjnym w celu wykrycia RNA.
    6. Udana synteza sondy skutkuje otrzymaniem sond RNA, która migruje jako ostry prążek bardzo blisko górnej krawędzi żelu.

2. Pobieranie i przechowywanie zarodków mysich

  1. Zarodki myszy należy zbierać do lodowatego roztworu PBST (PBS + 0,1% Tween 20, traktowany dietylopirokarbonianem (DEPC)) i przechowywać w lodzie podczas sekcji.
  2. Zarodki przetwarza się w szklanych fiolkach z nakrętką o pojemności 4 ml. W jednej fiolce można utrwalić kilka zarodków. W pojedynczej fiolce można utrwalić od 10 do 15 zarodków w stadium E9.5 lub 5 zarodków w stadium E10.5. Ze względu na zwiększający się rozmiar zarodka, zarodki w stadium E11.5 przed utrwaleniem należy przeciąć wzdłuż na pół za pomocą żyletek, aby ułatwić dostęp sondy podczas hybrydyzacji. W jednej fiolce można umieścić do 3 przeciętych zarodków E11.5.
  3. Aby zmaksymalizować skuteczność kroków w tym protokole i ograniczyć uszkodzenia zarodków, utrwalanie oraz wszystkie etapy płukania przeprowadza się w fiolkach z próbkami, wypełniając je roztworami do dolnej krawędzi szyjki fiolki, tak aby pozostał jedynie mały pęcherzyk powietrza, chyba że określono inaczej. Podczas wszystkich etapów płukania fiolki układa się poziomo na platformie kołyszącej.
  4. Utrwalać przez 6 godzin lub przez noc w temperaturze 4° C na platformie kołyszącej w 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBST. Fiolki należy umieścić poziomo i kołysać na platformie w temperaturze 4° C.
  5. Po utrwaleniu zarodki płucze się dwukrotnie po 5 minut w PBST w lodzie, a następnie odwadnia stopniowo w serii metanol/PBST (25% metanolu w PBST, 50% metanolu w PBST i 75% metanolu w PBST) aż do 100% metanolu, wymieniając roztwory w fiolce za pomocą szklanych pipet Pasteura. Zarodki można przechowywać w temperaturze -20C w 100% metanolu przez 8 miesięcy lub dłużej.

3. Hybrydyzacja sondy znakowanej digoksygeniną z całymi zarodkami myszy

  1. Nakłuć serca i głowy embrionów w stadium E10.5 i starszych za pomocą noża do mikrodysekcji, gdy embriony wciąż znajdują się w metanolu (jeśli nie wykonano tego podczas dysekcji). Ten prosty krok umożliwia przedostanie się roztworów płukania do pęcherzyków mózgowych i jam serca, co znacznie redukuje tło barwienia.
  2. Rehydratować embriony poprzez następujące płukania w serii metanol/PBST (75% metanol w PBST, 50% metanol w PBST, a następnie 25% metanol w PBST) przez 5-10 minut dla każdego stężenia metanolu. Płukać dwukrotnie po 5 minut w 100% PBST.
  3. Inkubować w mieszaninie 4:1 PBST: 30% H2O2 przez 1 godzinę w lodzie. Następnie płukać trzykrotnie po 5 minut w 1X PBST.
  4. Usunąć ostatni roztwór płuczący PBST i zastąpić go 1 ml proteinazy K w stężeniu 10 μg/ml w PBST. Podczas trawienia proteinazą K umieścić probówki pionowo w statywie w łaźni wodnej o temperaturze 25°C.
    Uwaga: Roztwory proteinazy K tracą aktywność w czasie na skutek autotrawienia. Aby zapewnić maksymalną i spójną aktywność, roztwór proteinazy K należy przygotować bezpośrednio przed każdym użyciem. Przy każdym użyciu przygotować niewielką ilość roztworu stokowego 1 mg/ml, a następnie go rozcieńczyć. Czas inkubacji należy określić dla każdej partii proszku proteinazy K i dla każdego wieku embrionów. Na przykład dla embrionów E9.5 odpowiedni czas to zazwyczaj 10-15 min w 25°C, natomiast dla E10.5 jest to zazwyczaj 20-30 min w 25°C. Czas inkubacji z proteinazą K powinien być również precyzyjnie mierzony podczas eksperymentów, aby umożliwić rzetelne porównania między fiolkami i eksperymentami. Podczas trawienia należy rygorystycznie utrzymywać temperaturę, aby zwiększyć powtarzalność. Różnice rzędu nawet 1°C mogą zmienić stopień trawienia między eksperymentami. Zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie trawienia proteinazą K w inkubatorze lub łaźni wodnej w celu dokładnej kontroli temperatury. Krok ten jest krytyczny dla umożliwienia penetracji tkanki przez sondę, co generuje silny sygnał. Jednak nadmierne trawienie uszkodzi embriony, które będą stopniowo ulegać rozpadowi w kolejnych krokach.
  5. Zatrzymać trawienie proteinazą K, płucząc dwukrotnie po 5 minut w temperaturze pokojowej świeżo przygotowaną glicyną 2 mg/ml w PBST. Następnie płukać dwukrotnie po 5 minut w PBST.
  6. Utrwalić trawione embriony przez 20 minut w temperaturze pokojowej w 4% PFA/PBST, 0,2% glutaraldehydu (Polysciences). Nie doprowadzić do nadmiernej ani niewystarczającej utrwalenia. Płukać 3 razy po 5 minut w PBST.
  7. Na tym etapie embriony należy podzielić na grupy do hybrydyzacji. Usunąć PBST. Dodać 1 ml buforu do hybrydyzacji (50% ultrapure formamide (Invitrogen), 5x SSC, pH 5, 1% SDS, 50 μg/ml heparyny (Acros), 50 μg/ml Torula RNA (Sigma)) podgrzanego do 65°C (bez sondy). Pozostawić embriony do osiadnięcia, następnie usunąć cały bufor do hybrydyzacji i zastąpić go 1 ml świeżego, podgrzanego buforu do hybrydyzacji bez sondy.
  8. Przeprowadzić prehybrydyzację przez 1 godzinę w 65°C w wstrząsającej łaźni wodnej lub w piecu na platformie kołyszącej (na przykład Boekle Shake 'n' Bake Oven, patrz Tabela 1). Jeśli inkubuje się fiolki w łaźni wodnej, należy upewnić się, że woda sięga do górnej krawędzi fiolek, ale ich nie zalewa. Temperaturę hybrydyzacji można zwiększyć do 70°C. Temperatury hybrydyzacji powyżej 65°C nie wpływają na intensywność sygnału ani tło w przypadku większości testowanych przez nas sond. W buforach z formamidem (np. w buforze do hybrydyzacji) embriony stają się półprzezroczyste, lepkie i kruche, dlatego należy zachować ostrożność podczas manipulowania nimi.
  9. Zastąpić bufor do prehybrydyzacji 0,4 ml buforu do hybrydyzacji zawierającego sondę w stężeniu 0,25-1 μg/ml. Dla embrionów do stadium około E8.5 stosować sondę w stężeniu 0,5 μg/ml. W przypadku starszych embrionów należy przeprowadzić miareczkowanie sondy w zakresie 1-0,1 μg/ml, aby określić optymalne stężenie zapewniające dobry sygnał przy niskim tle (zazwyczaj około 0,25-0,5 μg/ml). Należy pamiętać, że dla większych embrionów mogą być konieczne większe objętości buforu do hybrydyzacji. Hybrydyzować przez noc w 65°C.
  10. Jeśli embriony zostały poddane zbyt intensywnemu działaniu proteinazy K, będą wyglądać na ekstremalnie przezroczyste. Mogą one również przyklejać się do ścianek fiolki lub rozpadać się. Embriony, które tak wyglądają, należy odrzucić na tym etapie protokołu. Dalsza obróbka nie przyniesie interpretowalnych danych.
  11. Zastąpić bufor do hybrydyzacji podgrzanym Roztworem I (50% formamid, 5x SSC pH 5, 1% SDS) w 70°C. Płukać dwukrotnie po 30 minut dla embrionów E8.5 oraz trzykrotnie po 30 minut dla embrionów E9.5 i starszych.
  12. Płukać raz przez 10 minut w 70°C w podgrzanym roztworze: 50% Roztworu I : 50% Roztworu II (0,5M NaCl, 10mM Tris HCl pH 7.5, 0,1% Tween 20).
  13. Płukać trzykrotnie po 5 minut Roztworem II w temperaturze pokojowej.
  14. Zastąpić bufor Roztworem II zawierającym RNazę A 100 μg/ml i RNazę T1 100 jednostek/ml. Inkubować na kołysarce w ciepłym pomieszczeniu w 37°C dwukrotnie po 30 minut na każde płukanie. Płukanie RNazą jest niezbędne do redukcji tła wynikającego z niespecyficznie zhybrydyzowanych sond.
  15. Płukać w Roztworze III (50% formamid, 2x SSC pH 5) w 65°C dwukrotnie po 30 minut dla E8.5 oraz 3 razy po 30 minut dla E9.5 i starszych.
  16. Płukać 3 razy po 5 minut w 1X TBST (100 ml 10X TBS zawiera 8g NaCl, 0,2g KCl, 12,5ml 2M Tris HCl pH 7,6 w wodzie. Aby przygotować 1X TBST, rozcieńczyć 10X TBS w odpowiedniej objętości wody i dodać Tween 20 do końcowego stężenia 0,1%).
  17. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie płukania wykonuje się w fiolkach z próbkami, wypełniając roztwory do dolnej krawędzi szyjki fiolki. Podczas wszystkich etapów płukania fiolki układa się poziomo na platformie kołyszącej.

4. Detekcja przeciwciałem sondy znakowanej digoksigeniną

  1. Zarodki poddaje się blokowaniu wstępnemu w 0,5 ml 1X TBST + 10% obróbce termicznej surowicy owczej. Następnie probówki kołysze się pionowo w temperaturze pokojowej (˜ 20°C) przez co najmniej 2,5 h.
  2. Roztwór blokujący zastępuje się świeżym roztworem 1X TBST + 10% surowicy zawierającym rozcieńczenie 1:2000 - 1:5000 fragmentów Fab przeciwciał owczych anty-digoksigenin sprzężonych z fosfatazą alkaliczną (oczyszczonych poprzez inkubację z proszkiem z acetonu z zarodków, patrz poniżej). W przypadku zarodków E9.5 i starszych należy stosować większe rozcieńczenia, aż do 1:5000, aby zminimalizować tło. Inkubować pionowo na kołysarce w temperaturze 4°C przez noc.
    Uwaga: Stwierdzono, że inkubacja fragmentów Fab anty-digoksigenin z proszkiem z acetonu z zarodków zmniejsza poziom barwienia tła w tym protokole. Aby przygotować proszek z acetonu z zarodków, należy zhomogenizować połączone zarodki mysie E12.5-14.5 w minimalnej objętości PBS. Dodać 4 objętości lodowatego acetonu, wymieszać i inkubować na lodzie przez 30 minut. Usunąć nadsącz poprzez wirowanie przy 10 000×g przez 10 minut. Przemyć osad lodowatym acetonem i ponownie zawirować. Rozłożyć osad i rozetrzeć na proszek na arkuszu papieru filtracyjnego, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Proszek można przechowywać w szczelnym probówce w temperaturze 4°C przez lata.
    W celu subtrakcji przeciwciał, przeciwciała powinny zostać uprzednio zaabsorbowane na proszku z acetonu z zarodków, aby zmniejszyć nieswoiste wiązanie podczas lub przed blokowaniem wstępnym. Inkubować przeciwciała w rozcieńczeniu 1/100 z niewielką ilością proszku z zarodków (ilość nie jest krytyczna) w 1xTBST/10% surowicy przez co najmniej 1 h w temperaturze 4°C podczas kołysania. Usunąć proszek poprzez wirowanie w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze 4°C. Oczyszczone przeciwciała można przechowywać w temperaturze 4°C przez co najmniej 6 miesięcy.
  3. Przemyć trzy razy przez 5 minut każde w 1X TBST, a następnie 5-6 razy przez 1 h każde w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar przeciwciał. W razie potrzeby można przeprowadzić przedłużone płukanie przez noc w temperaturze 4°C w celu zmniejszenia tła. Płukanie przez noc może drastycznie obniżyć poziom tła, zwiększając tym samym stosunek sygnału do szumu.
  4. Przemyć dwukrotnie po 20 minut na każde płukanie świeżo przygotowanym buforem do fosfatazy alkalicznej (100mM Tris, pH 9,5, 50mM MgCl2, 100mM NaCl, 0,1% Tween 20. Dla zarodków E9.5 i starszych dodać 0,5mg/ml lewamisolu, inhibitora endogennej AP).
  5. Ostatnie płukanie zastąpić podłożem BM Purple AP (Roche) uprzednio ogrzanym do temperatury pokojowej.
  6. Pozostawić reakcję barwną do inkubacji w temperaturze pokojowej i okresowo obserwować sygnał za pomocą mikroskopu stereoskopowego. W przypadku przedłużonych reakcji barwnych (od kilku godzin do całej nocy) probówki powinny być chronione przed światłem. Sygnał dla obfitych mRNA powinien być widoczny w ciągu 15 minut. Reakcje należy zatrzymać, gdy osiągnięty zostanie satysfakcjonujący sygnał lub gdy tło zacznie stanowić problem. Jeśli sam roztwór zacznie ciemnieć, można przedłużyć reakcję barwną poprzez wymianę roztworu podłoża.
  7. Zatrzymać reakcję, płucząc dwukrotnie po 5 minut w 1X PBST/5mM EDTA.
  8. Przenieść do 4% paraformaldehydu/PBST w celu ponownej fiksacji, od kilku godzin do całej nocy. Zarodki można również przechowywać w 4% paraformaldehydzie/1X PBST przez lata lub natychmiast poddać obróbce w celu wykonania skrawków. Ten końcowy etap fiksacji jest kluczowy dla długoterminowej konserwacji wzoru barwienia.

5. Zatapianie w parafinie i krojenie barwionych embrionów

  1. Przed utrwaleniem zarodków po reakcji barwnej (krok 4.8) należy wykonać zdjęcia całych barwionych zarodków, gdy poziom zabarwienia osiągnie pożądaną intensywność. Po udokumentowaniu wzorców ekspresji w całych zarodkach, inkubuje się je w podłożu BM purple przez okres od jednej nocy do 24 godzin w temperaturze pokojowej, aż cały zarodek stanie się ciemnoniebieski. Krok ten ma na celu zapewnienie, aby zabarwienie było wystarczająco ciemne, by było widoczne w przekrojach tkankowych. Należy pamiętać, że niebieski kolor zarodka wynika z osadzenia bardzo cienkiej warstwy pigmentu na całej powierzchni zarodka. To zabarwienie tła nie będzie wykrywalne w obrębie badanej tkanki po wykonaniu skrawków.
  2. Przemyć zabarwione zarodki trzy razy w PBS, aby usunąć nadmiar osadów podłoża, a następnie utrwalić przez noc w 4% PFA w temperaturze 4°C.
  3. Przemyć trzy razy w PBS, a następnie odwodnić zarodki w 100% metanolu (zgodnie z opisem w punkcie 2.4).
  4. Zastąpić ostatnią porcję metanolu ksylenem. Przemywać w ksylenie od 2 do 3 razy przez 2 min podczas każdego płukania, aż zarodki staną się przejrzyste. Nie należy zbyt długo płukać w ksylenie, ponieważ sprawi to, że tkanka po zatopieniu stanie się bardzo krucha, co znacznie utrudni odzyskanie nienaruszonych skrawków. Należy wizualnie monitorować każdą inkubację w ksylenie, aby upewnić się, że zarodki osiągnęły stopień przejrzystości w odpowiednim momencie, i bardzo uważać, aby nie przedłużać inkubacji w ksylenie ponad ten punkt.
  5. Przenieść zarodki (E10.5 i starsze) do kaset Biopsy Sure-Tek (Fisherbrand) i inkubować całą kasetę w wosku (Fisherbrand) przez 15˜30 min w temperaturze 65°C. Wymienić na świeży wosk na kolejne 15˜30 min, a następnie wymienić go ponownie. Mniejsze zarodki/fragmenty tkanek wymagają krótszego czasu inkubacji w wosku. Zarodki E9.5 można umieszczać w formach do zatapiania tkanek podczas wszystkich wymian wosku. W takich przypadkach wosk można usuwać z formy zamiast przenosić zarodki.
  6. Po trzech wymianach wosku przenieść zarodki do form do zatapiania tkanek (Polysciences) i zatopić w świeżym wosku. Ostrożnie ustawić zarodki w pożądanej płaszczyźnie cięcia. Pozostawić wosk do ostygnięcia i zestalenia.
  7. Wyciąć bloki woskowe w plastry o grubości 8˜14μm przy użyciu standardowego mikrotomu (np. Leica RM2155). Zebrać skrawki na szkiełka przedmiotowe (Fisherbrand).
  8. Pozostawić szkiełka płasko i wysuszyć na suszarce do szkiełek. Szkiełka można przechowywać w temperaturze 4°C przez wiele miesięcy.
  9. Wysuszone skrawki odparafinować poprzez dwa 5-minutowe płukania w ksylenie, a następnie nawodnić do wody poprzez seryjne płukania w metanolu i wodzie (100% metanol 2 min, 100% metanol 2 min, 90% metanol/woda 2min, 70% metanol/woda 2min, woda dejonizowana 5 min).
  10. Zabarwić skrawki roztworem barwiącym nuclear fast red (Sigma) przez 1 minutę. Aby przygotować roztwór barwiący nuclear fast red, należy rozcieńczyć stężony roztwór zapasowy nuclear fast red (0,1% nuclear fast red w 5% siarczanie glinu w wodzie, rozpuścić pod wpływem ciepła i przefiltrować przez papier filtracyjny Whatman) w stosunku 1:5 w wodnym roztworze 5% siarczanu glinu. Po barwieniu przemyć szkiełka pod bieżącą wodą, aż woda stanie się przejrzysta. Nuclear fast red służy jako barwnik kontrastowy i ujawnia ogólną strukturę tkanki w skrawkach. Jego kolor dobrze kontrastuje z fioletowo-niebieskim zabarwieniem wyznaczającym lokalizację sondy RNA. Nuclear fast red jest barwnikiem nasycającym, a intensywność barwienia jest kontrolowana przez stężenie roztworu barwiącego. Jeśli intensywność barwienia nuclear fast red jest niewystarczająca przy użyciu tego roztworu, można powtórzyć ten krok z bardziej stężonym roztworem nuclear fast red.
  11. Przygotować szkiełka do nakładania szkiełek cover-slip poprzez płukanie w kolejnych roztworach z następującej serii: 90% metanol/woda, następnie 2 płukania w 100% metanolu, a następnie 2 płukania w ksylenach. Inkubować szkiełko przez 2 minuty w każdym z płukania.
  12. Zamontować szkiełka za pomocą medium montażowego Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific). Należy pamiętać, że wodne media montażowe rozpuszczą barwnik nuclear fast red.
    Uwaga: użyliśmy również plastikowej żywicy do zatapiania (Immuno-Bed, Polysciences Inc) do przygotowania skrawków z zabarwionych zarodków, uzyskując doskonałe wyniki 4.

6. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu tego protokołu. Rysunek 1A pokazuje wzór ekspresji Gata3 w embrionach myszy w stadium E10.5. Panel ten ilustruje prawidłowy wynik z wysokim stosunkiem sygnału do tła. Rysunek 1C przedstawia natomiast nieudaną hybrydyzację in situ mRNA Gata3, w której użyto częściowo zdegradowanej sondy RNA. Sonda o niskiej aktywności swoistej doprowadzi do podobnych wyników z niskim kontrastem sygnału do tła. Porównanie paneli A i C obrazuje znaczenie przeprowadzania dokładnej kontroli jakości sondy w celu zapewnienia wysokiej jakości wyników. Wynik uzyskany przy użyciu sondy Foxg1 (Rysunek 1B) również stanowi przykład prawidłowego wyniku ze swoistym barwieniem w telencefalonie i niskim tłem w innych częściach mózgu. Mózg i serce są częstymi miejscami barwienia tła spowodowanego uwięzieniem sondy. Przebicie mózgu i serca pęsetą umożliwia przedostanie się roztworów płuczących do wnętrza embrionu i minimalizuje barwienie tła (patrz krok 3.1). Rysunek 1D ilustruje typowe jasnoniebieskie tło występujące, gdy mózg nie został przebity. Przedstawia to suboptymalny wynik uzyskany przy użyciu sondy Pax1. Pax1 nie wykazuje ekspresji w żadnej części mózgu, a całe barwienie widoczne w mózgu tego embrionu wynika z nieswoistego tła.

Ekspresja genów w zarodku: schematy przedstawiające barwienie na Gata3, Foxg1 i Pax1 w etapach rozwojowych.
Rycina 1. Reprezentatywne wyniki przedstawiające przykłady rezultatów prawidłowych (A, B) oraz suboptymalnych (C, D). A. Zarodek E10.5 hybrydyzowany z sondą Gata3. B. Zarodek E11.5 hybrydyzowany z sondą Foxg1. C. Zarodek E10.5 hybrydyzowany z częściowo zdegradowaną sondą Gata3, wykazujący bardzo słaby sygnał przy wysokim tle w całym zarodku. D. Zarodek E10.5 hybrydyzowany z sondą Pax1 bez nakłuwania głowy, wykazujący barwienie tła w komorach mózgu (groty strzałek).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metody opisane w niniejszym protokole zostały zaadaptowane z kilku różnych źródeł i zoptymalizowane dla całych zarodków myszy w wieku od E8.5 do E11.5. Metody hybrydyzacji in situ w całych zarodkach kręgowców pojawiły się po raz pierwszy na początku lat 90. 2,5-12. Niniejszy protokół został opracowany głównie na podstawie metod stworzonych dla zarodków Xenopus 7,8, a także myszy 2,11. W naszym protokole położono duży nacisk na staranną ocenę jakości sondy. Przywiązanie uwagi do w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty NIH R21MH082360 (BGC) i R01HD056315 (NRM) a także przez University of Georgia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Digoksigenina-11-urydyna-5’-trifosforanOdczynnikRoche Group11209256910
Zestaw rybonukleozydów trifosforanowychOdczynnikRoche Group11277057001
Kolumny do szybkiego wirowania do oczyszczania RNA znakowanego promieniotwórczoMateriałyRoche Group11274015001
Polimeraza RNA T7OdczynnikRoche Group10881767001
Polimeraza RNA SP6OdczynnikRoche Group10810274001
Polimeraza RNA T3OdczynnikRoche Group11031163001
CTP, [α-32P]- 800Ci/mmol 10mCi/ml , 250 μCiOdczynnikPerkinElmer, Inc.BLU008X250UC
Rekombinowana DNaza I, wolna od RNazOdczynnikRoche Group4716728001
Mocznik, bezbarwne lub białe kryształy lub proszek krystalicznyOdczynnikFisher ScientificBP169-500
Bufor do nakładania żeluOdczynnikAmbionAM8547
Hybond-N+, AmershamMateriałyGE HealthcareRPN82B
UV Stratalinker 2400SprzętStratagene, Agilent Technologies
Węglan diethylopirokarbonianuOdczynnikSigma-AldrichD5758-100ML
Heparyna sodowaOdczynnikAcros Organics41121-0010
Nadtlenek wodoru 30% w wodzieOdczynnikFisher ScientificBP2633-500
Glutaraldehyd, 8% stopnia EMOdczynnikPolysciences, Inc.0/710Stosować ostrożnie zgodnie z instrukcjami producenta’
Odczynnik blokującyOdczynnikRoche Group11096176001Przygotować stężenie zapasowe 5% i przechowywać w -20° C
Proteinaza KOdczynnikRoche Group3115852001
RNaza AOdczynnikRoche Group10109142001Przygotować roztwór zapasowy 10 mg/ml i przechowywać w -20° C.
RNaza T1OdczynnikRoche Group10109193001
Ultrapure FormamideOdczynnikInvitrogen15515-026
Wodorochlorek lewamisoluOdczynnikICN Biomedicals155228
Kwas rybonukleowy z drożdży torula, typ VIOdczynnikSigma-AldrichR6625wielokrotnie ekstrahowany fenolem/chloroformem i wytrącony, resuspenderowany w DEPC-dH2O i przechowywany w -20° C
Fragmenty Fab przeciwciał anty-digoksigenina-APOdczynnikRoche Group11093274910
BM Purple AP Substrate, precypitujący. Roztwór gotowy do użycia.OdczynnikRoche Group11 442 074 001
Zestaw wygodnych probówek do przechowywania 4ml, przeźroczyste, zamknięta góraMateriałyNational Scientific CompanyB7800-2
Piec do hybrydyzacji Shake N BakeSprzętBoekel Scientific136400
Biopsy Sure-TekMateriałyFisher Scientific15-200-402C
Paraplast Plus medium do zatapiania tkanekOdczynnikFisher Scientific23-021-400
Jednorazowe plastikowe formy do zatapiania tkanek typu Peel-A-WayMateriałyPolysciences, Inc.18646A
Szkiełka mikroskopowe Colorfrost PlusMateriałyFisher Scientific12-550-17
Nuclear Fast RedOdczynnikSigma-AldrichN8002
Cytoseal 60OdczynnikRichard-Allan Scientific8310-16

Bibliografia

  1. Divjak, M., Glare, E. M., Walters, E. H. Improvement of non-radioactive in situ hybridization in human airway tissues: use of PCR-generated templates for synthesis of probes and an antibody sandwich technique for detection of hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 541-548 (2002).
  2. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  3. Logel, J., Dill, D., Leonard, S. Synthesis of cRNA probes from PCR-generated DNA. Biotechniques. 13, 604-610 (1992).
  4. Maddox, D. M., Condie, B. G. Dynamic expression of a glutamate decarboxylase gene in multiple non-neural tissues during mouse development. BMC Dev Biol. 1, 1-1 (2001).
  5. Conlon, R. A., Rossant, J. Exogenous retinoic acid rapidly induces anterior ectopic expression of murine Hox-2 genes in vivo. Development. 116, 357-368 (1992).
  6. Krauss, S. Zebrafish pax[zf-a]: a paired box-containing gene expressed in the neural tube. EMBO J. 10, 3609-3619 (1991).
  7. Hemmati-Brivanlou, A. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110, 325-330 (1990).
  8. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  9. Herrmann, B. G. Expression pattern of the Brachyury gene in whole-mount TWis/TWis mutant embryos. Development. 113, 913-917 (1991).
  10. Conlon, R. A., Herrmann, B. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to postimplantation embryo whole mounts. Methods Enzymol. 225, 373-383 (1993).
  11. Parr, B. A., Shea, M. J., Vassileva, G., McMahon, A. P. Mouse Wnt genes exhibit discrete domains of expression in the early embryonic CNS and limb buds. Development. 119, 247-261 (1993).
  12. Rosen, B., Beddington, R. S. Whole-mount in situ hybridization in the mouse embryo: gene expression in three dimensions. Trends Genet. 9, 162-167 (1993).
  13. Quiring, R. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  14. Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
  15. Neidhardt, L. Large-scale screen for genes controlling mammalian embryogenesis, using high-throughput gene expression analysis in mouse embryos. Mech. Dev. 98, 77-94 (2000).
  16. Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal. 103, 141-143 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja genów w embrionach myszysonda RNA znakowana DIGkontrola jakości sondytrawienie proteinazą Kwarunki hybrydyzacjidetekcja za pomocą fosfatazy alkalicznejutrwalanie i przechowywanie embrionówsubstrat BM Purpleprzemycia z traktowaniem RNazą
Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.